Produzione a ultrasuoni di beta-glucani di schizofillano altamente purificati

Schizophyallan è un β-glucano fungino con proprietà immunomodulatrici. Per esercitare effetti medicinali altamente attivi, lo schizofillano deve avere un basso peso molecolare, così da mostrare una migliore biodisponibilità. È stato dimostrato che la sonicazione a ultrasuoni riduce il peso molecolare dello schizofillano. Essendo un metodo affidabile ed efficace, la sonicazione può essere facilmente applicata alla produzione di schizofillano a basso peso molecolare.

Funghi Schizophyllum ed estrazione dei beta-glucani a ultrasuoni

Le specie di funghi Schizophyllum crescono in natura sugli alberi in decomposizione dopo le stagioni delle piogge. I corpi fruttiferi vengono raccolti nella successiva stagione secca. Le specie di Schizophyllum sono ricche di composti biochimici come i glucani e vengono pertanto consumate, soprattutto nei paesi tropicali, come alimento e medicinale. Grazie alle sue proprietà immunomodulatrici, antifungine, antineoplastiche e antivirali, Schizophyllum commune, noto anche come fungo a lamelle divise, ha attirato l’interesse delle aziende biotecnologiche e farmaceutiche.
Il polisaccaride schizofillano, noto anche come sizofiran, sonifilan o sizofilan, è il principale β-glucano presente nei funghi Schizophyllum, che forniscono lo schizofillano, un β-glucano bioattivo altamente efficace.
I funghi Schizophyllum commune crescono in natura sugli alberi; il micelio può anche essere coltivato in brodo di fermentazione. Per le applicazioni farmaceutiche e cosmetiche, lo schizofillano a basso peso molecolare è molto più efficace di quello ad alto peso molecolare. Ciò è dovuto al fatto che lo schizofillano a basso peso molecolare presenta una biodisponibilità e tassi di assorbimento significativamente migliori. Inoltre, lo schizofillano ad alto peso molecolare è spesso problematico nelle applicazioni, poiché determina un’elevata viscosità delle sue soluzioni acquose.
La riduzione dimensionale a ultrasuoni è una tecnica altamente efficace e affidabile per abbassare il peso molecolare dello schizofillano, aumentando così la qualità della molecola di β-glucano.

Protocollo per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare

Poiché lo schizofillano di peso molecolare mostra una biodisponibilità e proprietà applicative nettamente migliori, il gruppo di ricerca di Smirnou ha studiato la sonicazione a ultrasuoni per la scissione e la riduzione dimensionale della molecola di β-glucano schizofillano.

Sonicazione a ultrasuoni dello schizofillano

Lo schizofillano (SPG), un β-1.3(1.6)-glucano, è stato prodotto mediante coltivazione sommersa del fungo S. commune in un bioreattore, utilizzando saccarosio come substrato.
Al termine della coltivazione, il brodo di coltura è stato diluito con acqua demineralizzata fino a una concentrazione di schizofillano di 2 g/L e sottoposto a sonicazione con il processore a ultrasuoni UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) in modalità di ricircolo, con i seguenti parametri e condizioni: portata del mezzo 50 mL/s, frequenza 20 kHz, potenza in uscita 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, booster tipo B2-1.4 e ampiezza 100%. La temperatura del brodo di coltura all’inizio della sonicazione era di 25°C. Il brodo di coltura sottoposto a sonicazione (apporto energetico specifico 100 Ws/mL) è stato filtrato attraverso un filtro di profondità Seitz HS800 alla pressione di 1,5 bar e a 40°C. Lo schizofillano sottoposto a sonicazione (uSPG) destinato alla caratterizzazione chimica è stato precipitato dal filtrato con una quantità tripla di alcol isopropilico alla temperatura di laboratorio ed essiccato a 60°C per 12h. Le soluzioni di uSPG per gli studi immunologici sono state preparate come segue: (1) il filtrato del brodo di coltura sottoposto a sonicazione è stato diafiltrato attraverso una cassetta PES Pall Centramate serie T da 0,1m2 (cut-off 100 kDa) a 0,8 bar e la diafiltrazione è proseguita fino a quando la conducibilità del retentato ha raggiunto 20 μS/cm; (2) la soluzione è stata concentrata mediante diafiltrazione fino a una concentrazione di uSPG di 1 g/L e sterilizzata in autoclave a 120°C/20 min. L’uSPG denaturato è stato preparato in modo analogo, con la differenza che al filtrato del brodo di coltura è stato aggiunto NaOH a una concentrazione di 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 min alla temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Metodi analitici

