Sonication Lysis: सेल व्यवधान और निष्कर्षण

कोशिका विघटन या लिस बायोटेक प्रयोगशालाओं में दैनिक नमूना तैयारी का एक आम हिस्सा है। एलिस का लक्ष्य कोशिका दीवार के हिस्सों या जैविक अणुओं को मुक्त करने के लिए पूर्ण सेल को बाधित करना है। तथाकथित लिसेट में प्लास्मिड, रिसेप्टर assays, प्रोटीन, डीएनए, आरएनए आदि शामिल हो सकते हैं। Lysis के निम्नलिखित कदम fractionation, organelle अलगाव या / और प्रोटीन निष्कर्षण और शुद्धिकरण हैं। निकाली गई सामग्री (= lysate) को अलग किया जाना चाहिए और प्रोटीमिक शोध के लिए आगे की जांच या अनुप्रयोगों के अधीन है। अल्ट्रासोनिक homogenizers सफल सेल lysis के लिए एक आम उपकरण हैं। चूंकि अल्ट्रासोनिक तीव्रता को प्रक्रिया पैरामीटर को समायोजित करके स्तरित किया जा सकता है, इसलिए बहुत नरम से इष्टतम sonication तीव्रता प्रत्येक पदार्थ और माध्यम के लिए विशिष्ट अनुप्रयोग आवश्यकता को पूरा करने के लिए व्यक्तिगत रूप से सेट किया जा सकता है।

सेल संरचना

कोशिकाएं एक अर्द्ध पारगम्य प्लाज्मा झिल्ली एक phospho-लिपिड दोहरी परत (भी प्रोटीन लिपिड बाईलेयर; हाइड्रोफोबिक लिपिड और एम्बेडेड प्रोटीन अणुओं के साथ हाइड्रोफिलिक फास्फोरस अणुओं द्वारा गठित) में होते हैं जो द्वारा सुरक्षित हैं और (कोशिका द्रव्य) सेल अंदरूनी के बीच एक बाधा पैदा करता है और बाह्य वातावरण। संयंत्र कोशिकाओं और प्रोकेरियोटिक कोशिकाओं एक कोशिका दीवार से घिरे हैं। कई परतों सेल्यूलोज की मोटी सेल की दीवार के कारण, पौधों की कोशिकाओं पशु कोशिकाओं की तुलना में ल्य्से करने के लिए कठिन है। इस तरह के अंगों, नाभिक, माइटोकांड्रिया के रूप में सेल इंटीरियर,, cytoskeleton द्वारा स्थिर है।
कोशिकाओं lysing करके, यह निकालने और अंगों, प्रोटीन, डीएनए, mRNA या अन्य जैविक अणुओं को अलग करने के उद्देश्य से है।

संयंत्र कोशिकाओं से अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण: सूक्ष्म अनुप्रस्थ खंड (टीएस) कोशिकाओं से अल्ट्रासोनिक निष्कर्षण के दौरान कार्यों के तंत्र से पता चलता है (मैग्नीफिकेशन 2000x) [संसाधन: Vilkhu एट अल. 2011]

तरीके

वहाँ कोशिकाओं है, जो यांत्रिक और रासायनिक विधियों, जो डिटर्जेंट या सॉल्वैंट्स के उपयोग, उच्च दबाव के आवेदन, या एक मनका मिल के या एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग शामिल है में बांटा जा सकता lysate करने के लिए कई तरीके हैं। इन तरीकों में से सबसे समस्याग्रस्त नुकसान मुश्किल नियंत्रण और प्रक्रिया मापदंडों का समायोजन और इस तरह प्रभाव है।
आम lysis तरीकों के मुख्य नुकसान:

