Applications ultrasoniques dans le virus MonkeyPox

L'ultrasonication est une méthode de traitement importante pour l'isolement du virus de la variole du singe (MPXV) à partir d'échantillons analytiques, pour la fragmentation de l'ADN du virus ainsi que pour la fabrication de vaccins contre la variole du singe. Pour la préparation des échantillons avant les diagnostics et les analyses (PCR, ELISA, etc.), l'ultrasonication est utilisée pour lyser les cellules afin de libérer le virus de la variole du singe de l'intérieur des cellules et/ou de fragmenter l'ADN. Dans la production de vaccins, les applications vont de la préparation des particules virales et de l'ADN à l'encapsulation dans des vecteurs médicamenteux et à la formulation des inocula.
Vous trouverez ci-dessous des informations détaillées sur la préparation par ultrasons d'échantillons de virus de la variole du singe ainsi que sur la production de vaccins MPXV assistée par ultrasons.

 

Ce que vous trouverez sur cette page :

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Les ultrasons à haute performance sont un outil de traitement essentiel dans la production de nombreux vaccins.

Ce système composé de 2 ultrasons de 1 kW fonctionnant en continu est installé dans une usine de production de vaccins.

Lyse par ultrasons et fragmentation de l'ADN avant la réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Une infection par le virus du monkeypox est détectée par un test d'amplification de l'acide nucléique (TAAN), utilisant une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel ou conventionnelle, pour la détection de séquences uniques d'ADN viral. L'échantillon (provenant par exemple de prélèvements nasopharyngés ou de biopsies cutanées) contient le virus dans les cellules.
Pour l'analyse, le virus doit être libéré des cellules et l'ADN viral doit être fragmenté pour la PCR.

Lysis par ultrasons :

Ultrasonicator UP200Ht avec micropointe S26d2 pour la lyse ultrasonique des échantillons biologiquesLa désintégration/lyse cellulaire par ultrasons est une méthode fiable et efficace pour isoler les virus à partir d'échantillons cellulaires et, de ce fait, une technique préférable aux agents chimiques, tels que le lysozyme, la protéinase K et différents détergents qui sont utilisés alternativement pour obtenir la lyse cellulaire et la libération de l'ADN.
Cependant, l'utilisation de ces réactifs chimiques nécessite une préparation fastidieuse de l'échantillon en plusieurs étapes avant l'analyse PCR pour éviter l'inhibition de la réaction PCR. Comme les inhibiteurs de la PCR affectent l'efficacité de l'amplification, de petites variations de la quantité d'inhibiteurs qui ne sont pas éliminés peuvent entraîner de grandes variations dans l'amplification du produit de la PCR (Diaco, 1995).
L'avantage de l'ultrasonication pour la lyse est qu'elle permet une perturbation complète des structures cellulaires et la libération de l'ADN sans nécessiter de réactifs de lyse ni de préparation fastidieuse de l'échantillon. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentation de l'ADN par ultrasons :

La fragmentation de l'ADN par ultrasons est simple et fiable car elle produit des fragments d'ADN dont la longueur est réglable (paires de bases, bp). Grâce aux ultrasons, l'ADN peut être fragmenté efficacement à la longueur ciblée. Un contrôle précis des paramètres ultrasoniques et des options de refroidissement sophistiquées empêchent la dégradation de l'ADN.
En savoir plus sur la fragmentation de l'ADN par ultrasons !

 

La vidéo montre le système de préparation d'échantillons par ultrasons UIP400MTP, qui permet la préparation fiable d'échantillons sur n'importe quelle plaque multi-puits standard en utilisant des ultrasons de haute intensité. Les applications typiques de l'UIP400MTP comprennent la lyse cellulaire, le cisaillement de l'ADN, de l'ARN et de la chromatine ainsi que l'extraction de protéines.

