Produzione a ultrasuoni di beta-glucani schizofillani altamente purificati

Lo schizofillano è un β-glucano fungino con proprietà immunomodulanti. Per ottenere effetti medicinali altamente attivi, lo schizofillano deve avere un basso peso molecolare per mostrare una migliore biodisponibilità. È stato dimostrato che gli ultrasuoni riducono il peso molecolare della schizofillana. Come metodo affidabile ed efficace, la sonicazione può essere facilmente applicata per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare.

Funghi Schizophyllum ed estrazione ultrasonica di beta-glucano

Le specie di funghi Schizophyllum crescono in natura su alberi in decomposizione dopo le stagioni delle piogge. I corpi fruttiferi vengono raccolti nella successiva stagione secca. Le specie di Schizophyllum sono ricche di composti biochimici come i glucani e sono quindi consumate soprattutto nei Paesi tropicali come cibo e medicina. Grazie alle sue proprietà immunomodulanti, antimicotiche, antineoplastiche e antivirali, lo Schizophyllum commune, noto anche come fungo di Splitgill, ha attirato le aziende biotecnologiche e farmaceutiche.
Il polisaccaride schizofillano, noto anche come sizofiran, sonifilan o sizofilan, è il principale β-glucano presente nei funghi Schizophyllum, che offrono il β-glucano schizofillano altamente efficace e bioattivo.
I funghi Schizophyllum commune crescono in natura sugli alberi, il micelio può anche essere coltivato in brodo di fermentazione. Per le applicazioni farmaceutiche e cosmetiche, lo schizofillano a basso peso molecolare è molto più efficace di quello ad alto peso molecolare. Ciò è dovuto al fatto che lo schizofillano a basso peso molecolare mostra una biodisponibilità e un tasso di assorbimento significativamente migliori. Inoltre, lo schizofillano ad alto peso molecolare è spesso problematico nelle applicazioni, poiché comporta un'elevata viscosità delle soluzioni acquose.
La riduzione dimensionale a ultrasuoni è una tecnica altamente efficace e affidabile per ridurre il peso molecolare della schizofillana, aumentando così la qualità della molecola di β-glucano.

Protocollo per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare

Poiché la schizofillana a peso molecolare dimostra una biodisponibilità e proprietà applicative drasticamente migliori, il team di ricerca di Smirnou ha studiato gli ultrasuoni per la scissione e la riduzione delle dimensioni della molecola di β-glucano schizofillano.

Ultrasuoni di Schizofillano

Il β-1,3(1,6)-glucano schizofillano (SPG) è stato prodotto dalla coltivazione sommersa del fungo S. commune in un bioreattore utilizzando come substrato il saccarosio.
Al termine della coltura, il brodo di coltura è stato diluito con acqua demineralizzata fino alla concentrazione di schizofillina di 2 g/L e sottoposto a ultrasuoni con il processore a ultrasuoni UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, Germania) in modalità di riciclo con i seguenti parametri e condizioni: flusso del mezzo 50 mL/s, frequenza 20 kHz, potenza 2000 W, sonotrodo tipo BS2d22, booster tipo B2-1.4 e ampiezza 100%. La temperatura del brodo di coltura all'inizio della sonicazione era di 25°C. Il brodo di coltura sottoposto a ultrasuoni (energia specifica assorbita 100 W/mL) è stato filtrato attraverso un filtro di profondità Seitz HS800 a 40°C sotto una pressione di 1,5 bar. La schizofillina ultrasonica (uSPG) per la caratterizzazione chimica è stata precipitata dal filtrato con una quantità tripla di alcool isopropilico a temperatura di laboratorio e asciugata a 60°C per 12h Le soluzioni di uSPG per gli studi immunologici sono state preparate come segue: (1) il filtrato del brodo di coltura sottoposto a ultrasuoni è stato diafiltrato attraverso una cassetta Pall Centramate T-series PES da 0,1 m2 (cut-off 100 kDa) a 0,8 bar e la diafiltrazione è proseguita fino a quando la conducibilità del retentato è stata di 20 μS/cm; (2) la soluzione è stata concentrata per diafiltrazione fino a raggiungere una concentrazione di uSPG di 1 g/L e sterilizzata in autoclave a 120°C/20 min. L'uSPG denaturato è stato preparato in modo simile, con la differenza che NaOH è stato aggiunto al filtrato del brodo di coltura in concentrazione 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 minuti a temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Metodi analitici