तालिका: सेल के पारंपरिक तरीकों प्रमुख नुकसान है

इसके विपरीत, sonication कि sonication मानकों पर एक पूर्ण नियंत्रण के लिए अनुमति देता है सेल विघटन के लिए एक बहुत ही कुशल और विश्वसनीय उपकरण है। यह सामग्री जारी है और उत्पाद पवित्रता पर एक उच्च चयनात्मकता सुनिश्चित करता है। [Balasundaram एट अल। 2009] यह सब प्रकार की कोशिकाओं के लिए उपयुक्त और छोटे और बड़े पैमाने में आसानी से लागू है। Ultrasonicators साफ करने के लिए आसान है। एक अल्ट्रासोनिक homogenizer हमेशा साफ-इन-जगह (सीआईपी) और नसबंदी में जगह (SIP) समारोह की सुविधा है। sonotrode एक बड़े पैमाने पर टाइटेनियम सींग जो मिटा दिया या (काम कर रहे मध्यम के आधार पर) पानी या विलायक में प्लावित किया जा सकता है में होते हैं। ultrasonicators के रखरखाव उनकी मजबूती की वजह से लगभग neglectable है।

lysis

Lysis एक संवेदनशील प्रक्रिया है। lysis के दौरान कोशिका झिल्ली की सुरक्षा को नष्ट कर दिया है, लेकिन निष्क्रियता, एक unphysiological पर्यावरण (पीएच-मूल्य से विचलन) द्वारा विकृतीकरण और निकाले प्रोटीन की गिरावट को रोका जाना चाहिए। इसलिए, सामान्य lysis में एक बफर समाधान में किया जाता है। अधिकांश कठिनाइयों सभी intracellular सामग्री या / और लक्ष्य उत्पाद का विकृतीकरण के अलक्षित रिलीज में जिसके परिणामस्वरूप अनियंत्रित कोशिका विघटन से उत्पन्न होती हैं।

अल्ट्रासोनिक Lysis

आम तौर पर, प्रयोगशाला में नमूने का विश्लेषण 15 सेकंड और 2 मिनट के बीच ले जाएगा। चूंकि sonication की तीव्रता एक sonication समय के साथ-साथ सही उपकरण चुनकर आयाम द्वारा समायोजित करना बहुत आसान है, सेल संरचना और एलिसिस के उद्देश्य पर सेल झिल्ली को बहुत धीरे-धीरे या अचानक अचानक बाधित करना संभव है। उदाहरण के लिए डीएनए निष्कर्षण को नरम sonication की आवश्यकता होती है, बैक्टीरिया के पूर्ण प्रोटीन निष्कर्षण के लिए एक अधिक तीव्र अल्ट्रासाउंड उपचार की आवश्यकता होती है)। प्रक्रिया के दौरान तापमान पर एक एकीकृत तापमान संवेदक द्वारा निगरानी की जा सकती है और इसे ठंडा करने (ठंडा जैकेट के साथ बर्फ स्नान या प्रवाह कोशिकाओं) या स्पंदित मोड में sonication द्वारा आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है। पल्स-मोड sonication के दौरान, 1-15 सेकंड की अवधि के छोटे sonication विस्फोट चक्र लंबी अंतराल अवधि के दौरान गर्मी अपव्यय और शीतलन के लिए अनुमति देते हैं।
सभी अल्ट्रासाउंड चालित प्रक्रियाओं पूरी तरह से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और रैखिक स्केलेबल हैं।

अल्ट्रासोनिक homogenizers

के विभिन्न प्रकार अल्ट्रासोनिक उपकरण नमूना तैयारी लक्ष्य मिलान के लिए अनुमति देते हैं और उपयोगकर्ता के मित्रता और ऑपरेशन आराम आश्वस्त करने के लिए। जांच-प्रकार ultrasonicators लैब में सबसे आम उपकरण हैं। वे 1000 मिलीग्राम से ऊपर 0.1ml की मात्रा के साथ छोटे और मध्यम आकार के नमूने की तैयारी के लिए सबसे उपयुक्त हैं। विभिन्न शक्ति आकार और sonotrodes नमूना मात्रा और सबसे प्रभावी और कुशल sonicating परिणामों के लिए पोत को ultrasonicator अनुकूल करने के लिए अनुमति देते हैं। अल्ट्रासोनिक जांच उपकरण सबसे अच्छा विकल्प एक नमूने तैयार रहना है जब है।