Ultrasonateur UIP400MTP pour la sonication de plaques multi-puits

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Applications ultrasoniques dans le vaccin contre le virus de la variole du singe

L'ultrasonication est utilisée pour produire des vaccins tels que les vaccins contre la variole du singe. Les vaccins utilisés contre le virus du monkeypox sont actuellement des vaccins à virus vivants. Les vaccins nouvellement développés pourraient utiliser d'autres plates-formes, telles que les vaccins à base d'ADN. Le vaccin contient actuellement un virus Vaccinia Ankara modifié, un orthopoxvirus atténué qui ne se reproduit pas. Il contient également du Tris (tris-aminométhane) et du chlorure de sodium. Le vaccin peut également contenir de petites quantités d'ADN et de protéines provenant de cellules fibroblastes d'embryon de poulet, qui sont utilisées pour cultiver le virus du vaccin, de la benzonase et des composés antibiotiques tels que la gentamicine et la ciprofloxacine.

L'homogénéisation par ultrasons est utilisée dans la production de vaccins à virus vivants atténués, de vaccins à ADN, de cocktails d'ADN multivalents, de vaccins à ARNm, de vaccins à protéines recombinantes, de vaccins à particules de type viral, etc.

Les applications des ultrasons dans la production de vaccins sont les suivantes

  • la dispersion de particules et d'agents viraux
  • émulsification
  • l'inactivation des virus
  • formulation du support du médicament (NLC, SLN)
  • Encapsulation
  • dissolution des agents
  • préparation d'adjuvants
  • Dégazage / Désaération

 

Vous pouvez trouver des informations plus approfondies sur les applications ultrasoniques pour améliorer la fabrication des vaccins !

Protocole d'isolement par ultrasons du virus de la variole du singe

L'équipe de recherche de Stittelaar (2005) a utilisé la lyse par ultrasons pour libérer le virus de la variole du singe de la culture cellulaire de l'hôte de croissance ainsi que des cellules obtenues par échange de gorge de primates infectés.

Préparation du vaccin contre la variole du singe :

Les virus de la variole du singe ont été cultivés sur des cellules de fibroblastes d'embryon de poulet exemptes de pathogènes spécifiques. Après une incubation de 1 à 2 jours, la suspension de cellules virales a été récoltée par un cycle de congélation-décongélation, puis concentrée par centrifugation. Le culot a été remis en suspension et soumis à plusieurs cycles d'homogénéisation par ultrasons.

Isolement du virus de la variole du singe à partir de macaques vaccinés :

Les échantillons ont été congelés-décongelés trois fois et soniqués dans un CupHorn à ultrasons. Deux dilutions (1:10 et 1:100) dans un milieu de transport supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal ont été utilisées pour inoculer des monocouches de cellules Vero dans des plaques à six puits. Après 1 h d'incubation à 37°C, les inocula ont été retirés et remplacés par du milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal. Les monocouches ont été cultivées pendant 5 jours à 37°C et colorées avec une solution de cristal violet.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Dans cette vidéo, nous vous montrons un système à ultrasons de 2 kilowatts pour un fonctionnement en ligne dans une armoire purgeable. Hielscher fournit des équipements à ultrasons à presque toutes les industries, telles que l'industrie chimique, pharmaceutique, cosmétique, les processus pétrochimiques ainsi que les processus d'extraction à base de solvants. Cette armoire purgeable en acier inoxydable est conçue pour fonctionner dans des zones dangereuses. À cette fin, l'armoire scellée peut être purgée par le client avec de l'azote ou de l'air frais pour empêcher les gaz ou les vapeurs inflammables de pénétrer dans l'armoire.

