A HPLC-analízis javítása megbízható minta-előkészítéssel
A nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) továbbra is az egyik legfontosabb analitikai technika a komplex mátrixokban található vegyületek azonosítására és mennyiségi meghatározására. A gyógyszeripari minőség-ellenőrzéstől a környezeti monitorozáson át az élelmiszer-analízisig a HPLC-módszereket érzékenységük, szelektivitásuk és reprodukálhatóságuk miatt értékelik. A kromatográfiás adatok megbízhatósága azonban nagymértékben függ egy döntő fontosságú lépéstől: a HPLC-minta-előkészítéstől.
A kutatások és a rutin minta-előkészítési eljárások azt mutatják, hogy az ultrahangos kezeléssel segített extrakció és minta-előkészítés jelentősen javítja a HPLC-analízis hatékonyságát, pontosságát és sebességét. Az ultrahangos energia alkalmazásával a mátrixok megbontására és az analitok oldószerekbe történő átjutásának fokozására a laboratóriumok nagyobb visszanyerést, rövidebb extrakciós időt és jobban reprodukálható analitikai eredményeket érhetnek el.
Miért fontos a minta-előkészítés a HPLC-ben?
Számos analitikai munkafolyamatban a mintamátrix – például növényi anyag, biológiai szövet, talaj vagy víz – olyan komplex vegyületkeverékeket tartalmaz, amelyek zavarhatják a kromatográfiás elválasztást. Ezért hatékony minta-előkészítésre van szükség az analitok izolálásához, a zavaró anyagok eltávolításához és a célvegyületek koncentrálásához a HPLC-rendszerbe történő injektálás előtt.
A hagyományos extrakciós technikák gyakran hosszadalmas eljárásokat, nagy térfogatú szerves oldószereket és több tisztítási lépést igényelnek. Ezek a módszerek változékonyságot okozhatnak, növelhetik az üzemeltetési költségeket és meghosszabbíthatják az analízis teljes időtartamát.
Az ultrahangos minta-előkészítés hatékony alternatívát kínál. Az ultrahangos kezelés nagyfrekvenciás akusztikus energiát juttat a folyékony közegbe, mikroszkopikus kavitációs buborékokat hozva létre. Amikor ezek a buborékok összeomlanak, helyi nyíróerőket és mikrokeveredési hatásokat keltenek, amelyek megbontják a szilárd mátrixokat és felgyorsítják az anyagátadást. Ez a folyamat rendkívüli mértékben fokozza az extrakció hatékonyságát.
UIP400MTP nagy mintaáteresztő képességű ultrahangos kezelőberendezés automata mintavevő fioláihoz való csőtartó állvánnyal
Tudományos bizonyítékok: az ultrahangos kezelés javítja az analitikai teljesítményt
Számos szakmailag lektorált tanulmány igazolta az ultrahangos extrakció előnyeit a HPLC-munkafolyamatokban.
Például egy vízminták peszticidmaradékainak monitorozására kidolgozott módszer ultrahangos kezelést alkalmazott LC–MS/MS analízissel kombinálva a karbaril peszticid koncentrációjának meghatározására. Ennél az eljárásnál a vízmintákat a kromatográfiás analízis előtt ultrahangos kezelés közben acetonitrillel extrahálták. A módszer kiváló analitikai teljesítményt ért el, többek között 89,53% és 101,72% közötti visszanyeréssel, ami igazolta az ultrahangos minta-előkészítési eljárás pontosságát és megbízhatóságát.
