Applications des ultrasons au virus de la variole du singe

Le traitement par ultrasons est une méthode importante pour isoler le virus de la variole du singe (MPXV) à partir d’échantillons destinés à l’analyse, pour fragmenter l’ADN viral ainsi que pour fabriquer des vaccins contre la variole du singe. Lors de la préparation des échantillons avant le diagnostic et l’analyse (PCR, ELISA, etc.), le traitement par ultrasons est utilisé pour lyser les cellules afin de libérer le virus de la variole du singe de l’intérieur des cellules et / ou de fragmenter l’ADN. Dans la production de vaccins, les applications vont de la préparation des particules virales / de l’ADN à l’encapsulation dans des vecteurs de médicaments et à la formulation des inoculums.
Vous trouverez ci-dessous des informations détaillées sur la préparation par ultrasons des échantillons contenant le virus de la variole du singe ainsi que sur la production de vaccins contre le MPXV assistée par ultrasons.

Ce que vous trouverez sur cette page :

• Lyse par ultrasons pour l’extraction du virus de la variole du singe
• Fragmentation par ultrasons de l’ADN du virus de la variole du singe
• Applications des ultrasons dans la production de vaccins contre le MPXV

Lyse par ultrasons et fragmentation de l’ADN avant la réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Une infection par le virus de la variole du singe est détectée par un test d’amplification des acides nucléiques (NAAT), au moyen d’une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel ou conventionnelle, afin de détecter des séquences uniques d’ADN viral. L’échantillon (par exemple, issu d’un prélèvement nasopharyngé par écouvillon ou de biopsies cutanées) contient le virus dans les cellules.
Pour l’analyse, le virus doit être libéré des cellules et l’ADN viral doit être fragmenté pour la PCR.

Lyse par ultrasons :

La rupture / lyse cellulaire par ultrasons est une méthode fiable et efficace pour isoler les virus à partir d’échantillons cellulaires et constitue ainsi une technique préférable aux agents chimiques, tels que le lysozyme, la protéinase K et divers détergents, utilisés comme autres moyens de réaliser la lyse cellulaire et la libération de l’ADN.
Cependant, l’utilisation de ces réactifs chimiques nécessite une préparation des échantillons longue et en plusieurs étapes avant l’analyse par PCR afin d’éviter l’inhibition de la réaction PCR. Comme les inhibiteurs de la PCR affectent l’efficacité de l’amplification, de faibles variations de la quantité d’inhibiteurs non éliminés peuvent entraîner de fortes variations de l’amplification du produit de PCR (Diaco, 1995).
L’avantage du traitement par ultrasons pour la lyse est que la rupture complète des structures cellulaires et la libération de l’ADN sans recours à des réactifs de lyse ni à une préparation longue des échantillons sont souhaitables. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentation de l’ADN par ultrasons :

La fragmentation de l’ADN par ultrasons est simple et fiable, car elle produit des fragments d’ADN dont la longueur est réglable (paires de bases, bp). Les ultrasons permettent de fragmenter efficacement l’ADN jusqu’à la longueur ciblée. Le contrôle précis des paramètres ultrasonores et des options de refroidissement sophistiquées empêchent la dégradation de l’ADN.
En savoir plus sur la fragmentation de l’ADN par ultrasons !

Applications des ultrasons aux vaccins contre le virus de la variole du singe

Les vaccins utilisés contre le virus de la variole du singe sont actuellement des vaccins à virus vivants. Les vaccins nouvellement développés pourraient utiliser d’autres plateformes, telles que celles à base d’ADN… Contient actuellement un virus Vaccinia Ankara modifié, un orthopoxvirus atténué et non réplicatif. Contient également du Tris (tris-aminométhane) et du chlorure de sodium. Le vaccin peut aussi contenir de faibles quantités d’ADN et de protéines provenant des cellules de fibroblastes d’embryon de poulet, utilisées pour cultiver le virus vaccinal, de la benzonase et des composés antibiotiques tels que la gentamicine et la ciprofloxacine.

L’homogénéisation par ultrasons est utilisée dans la production de vaccins à virus vivants atténués, de vaccins à ADN, de cocktails d’ADN multivalents, de vaccins à ARNm, de vaccins à protéines recombinantes, de vaccins à particules pseudo-virales, etc.

Vous trouverez des informations plus approfondies sur les applications des ultrasons pour améliorer la fabrication des vaccins !

Protocole d’isolement du virus de la variole du singe par ultrasons

L’équipe de recherche de Stittelaar (2005) a utilisé la lyse par ultrasons pour libérer le virus de la variole du singe de la culture de cellules hôtes servant à sa multiplication ainsi que de cellules obtenues par prélèvements de gorge à l’aide d’écouvillons chez des primates infectés.

Préparation du vaccin contre la variole du singe :

Les virus de la variole du singe ont été cultivés sur des cellules de fibroblastes d’embryon de poulet exemptes d’agents pathogènes spécifiques. Après une incubation de 1 à 2 jours, la suspension de virus et de cellules a été récoltée par un cycle de congélation-décongélation, puis concentrée par centrifugation. Le culot a été remis en suspension et soumis à plusieurs cycles d’homogénéisation par ultrasons.

Isolement du virus de la variole du singe chez des macaques vaccinés :

Les échantillons ont subi trois cycles de congélation-décongélation, puis ont été soniqués dans un CupHorn à ultrasons. Deux dilutions (1:10 et 1:100) dans un milieu de transport supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal ont été utilisées pour inoculer des monocouches de cellules Vero dans des plaques à six puits. Après 1 h d’incubation à 37°C, les inoculums ont été retirés et remplacés par un milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal. Les monocouches ont été cultivées pendant 5 jours à 37°C et colorées avec une solution de cristal violet.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Appareils à ultrasons pour l’analyse des virus et la production de vaccins

La vaste gamme de produits de Hielscher Ultrasonics propose l’appareil à ultrasons idéal pour les laboratoires de recherche et d’analyse ainsi que pour la fabrication industrielle de vaccins.
Hielscher Ultrasonics est spécialisé dans la conception, la fabrication et la distribution d’appareils à ultrasons haute performance et de sonobioréacteurs destinés aux laboratoires de recherche et d’analyse ainsi qu’à leur mise en œuvre dans la production industrielle de vaccins (par exemple, vaccins, principes actifs pharmaceutiques).
La sonication peut être appliquée dans des récipients ouverts, des réacteurs fermés à agitation continue et des réacteurs traversés par un flux continu. Toutes les pièces des systèmes à ultrasons qui entrent en contact avec le milieu liquide sont en acier inoxydable, en titane ou en verre. Les pièces autoclavables et les raccords sanitaires garantissent une production dans des conditions de qualité pharmaceutique.
Enregistrement automatique des données : Un logiciel intelligent enregistre automatiquement les paramètres du processus de sonication sur la carte mémoire SD intégrée. Le contrôle précis de tous les paramètres du processus garantit la reproductibilité, la standardisation de la production, et facilite le respect des normes de sécurité des produits pharmaceutiques.
Les processeurs à ultrasons de Hielscher Ultrasonics sont très fiables et peuvent être contrôlés avec précision. Tous les appareils à ultrasons industriels peuvent être réglés pour couvrir toute la plage d’amplitudes, des plus faibles aux très élevées. La robustesse des systèmes à ultrasons de Hielscher permet un fonctionnement 24/7 sous forte sollicitation et dans des environnements exigeants.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité approximative de traitement de nos appareils à ultrasons :