Ultrasons 2x 1000 Watts dans une armoire purgeable pour l'installation dans des zones dangereuses

Ultrasons pour l'analyse des virus et la production de vaccins

La vaste gamme de produits de Hielscher Ultrasons offre l'ultrasoniseur idéal pour les laboratoires de recherche et d'analyse ainsi que pour la fabrication industrielle de vaccins.
Hielscher Ultrasonics est spécialisée dans la conception, la fabrication et la distribution d'ultrasons et de sonobioréacteurs de haute performance destinés à être utilisés dans les laboratoires de recherche et d'analyse ainsi qu'à être mis en œuvre dans la production industrielle de vaccins (par ex. vaccins, API).
Contrôle précis des paramètres du processus ultrasonore par Hielscher Ultrasonics' logiciels intelligentsLa sonication peut être appliquée aux cuves ouvertes, aux réacteurs fermés à agitation continue et aux réacteurs à flux continu. Toutes les pièces des systèmes à ultrasons, qui entrent en contact avec le milieu liquide, sont fabriquées en acier inoxydable, en titane ou en verre. Les pièces autoclavables et les raccords sanitaires garantissent une production dans des conditions normales. conditions de qualité pharmaceutique.
Enregistrement automatique des données : Un logiciel intelligent enregistre automatiquement les paramètres du processus de sonication sur la carte mémoire SD intégrée. Le contrôle précis de tous les paramètres du processus permet de s'assurer que reproductibilité, normalisation de la productionet facilite le respect des normes de sécurité des produits pharmaceutiques.
Hielscher Ultrasonics’ Les processeurs à ultrasons sont très fiables et peuvent être contrôlés avec précision. Tous les ultrasons industriels peuvent être réglés pour délivrer la gamme complète des amplitudes, des plus faibles aux plus élevées. La robustesse des systèmes à ultrasons Hielscher leur permet de fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, dans des conditions de travail difficiles et dans des environnements exigeants.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators:

lot Volume Débit Appareils recommandés
plaques multi-puits / microtitres s/o UIP400MTP
1 à 500 ml 10 à 200 ml / min UP100H
10 à 2000mL 20 à 400 ml / min UP200Ht, UP400St
0.1 20L 00,2 à 4L / min UIP2000hdT
10 à 100l 2 à 10 L / min UIP4000hdT
s/o 10 à 100 litres / min UIP16000
s/o plus grand groupe de UIP16000

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Les homogénéisateurs à ultrasons sont fiables pour le cisaillement de l'ADN

ADN par ultrasons Shearing
Adapté de Jkwchui sous CC-BY-SA.03



Littérature / Références

  • Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
  • Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidovudine in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
  • J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
  • Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
  • Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.

Qu'il faut savoir

Virus de la variole du singe

Le monkeypox (MPV, MPXV ou hMPXV) est une espèce de virus à ADN double brin, qui provoque une zoonose virale. Cette maladie est connue sous le nom d'infection par le virus de la variole du singe et peut survenir chez l'homme et les animaux. Il appartient au genre Orthopoxvirus de la famille des Poxviridae. Le virus du monkeypox est l'un des orthopoxvirus humains avec les virus de la variole (VARV), de la cowpox (CPX) et de la vaccine (VACV). Les orthopoxvirus sont caractérisés par de grandes particules virales en forme de brique, contenant un génome d'ADN double brin d'environ 200 000 pb.

Test ELISA

ELISA est l'abréviation de Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (test immunologique lié à l'enzyme). Il s'agit d'un test immunologique marqué qui est considéré comme l'étalon-or des tests immunologiques. ELISA est un test immunologique, apprécié pour sa grande sensibilité diagnostique, est utilisé pour détecter et quantifier des molécules, notamment des anticorps, des antigènes, des protéines, des glycoprotéines et des hormones. Le principe du test ELISA est basé sur une interaction antigène-anticorps. Par cette interaction antigène-anticorps, les anticorps spécifiques se lient à son antigène cible. Ce n'est que lorsque l'interaction a lieu que le substrat peut se lier à l'enzyme et qu'une conversion ultérieure du substrat peut être observée, ce qui signifie qu'un résultat positif est obtenu.


Des ultrasons de haute performance ! La gamme de produits Hielscher couvre l'ensemble du spectre, depuis les ultrasons compacts de laboratoire jusqu'aux systèmes ultrasoniques industriels complets, en passant par les unités de paillasse.

Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons de haute performance à partir d'une technologie de pointe. laboratoires à taille industrielle.