Az ultrahangos extrakciós lépés lehetővé tette az analitok hatékony átjutását a vizes mátrixból a szerves oldószerbe, csökkentve az oldószer-felhasználást és szükségtelenné téve a kiterjedt tisztítási eljárásokat. A validált analitikai módszer kiváló linearitást, precizitást és mennyiségi meghatározási határokat mutatott, kiemelve az ultrahangos kezelés hatékonyságát a modern kromatográfiás munkafolyamatokban. (vö. Roudani et al., 2018)
Egy másik tanulmány az ultrahanggal segített mátrix-szilárdfázisú diszperziót (UA-MSPD) vezette be az olajfalevelek oleuropeintartalmának HPLC-analízissel történő meghatározására. Ennél a technikánál a porított növényi anyagot és a szorbensanyagot összekeverték, majd az elúciós lépés során ultrahanghullámoknak tették ki. Az ultrahang fokozta az analit deszorpcióját a szorbens felületéről, miközben egyidejűleg javította a mintamátrixból történő extrakciót. (vö. Rashidipour és Heydari, 2018)
Az optimalizált ultrahangos eljárás jelentős analitikai javulást eredményezett, többek között:
- Lineáris kalibrációs görbék R² = 0,9979 értékkel
- Akár 0,03 µg mL⁻¹ kimutatási határok
- 90,2% és 96,7% közötti visszanyerési arányok
Ezek az eredmények megerősítik, hogy az ultrahanggal segített extrakció nemcsak felgyorsítja a minta-előkészítést, hanem a klasszikus mátrix-szilárdfázisú diszperziós technikákhoz képest az extrakciós hozamot is növeli.
UP200St szondás ultrahangos kezelőberendezés HPLC-minta-előkészítéshez
Az ultrahangos minta-előkészítés fő előnyei a HPLC-ben
Az ultrahangos extrakció egyre szélesebb körű alkalmazását az analitikai laboratóriumokban számos mérhető előny ösztönzi.
- Nagyobb extrakciós hatékonyság
Az akusztikus kavitáció megbontja a szilárd mátrixokat és javítja az oldószer behatolását. Ez fokozza az analitok felszabadulását és növeli a visszanyerési arányokat, különösen a komplex mintákban nyomnyi mennyiségben jelen lévő vegyületek esetében. - Rövidebb minta-előkészítési idő
Ultrahangos extrakcióval a minta-előkészítés gyakran másodpercek vagy percek alatt elvégezhető. Például az UA-MSPD során alkalmazott optimalizált ultrahangos extrakciós paraméterek mintegy 30 másodpercnyi ultrahangos kezeléssel hatékony analit-visszanyerést eredményeztek, bemutatva, milyen rendkívüli mértékben gyorsíthatók fel az analitikai munkafolyamatok. - Kisebb oldószer-felhasználás
Mivel az ultrahang fokozza az anyagátadást, jellemzően kisebb oldószertérfogatokra van szükség. Az oldószer-felhasználás csökkentése javítja a laboratórium fenntarthatóságát és mérsékli az üzemeltetési költségeket. - Jobb reprodukálhatóság
Az ultrahangos energia egyenletes eloszlása biztosítja a minták következetes megbontását és extrakcióját az ismétlések között, ami az analitikai mérések jobb precizitásához vezet. - Kompatibilitás a modern kromatográfiás módszerekkel
Az ultrahangos extrakció könnyen integrálható a HPLC, UHPLC és LC-MS rendszerekbe, így nagy mintaáteresztő képességű analitikai környezetekben is alkalmazható.
Az Annona muricata leveleiből UP400S ultrahangos kezelőberendezéssel izolált kivonat fenolos vegyületeinek HPLC-kromatogramja.
(Tanulmány és ábra: ©Nolasco-González et al., 2022)
Gyakorlati ultrahangos kezelési megoldások HPLC-minta-előkészítéshez
Az ultrahangos extrakciót alkalmazó laboratóriumok számára a Hielscher ultrahangos kezelőberendezései lehetővé teszik az olyan paraméterek pontos szabályozását, mint az amplitúdó, az idő és az impulzusüzemmód. Ezért a Hielscher laboratóriumi ultrahangos kezelőberendezései különösen alkalmasak analitikai laboratóriumok számára.
