Estrazione dei beta-glucani dai funghi mediante ultrasuoni
Materiali e attrezzature
- Funghi (ad es., 100g di funghi tritati o affettati)
- Acqua distillata fredda (ad es., 500mL)
- Frullatore o macinatore
- Becher o matracci di vetro
- Carta da filtro o un sistema di filtrazione sotto vuoto
- Centrifuga (facoltativa)
- Alcol (ad es., etanolo) per la precipitazione
- Frigorifero
- Stufa di essiccazione
Protocollo di estrazione dei beta-glucani
- Macinare o frantumare i funghi (ad es., Chaga o fungo criniera di leone) fino a ottenere particelle grossolane di circa 1–3 millimetri. Ad esempio, utilizzare 100g di particelle di funghi essiccati.
- Quindi aggiungere le particelle di fungo a un becher o a un matraccio di vetro.
- Successivamente, aggiungere 500mL di acqua distillata al becher contenente le particelle di fungo da sottoporre a estrazione. Il rapporto acqua/funghi può variare a seconda del tipo specifico di fungo e delle dimensioni delle particelle.
- Dopo aver mescolato la sospensione, sottoporre la miscela a sonicazione utilizzando un omogeneizzatore a ultrasuoni da laboratorio (ad es., UP400St con sonotrodo da 22mm al 100% di ampiezza oppure UP200Ht con sonotrodo da 14mm al 100% di ampiezza) e mantenere la temperatura al di sotto di 90°C. Temperature più basse aiutano a preservare i composti termosensibili, come i beta-glucani, durante l’estrazione. Sottoporre a sonicazione per circa 5–10 minuti quando si utilizza UP400St e per 10–… minuti quando si utilizza UP200Ht, rispettivamente. Si tenga presente che la temperatura e il tempo di estrazione possono variare a seconda della potenza ultrasonica utilizzata. Naturalmente, volumi maggiori richiederanno tempi di sonicazione più lunghi.
- Filtrare la miscela sottoposta a sonicazione attraverso carta da filtro oppure utilizzare un sistema di filtrazione sotto vuoto per separare il liquido (contenente i beta-glucani estratti) dal residuo solido dei funghi.
- Quindi far precipitare i beta-glucani dal liquido aggiungendo alcol (ad es., etanolo). In genere, per la precipitazione si possono utilizzare 2–3 volumi di alcol.
- Successivamente, conservare la miscela in frigorifero per diverse ore per consentire la precipitazione dei beta-glucani.
- Dopo la precipitazione, è possibile decantare con attenzione il liquido e raccogliere il precipitato di beta-glucani.
- Infine, essiccare i beta-glucani in una stufa a bassa temperatura (ad es., 40–50°C) fino alla completa rimozione dell’alcol e all’ottenimento di una polvere secca.
I funghi presentano caratteristiche variabili. Pertanto, il processo di estrazione dei beta-glucani può differire in base a fattori quali la specie specifica di fungo, lo stato dei funghi (essiccati o freschi), le dimensioni delle particelle e la temperatura di estrazione. Per ottimizzare la procedura di estrazione, valutare la sperimentazione di diversi parametri, variando i rapporti solido/liquido, regolando le temperature, esplorando vari solventi e provando diverse durate di sonicazione e impostazioni di ampiezza.
Estrazione enzimatica dei beta-glucani assistita da ultrasuoni
L’estrazione enzimatica assistita da ultrasuoni è un metodo utilizzato per estrarre i beta-glucani dai funghi mediante una combinazione di enzimi e onde ultrasoniche. Questo processo migliora l’efficienza dell’estrazione disgregando le pareti cellulari dei funghi e facilitando il rilascio dei beta-glucani.
Aumento di scala dell’estrazione dei beta-glucani dai funghi
Una volta definito un protocollo di estrazione dei beta-glucani che soddisfi i propri requisiti, l’aumento di scala del processo di estrazione può essere un’operazione semplice.
Aumento di scala dell’estrazione in lotti
Se si prevede di aumentare la scala utilizzando un metodo di estrazione in lotti, consigliamo di aumentare il volume del lotto mantenendo costanti i rapporti solido/liquido e tutti gli altri parametri. Se si continua a utilizzare lo stesso omogeneizzatore a ultrasuoni, assicurarsi di aumentare proporzionalmente il tempo di sonicazione. Per lotti superiori a 1 litro, si può valutare l’aggiunta di un agitatore lento per mantenere le particelle in sospensione e migliorare l’uniformità dell’estrazione. L’immagine seguente mostra un sistema di estrazione in lotti da 8 litri che utilizza un omogeneizzatore a ultrasuoni UP400St in combinazione con un agitatore da laboratorio.
Sistema di estrazione dei funghi in lotti da 8L con sonicatore UP400St
Filtrazione sotto vuoto dell’estratto di beta-glucani dopo la sonicazione
Estrazione dei funghi in linea
Per chi è interessato a estrarre in continuo maggiori quantità di beta-glucani dai funghi, Hielscher Ultrasonics offre reattori con cella di flusso progettati per l’estrazione di materiale vegetale. Se questa soluzione risponde alle vostre esigenze, vi invitiamo a contattarci direttamente per ulteriori informazioni. Il nostro team tecnico sarà lieto di aiutarvi a individuare la configurazione più adatta alle vostre esigenze specifiche. Tuttavia, eseguire l’esperimento su scala di laboratorio menzionato in precedenza con la vostra specie specifica di fungo può essere estremamente utile per comprendere i requisiti precisi del processo. L’immagine seguente mostra un grande reattore con cella di flusso dotato di un omogeneizzatore a ultrasuoni UIP4000hdT per estrarre beta-glucani trattando circa 50–200 litri di sospensione di funghi in solvente all’ora.
Concentrazione empirica dei beta-glucani nelle specie di funghi
Di seguito è riportato un elenco delle concentrazioni empiriche dei beta-glucani estratti da varie specie di funghi.
| Mushroom Species | Total 1,3-1,6-β-D-glucan (g/100g dry mass) |
|---|---|
| Boletus pinophilus | 9,8% |
| Suillus granulatus | 13,3% |
| Craterellus cornucopioides | 4,5% |
| Suillus variegatus | 13,7% |
| Hydnum repandum | 4,1% |
| Gyroporus cyanescens | 14,3% |
| Tricholomopsis rutilans | 10,2% |
| Agaricus bisporus (portobello) | 4% |
| Agaricus bisporus (cremini) | 4% |
| Auricularia auricular-judae | 16,8% |
1,3-1,6-β-D-glucan content in the analyzed wild-growing and cultivated mushrooms, Source:Mirończuk-Chodakowska et al. (2017): Quantitative Evaluation of 1,3-1,6-Β-D-Glucan Contents in Wild–Growing Species of Edible Polish Mushrooms. Rocz Panstw Zakl Hig 2017;68(3):281-290.
SonoStation: sistema mobile chiavi in mano per il trattamento a ultrasuoni – composto da dispersori a ultrasuoni, pompa, agitatore e serbatoio
Omogeneizzatore a ultrasuoni UIP4000hdT per il trattamento di circa 50–200 litri di sospensione di funghi in solvente all’ora
Quantificazione della concentrazione dei beta-glucani negli estratti di funghi
La concentrazione dei beta-glucani dopo l’estrazione può essere quantificata con vari metodi, a seconda del tipo di beta-glucano e dei requisiti specifici dell’analisi. Di seguito sono elencati i metodi comuni per quantificare la concentrazione dei beta-glucani. Naturalmente, la scelta del metodo dipende da fattori quali l’accuratezza richiesta e le attrezzature disponibili.
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Metodo gravimetrico
- Principio: questo metodo si basa sulla precipitazione dei beta-glucani con etanolo, seguita dall’essiccazione e dalla pesata del precipitato.
- Procedura: il campione viene sciolto in acqua e trattato con etanolo per far precipitare i beta-glucani; quindi il precipitato viene raccolto, essiccato e pesato.
- Vantaggi: semplice e ampiamente utilizzato.
- Limiti: meno preciso rispetto ad altri metodi.
-
Metodi colorimetrici
- Principio: questi metodi prevedono reazioni cromatiche con reagenti specifici che producono una variazione di colore proporzionale alla concentrazione dei beta-glucani.
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Esempi:
- Metodo fenolo-acido solforico: questo metodo prevede il trattamento del campione con acido solforico concentrato e fenolo, che conferisce alla soluzione un colore arancione. L’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione dei beta-glucani.
- Metodo dell’antrone: il reagente all’antrone reagisce con i beta-glucani producendo un colore blu-verde, la cui intensità viene misurata.
- Vantaggi: sensibili e adatti ad analisi con elevata capacità di trattamento dei campioni.
- Limiti: interferenze da altri composti e necessità di reagenti specifici.
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Saggi enzimatici
- Principio: i saggi enzimatici utilizzano enzimi come la β-glucanasi per scomporre i beta-glucani in zuccheri più semplici, e gli zuccheri rilasciati vengono quantificati.
- Vantaggi: altamente specifici e accurati.
- Limiti: richiedono attrezzature e reagenti specializzati.
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Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
- Principio: l’HPLC separa e quantifica i composti in base alle loro interazioni con una colonna cromatografica.
- Procedura: i beta-glucani vengono idrolizzati in monosaccaridi, e gli zuccheri risultanti vengono separati e quantificati mediante HPLC.
- Vantaggi: altamente accurata e adatta a campioni complessi.
- Limiti: richiede attrezzature specializzate e competenze specifiche.
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Saggi immunologici specifici
- Principio: i saggi immunologici utilizzano anticorpi specifici per i beta-glucani per quantificarne la concentrazione.
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Esempi:
- ELISA (saggio immunoassorbente legato a un enzima): in questo metodo, un anticorpo coniugato a un enzima produce una variazione di colore quando si lega ai beta-glucani.
- Saggi a flusso laterale: si tratta di test rapidi che forniscono un risultato visibile su una striscia reattiva.
- Vantaggi: elevata specificità e sensibilità.
- Limiti: richiedono anticorpi specifici e possono essere più costosi.