La resa del micelio è stata stimata gravimetricamente: il brodo di coltura è stato diluito con acqua in rapporto 1:4 e centrifugato a 10.000 × g a 25°C per 20 min; il precipitato è stato lavato con una quantità tripla di acqua, essiccato a 60°C e pesato. Lo schizofillano è stato precipitato dal surnatante con una quantità tripla di alcol isopropilico, essiccato a 60°C per 24h e la sua resa è stata determinata gravimetricamente. La pO2 nel brodo di coltura è stata misurata mediante la sonda ottica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Svizzera).
La viscosità dinamica del brodo di coltura è stata misurata con HAAKE Visco Tester 6L, utilizzando i rotori 1L e 2L a 4°C e una velocità di rotazione di 30 rpm. La velocità di filtrazione è stata calcolata in base al tempo necessario per filtrare 500 mL di brodo di coltura attraverso un filtro di profondità Seitz HS800 da 200 × 200 mm (Pall, USA) alla pressione di 1,5 bar e a 40°C.
Il peso molecolare dell’uSPG è stato misurato mediante SEC-MALLS su un sistema HPLC Alliance (Waters) con colonne PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 collegate in serie, e il rivelatore miniDAWN TREOS (Wyatt) è stato concentrato mediante diafiltrazione fino a una concentrazione di uSPG di 1 g/L e sterilizzato in autoclave a 120°C/20 min. L’uSPG denaturato è stato preparato in modo analogo, con la differenza che al filtrato del brodo di coltura è stato aggiunto NaOH a una concentrazione di 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 min alla temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Risultati:
Il trattamento di sonicazione a ultrasuoni è stato applicato direttamente al brodo di coltura di S. commune dopo 144-h di coltivazione, contenente micelio, per facilitare le lavorazioni a valle dell’SPG.
 
Caratteristiche dello schizofillano sottoposto a sonicazione: Lo schizofillano sottoposto a sonicazione (uSPG) è stato precipitato con alcol dal filtrato del brodo di coltura e caratterizzato. La SEC-MALLS ha stimato il Mw dell’uSPG intorno a 1 MDa. Il peso molecolare medio dello schizofillano ottenuto dalla fermentazione liquida è di circa 5 MDa, mentre nella coltivazione allo stato solido può raggiungere 10 MDa. Confrontando il peso molecolare dello schizofillano sottoposto a sonicazione con i pesi molecolari dello schizofillano nativo non trattato, si può osservare una riduzione del peso molecolare da 5 a 10 volte dovuta alla sonicazione a ultrasuoni.
Il polisaccaride uSPG sottoposto a sonicazione conteneva 0,7%w/w di proteine e 1,0%w/w di residuo dopo incenerimento. L’idrolizzato di uSPG era costituito da glucosio per oltre il 99%. I risultati analitici indicano che la sonicazione scinde in modo casuale la catena principale del β-glucano, mentre le ramificazioni laterali rimangono intatte, riducendo così le dimensioni e il peso molecolare dello schizofillano. Gli studi immunologici sull’uSPG sostanzialmente privo di proteine ed endotossine hanno mostrato che lo schizofillano a basso Mw sottoposto a sonicazione presenta una spiccata attività immunomodulatrice.

 
Viscosità ridotta: La sonicazione a ultrasuoni ha determinato una diminuzione significativa della viscosità del brodo di coltura. Durante la sonicazione a ultrasuoni, la viscosità del brodo di coltura è cambiata in modo non lineare: la diminuzione della viscosità è stata rapida all’inizio della sonicazione, ma successivamente è rallentata. Un apporto energetico specifico di 100 Ws/mL è stato sufficiente per ridurre la viscosità del brodo di coltura di quasi 7 volte.

Filtrazione migliorata: Il brodo di coltura trattato con ultrasuoni è passato attraverso il filtro più rapidamente del brodo di coltura non trattato (apporto energetico specifico 0 Ws/mL) contenente SPG ad alto peso molecolare. Inoltre, la sonicazione a ultrasuoni ha ridotto significativamente la perdita di prodotto durante la filtrazione. Il filtrato del brodo di coltura non trattato con SPG ad alto peso molecolare (apporto energetico specifico 0 Ws/mL) conteneva 0,3 ± 0,07 g/L di SPG, mentre la concentrazione di SPG prima della filtrazione in profondità era di 2 g/L. Al contrario, il filtrato del brodo di coltura sottoposto a sonicazione con 100 Ws/mL conteneva SPG a una concentrazione di 2,2 ± 0,2 g/L, che corrisponde a una perdita di prodotto quasi nulla.

Conclusione: Nelle conclusioni, il gruppo di ricerca riepiloga che il trattamento a ultrasuoni è una tecnologia efficiente per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare, che può poi essere utilizzato in cosmetica e medicina. La sonicazione a ultrasuoni, quando viene applicata all’intero brodo di coltura contenente micelio, offre alcuni vantaggi per la produzione di schizofillano. Riduce le perdite di prodotto durante le lavorazioni a valle e rende possibile la produzione di polisaccaride altamente purificato grazie all’utilizzo efficiente dell’ultrafiltrazione.
Inoltre, i ricercatori hanno riscontrato che il trattamento a ultrasuoni dello schizofillano è facilmente scalabile. Un’unità del disgregatore a ultrasuoni UIP2000hdT dell’impianto pilota ha trattato 1 litro di brodo di coltura in 110 s in modalità a flusso. La produttività del sistema può essere facilmente aumentata collegando in sequenza ulteriori unità a ultrasuoni.

 
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