Válassza ki a HPLC-mintáihoz legmegfelelőbb laboratóriumi ultrahangos kezelőberendezést
| Ultrahangos kezelőberendezés modellje | Előnyök a HPLC-ben | Legmegfelelőbb alkalmazás a HPLC-minta-előkészítésben |
| VialTweeter többcsöves ultrahangos kezelőberendezés |
• Akár 10 lezárt fiola egyidejű ultrahangos kezelése azonos ultrahangos energiával • Steril: nincs keresztszennyeződés, mivel a minták zárva maradnak • Nagymértékben reprodukálható extrakciós körülmények a mintasorozatok között • Hatékony kavitáció kis térfogatú analitikai mintákhoz |
• Környezeti, élelmiszer- vagy gyógyszeripari minták nagy mintaáteresztő képességű előkészítése • Nyomnyi mennyiségben jelen lévő analitok extrakciója HPLC, UHPLC vagy LC-MS analízis előtt • Szabványosított munkafolyamatok, amelyek több minta azonos kezelését igénylik |
| UIP400MTP mikrolemezes ultrahangos kezelőberendezés |
• Teljes mikrolemezek érintkezésmentes ultrahangos kezelése (96 lyukú, 384 lyukú formátumok) • Az ultrahangos energia egyenletes eloszlása az összes mintaüregben • Lehetővé teszi az analitikai munkafolyamatok automatizálását és robotikai integrációját • Nagy mintaáteresztő képesség az amplitúdó és az ultrahangos kezelési idő pontos szabályozásával |
• Nagy mintaáteresztő képességű UHPLC-szűrési munkafolyamatok • Gyógyszeripari vegyületkönyvtárak és metabolomikai minták előkészítése • Lemezalapú extrakció LC-MS vagy UHPLC analitikai folyamatsorokhoz |
| Laboratóriumi ultrahangos kezelőberendezések mikroheggyel (közvetlen ultrahangos kezelés) |
• Maximális ultrahangos intenzitás a mátrix hatékony megbontásához • Analitok rendkívül gyors extrakciója szilárd, viszkózus vagy heterogén mintákból • Állítható amplitúdó- és impulzusparaméterek az optimalizált extrakciós körülményekhez • A nagy kavitációs energia javítja az analitok visszanyerését és az extrakciós hozamot |
• Extrakció nehezen kezelhető mátrixokból, például növényi szövetekből, élelmiszermintákból vagy polimerekből • Homogenizálás SPE, szűrés vagy folyadék–folyadék extrakció előtt • Módszerfejlesztés ultrahangos HPLC-minta-előkészítéshez |
| CupHorn („nagy intenzitású fürdő” főzőpoharakhoz és csövekhez) |
• A közvetett ultrahangos kezelés megakadályozza a szonda szennyeződését • Egyenletes ultrahangtér több cső számára egyidejűleg • Ideális steril, veszélyes vagy illékony mintákhoz, amelyeket lezárva kell tartani • Egyszerűsíti a kezelést, miközben fenntartja az erős kavitációs energiát |
• Több HPLC-minta párhuzamos extrakciója lezárt centrifugacsövekben • Biológiai, gyógyszeripari vagy környezeti minták előkészítése • Olyan munkafolyamatok, amelyek szennyeződésmentes, közvetett ultrahangos kezelést igényelnek |
Tudományos jelentőség az analitikai kémiában
Ahogy az analitikai kémia a gyorsabb és fenntarthatóbb laboratóriumi gyakorlatok felé halad, az ultrahangos minta-előkészítés nagy hatékonyságú, új lehetőségeket teremtő technológiává vált. Az ultrahangos kezelés támogatja olyan gyors analitikai módszerek fejlesztését, amelyek kisebb oldószer-felhasználással, jobb extrakciós hatékonysággal és robusztus validálási paraméterekkel rendelkeznek.