La resa del micelio è stata stimata gravimetricamente: il brodo di coltura è stato diluito con acqua 1:4, centrifugato a 10000 × g a 25°C per 20 minuti, il precipitato è stato lavato con una quantità tripla di acqua, essiccato a 60°C e pesato. La schizofillina è stata precipitata dal surnatante con una quantità tripla di alcol isopropilico, essiccata a 60°C per 24 ore e la sua resa è stata determinata gravimetricamente. La pO2 nel brodo di coltura è stata misurata con la sonda ottica Hamilton-Visiferm DO 120 (Hamilton, Svizzera).
La viscosità dinamica del brodo di coltura è stata misurata su HAAKE Visco Tester 6L con mandrini 1L e 2L a 4°C e velocità di rotazione di 30 rpm. La velocità di filtrazione è stata calcolata in base al tempo di filtrazione di 500 mL di brodo di coltura attraverso il filtro di profondità Seitz HS800 (Pall, USA) da 200 × 200 mm a 1,5 bar di pressione e 40°C.
Il peso molecolare dell'uSPG è stato misurato mediante SEC-MALLS su sistema HPLC Alliance (Waters) con colonne PL aquagel OH60 e PL aquagel OH40 collegate in serie, e rivelatore miniDAWN TREOS (Wyatt) è stato concentrato per diafiltrazione fino alla concentrazione di uSPG di 1 g/L e sterilizzato in autoclave a 120°C/20 min. L'uSPG denaturato è stato preparato in modo simile, con la differenza che NaOH è stato aggiunto al filtrato del brodo di coltura in concentrazione 0,2 M e la soluzione alcalinizzata è stata incubata per 30 minuti a temperatura di laboratorio prima della diafiltrazione.

Risultati:
Il trattamento a ultrasuoni è stato applicato direttamente al brodo di coltura di S. commune 144-h con il micelio per facilitare la lavorazione a valle del GSP.
 
Caratteristiche della schizofillana sonicata: La schizofillina ultrasonica (uSPG) è stata precipitata dal filtrato del brodo di coltura mediante alcool e caratterizzata. SEC-MALLS ha stimato che il Mw dell'uSPG è di circa 1 MDa. Il peso molecolare medio dello schizofillano proveniente dalla fermentazione liquida è di circa 5 MDa, mentre nella coltivazione allo stato solido può raggiungere i 10 MDa. Confrontando il peso molecolare della schizofillana sottoposta a ultrasuoni con quello della schizofillana nativa non trattata, si osserva una riduzione del peso molecolare da 5 a 10 volte a causa degli ultrasuoni.
Il polisaccaride uSPG sonicato conteneva lo 0,7%w/w di proteine e l'1,0%w/w di residui dopo l'ignizione. L'idrolizzato uSPG era costituito da glucosio per oltre il 99%. I risultati analitici indicano che la sonicazione scinde la spina dorsale del β-glucano in modo casuale e i rami laterali rimangono intatti, riducendo così le dimensioni e il peso molecolare della schizofilla. Studi immunologici su uSPG essenzialmente privi di proteine ed endotossine hanno dimostrato che la schizofillana a basso peso molecolare trattata con ultrasuoni ha una marcata attività immunomodulante.

 
Viscosità ridotta: L'ultrasonicazione ha determinato una significativa diminuzione della viscosità del brodo di coltura. Durante l'ultrasonicazione, la viscosità del brodo di coltura è cambiata in modo non lineare: la diminuzione della viscosità è stata rapida all'inizio dell'ultrasonicazione, ma poi è rallentata. Un'energia specifica di 100 Ws/mL è stata sufficiente a ridurre la viscosità del brodo di coltura di quasi 7 volte.

Filtrazione migliorata: Il brodo di coltura trattato con ultrasuoni è passato attraverso il filtro più velocemente rispetto al brodo di coltura non trattato (input di energia specifica 0 Ws/mL) con SPG ad alta molecola. Inoltre, gli ultrasuoni hanno ridotto significativamente la perdita di prodotto durante la filtrazione. Il filtrato del brodo di coltura non trattato con SPG ad alta molecolarità (input di energia specifica 0 Ws/mL) conteneva 0,3 ± 0,07 g/L di SPG, mentre la concentrazione di SPG prima della filtrazione di profondità era di 2 g/L. Al contrario, il filtrato della coltura ultrasonica a 100 Ws/mL conteneva SPG in concentrazione di 2,2 ± 0,2 g/L, che corrisponde a una perdita di prodotto quasi nulla.

Conclusione: Nelle conclusioni il team di ricerca sostiene che il trattamento a ultrasuoni è una tecnologia efficace per la produzione di schizofillano a basso peso molecolare, che può essere utilizzato in cosmetica e medicina. L'ultrasuonoterapia, applicata al brodo di coltura completo di micelio, apporta alcuni vantaggi alla produzione di schizofillano. Riduce le perdite di prodotto durante la lavorazione a valle e rende possibile la produzione di polisaccaridi altamente purificati grazie all'uso efficiente dell'ultrafiltrazione.
Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che il trattamento a ultrasuoni della schizofillana è facilmente scalabile. Un'unità del disintegratore a ultrasuoni dell'impianto pilota UIP2000hdT ha trattato 1 litro di brodo di coltura in 110 s in modalità flusso. La produttività del sistema può essere facilmente aumentata collegando in sequenza altre unità a ultrasuoni.

 
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Apparecchiatura a ultrasuoni ad alte prestazioni per la lavorazione del glucano fungino

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La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasonori: