L'ultrasonicazione è un metodo altamente efficiente per liberare chitina e chitosano da fonti fungine come i funghi. La chitina e il chitosano devono essere depolimerizzati e deacetilati nella lavorazione a valle per ottenere un biopolimero di alta qualità. La depolimerizzazione e la deacetilazione assistita da ultrasuoni è una tecnica molto efficace, semplice e rapida, che consente di ottenere chitosani di alta qualità con un peso molecolare elevato e una biodisponibilità superiore.

Chitina e chitosano derivati da funghi tramite ultrasuoni

Funghi commestibili e medicinali come il Lentinus edodes (shiitake), il Ganoderma lucidum (Lingzhi o reishi), l'Inonotus obliquus (chaga), l'Agaricus bisporus (fungo del bottone), l'Hericium erinaceus (criniera di leone), il Cordyceps sinensis (fungo del bruco), Grifola frondosa (gallina del bosco), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, coda di tacchino) e molte altre specie fungine sono ampiamente utilizzate come alimento e per l'estrazione di composti bioattivi. Questi funghi e i residui di lavorazione (scarti di funghi) possono essere utilizzati per produrre chitosano. Gli ultrasuoni non solo favoriscono il rilascio della chitina dalla struttura della parete cellulare fungina, ma guidano anche la conversione della chitina in chitosano di valore attraverso la depolimerizzazione e la deacetilazione assistita da ultrasuoni.

 

L'ultrasuonazione intensa con un sistema a ultrasuoni a sonda è una tecnica utilizzata per promuovere la depolimerizzazione e la deacetilazione della chitina, con conseguente formazione di chitosano. La chitina è un polisaccaride naturale presente negli esoscheletri di crostacei e insetti e nelle pareti cellulari di alcuni funghi. Il chitosano è derivato dalla chitina rimuovendo i gruppi acetilici dalla molecola di chitina.

Procedura a ultrasuoni per la conversione della chitina fungina in chitosano

Quando si applica l'ultrasuonoterapia intensa per la produzione di chitosano dalla chitina, una sospensione di chitina viene sonicata con onde ultrasonore ad alta intensità e bassa frequenza, in genere nell'intervallo tra 20 kHz e 30 kHz. Il processo genera un'intensa cavitazione acustica, che si riferisce alla formazione, alla crescita e al collasso di microscopiche bolle di vuoto nel liquido. La cavitazione genera forze di taglio estremamente elevate e localizzate, alte temperature (fino a diverse migliaia di gradi Celsius) e pressioni (fino a diverse centinaia di atmosfere) nel liquido che circonda le bolle di cavitazione. Queste condizioni estreme contribuiscono alla rottura del polimero della chitina e alla successiva deacetilazione.
 

 

Depolimerizzazione a ultrasuoni della chitina

La depolimerizzazione della chitina avviene attraverso gli effetti combinati di forze meccaniche, come il microstreaming e il getto di liquido, e di reazioni chimiche innescate dagli ultrasuoni e indotte da radicali liberi e altre specie reattive che si formano durante la cavitazione. Le onde ad alta pressione generate durante la cavitazione fanno sì che le catene di chitina subiscano uno stress da taglio, con conseguente scissione del polimero in frammenti più piccoli.

Deacetilazione ultrasonica della chitina

Oltre alla depolimerizzazione, gli ultrasuoni intensi promuovono anche la deacetilazione della chitina. La deacetilazione comporta la rimozione dei gruppi acetilici dalla molecola di chitina, con conseguente formazione di chitosano. L'intensa energia ultrasonica, in particolare le alte temperature e le pressioni generate durante la cavitazione, accelerano la reazione di deacetilazione. Le condizioni reattive create dalla cavitazione contribuiscono a rompere i legami acetilici della chitina, con conseguente rilascio di acido acetico e conversione della chitina in chitosano.
Nel complesso, l'ultrasuonazione intensa migliora sia il processo di depolimerizzazione che quello di deacetilazione, fornendo l'energia meccanica e chimica necessaria per rompere il polimero della chitina e facilitare la conversione in chitosano. Questa tecnica offre un metodo rapido ed efficiente per la produzione di chitosano dalla chitina, con numerose applicazioni in vari settori, tra cui quello farmaceutico, agricolo e dell'ingegneria biomedica.

Produzione industriale di chitosano da funghi con ultrasuoni di potenza

La produzione commerciale di chitina e chitosano si basa principalmente sugli scarti delle industrie marine (cioè pesca, raccolta di molluschi ecc.). Diverse fonti di materie prime danno luogo a diverse qualità di chitina e chitosano, con conseguenti fluttuazioni della produzione e della qualità dovute alle variazioni stagionali della pesca. Inoltre, il chitosano derivato da fonti fungine offre proprietà superiori come la lunghezza omogenea del polimero e una maggiore solubilità rispetto al chitosano proveniente da fonti marine. (cfr. Ghormade et al., 2017) Per fornire chitosano uniforme, l'estrazione di chitina da specie fungine è diventata una produzione alternativa stabile. La produzione di chitina e citiosano dai funghi può essere ottenuta facilmente e in modo affidabile utilizzando l'estrazione ad ultrasuoni e la tecnologia di deacetilazione. La sonicazione intensa interrompe le strutture cellulari per rilasciare la chitina e promuove il trasferimento di massa nei solventi acquosi per ottenere rendimenti superiori di chitina ed efficienza di estrazione. La successiva deacetilazione ultrasonica converte la chitina nel prezioso chitosano. Sia l'estrazione ultrasonica della chitina che la deacetilazione in chitosano possono essere scalate linearmente a qualsiasi livello di produzione commerciale.

Risultati della ricerca per la deacetilazione ultrasonica di chitina e chitosano

Zhu et al. (2018) concludono nel loro studio che la deacetilazione ultrasonica si è dimostrata una svolta cruciale, convertendo la β-chitina in chitosano con 83-94% di deacetilazione a temperature di reazione ridotte. L'immagine a sinistra mostra un'immagine SEM del chitosano deacetilato ad ultrasuoni (90 W, 15 min, 20 w/v% NaOH, 1:15 (g: mL) (immagine e studio: © Zhu et al., 2018)
Nel loro protocollo, la soluzione di NaOH (20 p/v %) è stata preparata sciogliendo scaglie di NaOH in acqua DI. La soluzione alcalina è stata poi aggiunta al sedimento GLSP (0,5 g) in un rapporto solido-liquido di 1:20 (g: mL) in una provetta da centrifuga. Il chitosano è stato aggiunto a NaCl (40 mL, 0,2 M) e acido acetico (0,1 M) in un rapporto di volume 1:1. La sospensione è stata quindi sottoposta a ultrasuoni a una temperatura moderata di 25°C per 60 minuti utilizzando un ultrasuonatore a sonda (250W, 20kHz). (cfr. Zhu et al., 2018)
 
Pandit et al. (2021) hanno scoperto che il tasso di degradazione delle soluzioni di chitosano è raramente influenzato dalle concentrazioni di acido utilizzate per solubilizzare il polimero e dipende in gran parte dalla temperatura, dall'intensità delle onde ultrasoniche e dalla forza ionica dei mezzi utilizzati per dissolvere il polimero. (cfr. Pandit et al., 2021)
 
In un altro studio, Zhu et al. (2019) hanno utilizzato polveri di spore di Ganoderma lucidum come materia prima fungina e hanno studiato la deacetilazione assistita da ultrasuoni e gli effetti dei parametri di lavorazione come il tempo di sonicazione, il rapporto solido/liquido, la concentrazione di NaOH e la potenza di irradiazione sul grado di deacetilazione (DD) del chitosano. Il valore più alto di DD è stato ottenuto con i seguenti parametri ultrasonici: 20 minuti di sonicazione a 80 W, 10% (g:ml) di NaOH, 1:25 (g:ml). La morfologia superficiale, i gruppi chimici, la stabilità termica e la cristallinità del chitosano ottenuto con gli ultrasuoni sono stati esaminati con SEM, FTIR, TG e XRD. Il team di ricerca riferisce di un significativo aumento del grado di deacetilazione (DD), della viscosità dinamica ([η]) e del peso molecolare (Mv¯) del chitosano prodotto con gli ultrasuoni. I risultati hanno evidenziato come la tecnica di deacetilazione ad ultrasuoni dei funghi sia un metodo di produzione altamente potente per il chitosano, adatto ad applicazioni biomediche. (cfr. Zhu et al., 2019)

Qualità superiore del chitosano con la depolimerizzazione e la deacetilazione a ultrasuoni

I processi ad ultrasuoni di estrazione e depolimerizzazione della chitina / chitosano sono controllabili con precisione e i parametri del processo ad ultrasuoni possono essere regolati in base alle materie prime e alla qualità del prodotto finale desiderato (ad esempio, peso molecolare, grado di deacetilazione). Questo permette di adattare il processo a ultrasuoni a fattori esterni e di impostare parametri ottimali per un risultato e un'efficienza superiori.
Il chitosano deacetilato ad ultrasuoni mostra un'eccellente biodisponibilità e biocompatibilità. Quando i biopolimeri di chitosano preparati con gli ultrasuoni vengono confrontati con il chitosano derivato termicamente per quanto riguarda le proprietà biomediche, il chitosano prodotto con gli ultrasuoni mostra una vitalità dei fibroblasti (cellule L929) significativamente migliorata e una maggiore attività antibatterica sia per l'Escherichia coli (E. coli) che per lo Staphylococcus aureus (S. aureus).
(cfr. Zhu et al., 2018)
 

Apparecchiature a ultrasuoni ad alte prestazioni per la lavorazione di chitina e chitosano

La frammentazione della chitina e la decetilazione della chitina in chitosano richiedono apparecchiature a ultrasuoni potenti e affidabili, in grado di fornire ampiezze elevate, di offrire un controllo preciso dei parametri di processo e di funzionare 24 ore su 24, 7 giorni su 7, in condizioni di carico elevato e in ambienti difficili. La gamma di prodotti Hielscher Ultrasonics soddisfa questi requisiti in modo affidabile. Oltre alle eccezionali prestazioni degli ultrasuoni, gli ultrasonori Hielscher vantano un'elevata efficienza energetica, che rappresenta un notevole vantaggio economico. – specialmente quando sono impiegati nella produzione commerciale su larga scala.
Gli ultrasuonatori Hielscher sono sistemi ad alte prestazioni che possono essere equipaggiati con accessori quali sonotrodi, booster, reattori o celle di flusso per soddisfare in modo ottimale le esigenze di processo.Grazie al display digitale a colori, alla possibilità di preimpostare i cicli di sonicazione, alla registrazione automatica dei dati su una scheda SD integrata, al controllo remoto via browser e a molte altre funzioni, gli ultrasonori Hielscher assicurano il massimo controllo del processo e la facilità d'uso. Grazie alla robustezza e alla grande capacità di carico, i sistemi a ultrasuoni Hielscher sono il vostro cavallo di battaglia affidabile in produzione. La frammentazione e la deacetilazione della chitina richiedono ultrasuoni potenti per ottenere una conversione mirata e un prodotto finale di chitosano di alta qualità. Soprattutto per la frammentazione dei fiocchi di chitina e le fasi di depolimerizzazione/deacetilazione, sono fondamentali ampiezze elevate e pressioni elevate. I processori industriali a ultrasuoni di Hielscher Ultrasonics forniscono facilmente ampiezze molto elevate. Ampiezze fino a 200 µm possono essere gestite in modo continuo, 24 ore su 24, 7 giorni su 7. Per ampiezze ancora maggiori, sono disponibili sonotrodi a ultrasuoni personalizzati. La capacità di potenza dei sistemi a ultrasuoni Hielscher consente una depolimerizzazione e una deacetilazione efficienti e rapide in un processo sicuro e facile da usare.
 

La tabella seguente fornisce un'indicazione della capacità di lavorazione approssimativa dei nostri ultrasuoni:

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Il trattamento sinergico della chitina migliorato dagli ultrasuoni

Per superare gli inconvenienti (bassa efficienza, alto costo energetico, lunghi tempi di lavorazione, solventi tossici) della tradizionale deacetilazione chimica ed enzimatica della chitina, gli ultrasuoni ad alta intensità sono stati integrati nella lavorazione della chitina e del chitosano. La sonicazione ad alta intensità e i conseguenti effetti di cavitazione acustica portano a una rapida scissione delle catene polimeriche e riducono la polidispersità, favorendo così la sintesi del chitosano. Inoltre, le forze di taglio ultrasoniche intensificano il trasferimento di massa nella soluzione in modo da potenziare le reazioni chimiche, idrolitiche o enzimatiche. Il trattamento ultrasonico della chitina può essere combinato con le tecniche di trattamento della chitina già esistenti, come i metodi chimici, l'idrolisi o le procedure enzimatiche.

Deacetilazione e depolimerizzazione chimica assistita dagli ultrasuoni

Poiché la chitina è un biopolimero non reattivo e insolubile, deve subire le fasi del processo di demineralizzazione, deproteinizzazione e depolimerizzazione/deacetilazione per ottenere chitosano solubile e bioaccessibile. Queste fasi del processo comportano trattamenti con acidi forti come l'HCl e basi forti come NaOH e KOH. Poiché queste fasi del processo convenzionale sono inefficienti, lente e richiedono elevate energie, l'intensificazione del processo mediante sonicazione migliora significativamente la produzione di chitosano. L'applicazione del power-ultrasound aumenta la resa e la qualità del chitosano, riduce il processo da giorni a poche ore, permette l'uso di solventi più blandi e rende l'intero processo più efficiente dal punto di vista energetico.

Deproteinizzazione migliorata ad ultrasuoni della chitina

Vallejo-Dominguez et al. (2021) hanno riscontrato nella loro indagine sulla deproteinizzazione della chitina che la “L'applicazione degli ultrasuoni per la produzione di biopolimeri ha ridotto il contenuto proteico e la dimensione delle particelle della chitina. Il chitosano ad alto grado di deacetilazione e a medio peso molecolare è stato prodotto con l'assistenza degli ultrasuoni.”

Idrolisi a ultrasuoni per la depolimerizzazione della chitina

Per l'idrolisi chimica, sia gli acidi che gli alcali sono usati per deacetilare la chitina, tuttavia la deacetilazione alcalina (per esempio, idrossido di sodio NaOH) è più ampiamente usata. L'idrolisi acida è un metodo alternativo alla tradizionale deacetilazione chimica, dove le soluzioni di acido organico sono usate per depolimerizzare la chitina e il chitosano. Il metodo dell'idrolisi acida è utilizzato soprattutto quando il peso molecolare della chitina e del chitosano deve essere omogeneo. Questo processo di idrolisi convenzionale è noto come lento e dispendioso in termini di energia e di costi. Il requisito di acidi forti, temperature e pressioni elevate sono fattori che trasformano il processo idrolitico del chitosano in una procedura molto costosa e dispendiosa in termini di tempo. Gli acidi utilizzati richiedono processi a valle come la neutralizzazione e la desalinizzazione.
Con l'integrazione di ultrasuoni ad alta potenza nel processo di idrolisi, i requisiti di temperatura e pressione per la scissione idrolitica di chitina e chitosano possono essere significativamente ridotti. Inoltre, la sonicazione permette concentrazioni di acido inferiori o l'uso di acidi più blandi. Questo rende il processo più sostenibile, efficiente, economico e rispettoso dell'ambiente.

Deacetilazione chimica assistita da ultrasuoni

La disintegrazione chimica e la deacteilazione della chitina e del chitosano si ottiene principalmente trattando la chitina o il chitosano con acidi minerali (per esempio, acido cloridrico HCl), nitrito di sodio (NaNO₂), o perossido di idrogeno (H₂O₂). Gli ultrasuoni migliorano il tasso di deacetilazione accorciando così il tempo di reazione necessario per ottenere il grado di deacetilazione desiderato. Ciò significa che la sonicazione riduce il tempo di lavorazione richiesto da 12-24 ore a poche ore. Inoltre, la sonicazione permette concentrazioni chimiche significativamente più basse, per esempio il 40% (w/w) di idrossido di sodio usando la sonicazione mentre il 65% (w/w) è richiesto senza l'uso degli ultrasuoni.

Deacetilazione ultrasonica-enzimatica

Mentre la deacetilazione enzimatica è una forma di lavorazione delicata e rispettosa dell'ambiente, la sua efficienza e i suoi costi sono antieconomici. A causa del complesso, laborioso e costoso isolamento a valle e della purificazione degli enzimi dal prodotto finale, la deacetilazione enzimatica della chitina non è implementata nella produzione commerciale, ma è usata solo nei laboratori di ricerca scientifica.
Il pre-trattamento a ultrasuoni prima della deacetilazione enzimatica frammenta le molecole di chitina, allargando così l'area superficiale e rendendo più superficie disponibile per gli enzimi. La sonicazione ad alte prestazioni aiuta a migliorare la deacetilazione enzimatica e rende il processo più economico.