Az ultrahangos extrakcióval foglalkozó, egyre bővülő szakirodalom azt mutatja, hogy az ultrahangos kezeléssel segített HPLC-minta-előkészítés nem pusztán kényelmi megoldás – tudományosan validált eljárás, amely javítja az analitikai teljesítményt. Az ultrahangos extrakció modern kromatográfiás technikákkal történő kombinálásával a laboratóriumok megbízhatóan mutathatják ki a nyomnyi mennyiségben jelen lévő analitokat az egyre összetettebb mintamátrixokban.
Ultrahangos kezeléssel javított HPLC-munkafolyamatok
Az analitikai műszerezés és a minta-előkészítési technológiák folyamatos fejlődésével az ultrahangos extrakció valószínűleg még nagyobb szerepet fog játszani a kromatográfiás laboratóriumokban. A munkafolyamatok egyszerűsítésére, az adatminőség javítására és a környezeti hatás csökkentésére való képessége jól illeszkedik a modern analitikai tudomány változó követelményeihez.
A HPLC-minta-előkészítés optimalizálására törekvő analitikai vegyészek és ipari laboratóriumok számára az ultrahangos extrakció bevált, méretezhető és tudományosan megalapozott megoldást kínál. Az ultrahangos kezelés rutin minta-előkészítési protokollokba történő integrálásával a laboratóriumok jelentősen javíthatják a kromatográfiás analízis hatékonyságát és megbízhatóságát egyaránt.
Tervezés, gyártás és tanácsadás – Németországban készült minőség
A Hielscher ultrahangos kezelőberendezései a legmagasabb minőségi és tervezési követelmények teljesítéséről ismertek. Robusztusságuk és egyszerű kezelésük lehetővé teszi ultrahangos kezelőberendezéseink zökkenőmentes integrálását az ipari létesítményekbe. A Hielscher ultrahangos kezelőberendezései könnyedén megbirkóznak a zord körülményekkel és a nagy igénybevételt jelentő környezetekkel.
A Hielscher Ultrasonics ISO-tanúsítvánnyal rendelkező vállalat, amely különös hangsúlyt fektet a nagy teljesítményű, a legkorszerűbb technológiát és felhasználóbarát működést kínáló ultrahangos kezelőberendezésekre. A Hielscher ultrahangos kezelőberendezései természetesen megfelelnek a CE-előírásoknak, valamint az UL, a CSA és a RoHs követelményeinek.
Szakirodalom / Hivatkozások
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Gyakran ismételt kérdések
Mi a HPLC?
A nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) olyan analitikai elválasztási technika, amelyet egy keverék összetevőinek azonosítására, mennyiségi meghatározására és tisztítására használnak. A HPLC-ben egy folyékony mozgófázis nagy nyomáson szállítja az oldott analitokat egy állófázissal töltött oszlopon keresztül. Az analitok, az állófázis és a mozgófázis közötti kölcsönhatások különbségei miatt a vegyületek az oszlopon való áthaladás során elválnak egymástól. Az UV-Vis-, fluoreszcenciás vagy tömegspektrometriás detektorok mérik az elválasztott vegyületeket, lehetővé téve a pontos minőségi és mennyiségi elemzést.
Melyek a folyadékkromatográfia típusai?
A folyadékkromatográfia az analit, az állófázis és a mozgófázis között érvényesülő elválasztási mechanizmus alapján osztályozható. A leggyakoribb típusok a fordított fázisú kromatográfia, amelyben egy apoláris állófázis hidrofób kölcsönhatások alapján választja el a vegyületeket; a normál fázisú kromatográfia, amely poláris állófázist használ, és polaritás szerint választja el a vegyületeket; az ioncserés kromatográfia, amelyben töltéssel rendelkező állófázisok ionos kölcsönhatások alapján választják el az analitokat; valamint a méretkizárásos kromatográfia, amely a molekulákat hidrodinamikai méretük és molekulatömegük szerint választja el. További speciális módszerek az affinitáskromatográfia és a hidrofil kölcsönhatású kromatográfia (HILIC), amelyek meghatározott molekuláris kölcsönhatásokat vagy poláris vegyületeket céloznak meg.
Milyen fiolákat használnak a HPLC-hez?