यदि अधिक नमूनों को तैयार किया जाना है, उदाहरण के लिए सेल समाधान के 8 शीशियों, वायलट्वेटर या अल्ट्रासोनिक कपहॉर्न जैसे डिवाइस लीस के लिए सबसे उपयुक्त होमोजेनाइज़र हैं। एक ही तीव्रता पर, एक ही समय में कई शीशियों को sonicated किया जाता है। यह न केवल समय बचाता है, बल्कि सभी नमूनों के समान उपचार को भी सुनिश्चित करता है, जो नमूने के बीच विश्वसनीय और तुलनात्मक परिणाम बनाता है। इसके अलावा, अल्ट्रासोनिक sonotrode (जिसे अल्ट्रासोनिक जांच, सींग, टिप, या उंगली के रूप में भी जाना जाता है) को विसर्जित करके क्रॉस-दूषितता से बचा जाता है। चूंकि शीशियों का उपयोग किया जाता है, इसलिए समय लेने वाली सफाई और जहाजों के निर्वहन के कारण नमूना हानि छोड़ी जाती है।
अधिक मात्रा के लिए, उदाहरण के लिए सेल के अर्क के वाणिज्यिक उत्पादन के लिए, एक प्रवाह सेल रिएक्टर के साथ निरंतर अल्ट्रासोनिक प्रणाली सबसे उपयुक्त हैं। प्रसंस्कृत सामग्री के निरंतर और यहां तक ​​कि प्रवाह एक और भी sonication भरोसा दिलाते हैं। अल्ट्रासोनिक विघटन की प्रक्रिया के सभी मानकों को अनुकूलित और आवेदन और विशेष सेल सामग्री की आवश्यकताओं को समायोजित किया जा सकता है।
बैक्टीरियल कोशिकाओं की अल्ट्रासोनिक lysing के लिए अनुकरणीय प्रक्रिया:

• सेल निलंबन की तैयारी: सेल छर्रों पूरी तरह से homogenizing (अपने बफर समाधान निम्नलिखित विश्लेषण, जैसे विशिष्ट क्रोमैटोग्राफी विधि के साथ संगत चुनें) द्वारा एक बफर समाधान में निलंबित कर दिया जाना चाहिए। lysozymes और / या अन्य additives जोड़ें, यदि आवश्यक हो तो (वे भी जुदाई / शुद्धि साधन के साथ संगत होना चाहिए)। मिक्स / हल्के sonication के तहत धीरे समाधान homogenize जब तक पूरा निलंबन हासिल की है।
• अल्ट्रासोनिक lysis: एक बर्फ स्नान में नमूना रखें। सेल विघटन के लिए, 60-90 दूसरा फटने (अपने ultrasonicator के पल्स मोड का उपयोग) पर निलंबन sonicate।
• (। जैसे 10 मिनट 10,000 पर एक्स जी; 4degC पर): पृथक्करण अपकेंद्रित्र lysate। सेल गोली ध्यान से से सतह पर तैरनेवाला अलग करें। सतह पर तैरनेवाला कुल सेल lysate है। सतह पर तैरनेवाला के निस्पंदन के बाद, आप घुलनशील सेल प्रोटीन का एक स्पष्ट किया तरल पदार्थ प्राप्त करते हैं।

जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में ultrasonicators के लिए सबसे आम अनुप्रयोगों हैं:

• सेल निकालने की तैयारी
• खमीर, बैक्टीरिया, पौधे की कोशिकाओं, नरम या कठोर कोशिका ऊतक, न्यूक्लिक सामग्री का विघटन
• प्रोटीन निष्कर्षण
• तैयारी और एंजाइमों के अलगाव
• एंटीजन का उत्पादन
• डीएनए निष्कर्षण और / या लक्षित विखंडन
• लाइपोसोम तैयारी