A HPLC-analízisekhez jellemzően kis üveg- vagy polimerfiolákat használnak, amelyeket az előkészített minták tárolására terveztek a kromatográfiás rendszerbe történő injektálás előtt. A leggyakoribb formátum a 2-mL-es automata mintavevő fiola, amely a legtöbb HPLC automata mintavevővel kompatibilis. Ezek a fiolák általában boroszilikát üvegből készülnek a vegyi ellenállóság és az oldószerekkel, valamint az analitokkal való minimális kölcsönhatás biztosítása érdekében. A minta típusától függően a fiolák tartalmazhatnak kis térfogatú mintákhoz való betéteket, csavaros kupakos vagy peremezett zárásokat, valamint például PTFE/szilikon anyagból készült szeptumokat a minta integritásának megőrzésére.
Mik az automata mintavevő fiolák?
Az automata mintavevő fiolák speciális mintatartó edények, amelyeket HPLC- és UHPLC-műszerek automatizált injektáló rendszereihez terveztek. Az előkészített mintaoldatot tartalmazzák, és a műszer automata mintavevő tálcájára helyezik őket, ahonnan a rendszer automatikusan meghatározott térfogatot vesz fel a kromatográfiás oszlopba történő injektáláshoz. Az automata mintavevő fiolákat pontos méretekkel gyártják, hogy biztosítsák a robotizált mintavevő tűkkel való kompatibilitást, és minimalizálják a minta párolgását, szennyeződését vagy adszorpcióját. Kialakításuk reprodukálható, nagy mintaáteresztő képességű analízist tesz lehetővé a modern kromatográfiás laboratóriumokban.
Melyek a HPLC lépései?
A nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) szokásos munkafolyamata több egymást követő lépésből áll, amelyek biztosítják az analitok megbízható elválasztását és detektálását.
- Először minta-előkészítést végeznek az analit feloldására, a részecskék eltávolítására, valamint gyakran a célvegyületek mintamátrixból történő extrakciójára vagy koncentrálására. Ez a lépés szűrést, hígítást vagy olyan extrakciós technikákat foglalhat magában, mint az ultrahangos extrakció, a szilárdfázisú extrakció vagy a folyadék–folyadék extrakció.
- Ezután az előkészített mintát HPLC-fiolába helyezik, majd betöltik az automata mintavevőbe. Az automata mintavevő a minta pontosan meghatározott térfogatát injektálja az áramló mozgófázisba.
- A mozgófázis szállítási lépése ezután nagynyomású szivattyú segítségével továbbítja az injektált mintát a rendszeren keresztül. A mozgófázis szabályozott térfogatárammal szállítja az analitokat a kromatográfiás oszlopon keresztül.
- Az elválasztás a kromatográfiás oszlop belsejében történik. Az oszlop állófázist tartalmaz, amely jellemzően meghatározott kémiai tulajdonságokkal rendelkező részecskékből álló töltet. Ahogy az analitok áthaladnak az oszlopon, eltérő módon lépnek kölcsönhatásba az állófázissal és a mozgófázissal, ezért különböző időpontokban eluálódnak.
- Az elválasztás után a vegyületek egy detektoron, például UV-Vis-, fluoreszcenciás vagy tömegspektrometriás detektoron haladnak át. A detektor méri az eluálódó vegyületek jelenlétét és koncentrációját, és a jelet elektronikus adatokká alakítja.
- Végül kromatográfiás szoftverrel végzik az adatgyűjtést és az elemzést. A rendszer kromatogramot hoz létre, amelyben a csúcsok az egyes vegyületeknek felelnek meg. A csúcsok retenciós ideje segíti az analitok azonosítását, míg a csúcsterületek vagy csúcsmagasságok lehetővé teszik koncentrációjuk mennyiségi meghatározását.
A Hielscher Ultrasonics nagy teljesítményű ultrahangos homogenizátorokat gyárt a laboratóriumi mérettől az ipari méretig.