L'ultrasonication est une méthode de traitement importante pour l'isolement du virus de la variole du singe (MPXV) à partir d'échantillons analytiques, pour la fragmentation de l'ADN du virus ainsi que pour la fabrication de vaccins contre la variole du singe. Pour la préparation des échantillons avant les diagnostics et les analyses (PCR, ELISA, etc.), l'ultrasonication est utilisée pour lyser les cellules afin de libérer le virus de la variole du singe de l'intérieur des cellules et/ou de fragmenter l'ADN. Dans la production de vaccins, les applications vont de la préparation des particules virales et de l'ADN à l'encapsulation dans des vecteurs médicamenteux et à la formulation des inocula.
Vous trouverez ci-dessous des informations détaillées sur la préparation par ultrasons d'échantillons de virus de la variole du singe ainsi que sur la production de vaccins MPXV assistée par ultrasons.

Ce que vous trouverez sur cette page :

• Lysis ultrasonique pour l'extraction du virus de la variole du singe
• Fragmentation ultrasonique de l'ADN du virus de la variole du singe
• Applications ultrasoniques dans la production de vaccins MPXV

Lyse par ultrasons et fragmentation de l'ADN avant la réaction en chaîne par polymérase (PCR)

Une infection par le virus du monkeypox est détectée par un test d'amplification de l'acide nucléique (TAAN), utilisant une réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel ou conventionnelle, pour la détection de séquences uniques d'ADN viral. L'échantillon (provenant par exemple de prélèvements nasopharyngés ou de biopsies cutanées) contient le virus dans les cellules.
Pour l'analyse, le virus doit être libéré des cellules et l'ADN viral doit être fragmenté pour la PCR.

Lysis par ultrasons :

La désintégration/lyse cellulaire par ultrasons est une méthode fiable et efficace pour isoler les virus à partir d'échantillons cellulaires et, de ce fait, une technique préférable aux agents chimiques, tels que le lysozyme, la protéinase K et différents détergents qui sont utilisés alternativement pour obtenir la lyse cellulaire et la libération de l'ADN.
Cependant, l'utilisation de ces réactifs chimiques nécessite une préparation fastidieuse de l'échantillon en plusieurs étapes avant l'analyse PCR pour éviter l'inhibition de la réaction PCR. Comme les inhibiteurs de la PCR affectent l'efficacité de l'amplification, de petites variations de la quantité d'inhibiteurs qui ne sont pas éliminés peuvent entraîner de grandes variations dans l'amplification du produit de la PCR (Diaco, 1995).
L'avantage de l'ultrasonication pour la lyse est qu'elle permet une perturbation complète des structures cellulaires et la libération de l'ADN sans nécessiter de réactifs de lyse ni de préparation fastidieuse de l'échantillon. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentation de l'ADN par ultrasons :

La fragmentation de l'ADN par ultrasons est simple et fiable car elle produit des fragments d'ADN dont la longueur est réglable (paires de bases, bp). Grâce aux ultrasons, l'ADN peut être fragmenté efficacement à la longueur ciblée. Un contrôle précis des paramètres ultrasoniques et des options de refroidissement sophistiquées empêchent la dégradation de l'ADN.
En savoir plus sur la fragmentation de l'ADN par ultrasons !

Applications ultrasoniques dans le vaccin contre le virus de la variole du singe

Les vaccins utilisés contre le virus du monkeypox sont actuellement des vaccins à virus vivants. Les vaccins nouvellement développés pourraient utiliser d'autres plates-formes, telles que les vaccins à base d'ADN. Le vaccin contient actuellement un virus Vaccinia Ankara modifié, un orthopoxvirus atténué qui ne se reproduit pas. Il contient également du Tris (tris-aminométhane) et du chlorure de sodium. Le vaccin peut également contenir de petites quantités d'ADN et de protéines provenant de cellules fibroblastes d'embryon de poulet, qui sont utilisées pour cultiver le virus du vaccin, de la benzonase et des composés antibiotiques tels que la gentamicine et la ciprofloxacine.

L'homogénéisation par ultrasons est utilisée dans la production de vaccins à virus vivants atténués, de vaccins à ADN, de cocktails d'ADN multivalents, de vaccins à ARNm, de vaccins à protéines recombinantes, de vaccins à particules de type viral, etc.

Vous pouvez trouver des informations plus approfondies sur les applications ultrasoniques pour améliorer la fabrication des vaccins !

Protocole d'isolement par ultrasons du virus de la variole du singe

L'équipe de recherche de Stittelaar (2005) a utilisé la lyse par ultrasons pour libérer le virus de la variole du singe de la culture cellulaire de l'hôte de croissance ainsi que des cellules obtenues par échange de gorge de primates infectés.

Préparation du vaccin contre la variole du singe :

Les virus de la variole du singe ont été cultivés sur des cellules de fibroblastes d'embryon de poulet exemptes de pathogènes spécifiques. Après une incubation de 1 à 2 jours, la suspension de cellules virales a été récoltée par un cycle de congélation-décongélation, puis concentrée par centrifugation. Le culot a été remis en suspension et soumis à plusieurs cycles d'homogénéisation par ultrasons.

Isolement du virus de la variole du singe à partir de macaques vaccinés :

Les échantillons ont été congelés-décongelés trois fois et soniqués dans un CupHorn à ultrasons. Deux dilutions (1:10 et 1:100) dans un milieu de transport supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal ont été utilisées pour inoculer des monocouches de cellules Vero dans des plaques à six puits. Après 1 h d'incubation à 37°C, les inocula ont été retirés et remplacés par du milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal. Les monocouches ont été cultivées pendant 5 jours à 37°C et colorées avec une solution de cristal violet.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultrasons pour l'analyse des virus et la production de vaccins

La vaste gamme de produits de Hielscher Ultrasons offre l'ultrasoniseur idéal pour les laboratoires de recherche et d'analyse ainsi que pour la fabrication industrielle de vaccins.
Hielscher Ultrasonics est spécialisée dans la conception, la fabrication et la distribution d'ultrasons et de sonobioréacteurs de haute performance destinés à être utilisés dans les laboratoires de recherche et d'analyse ainsi qu'à être mis en œuvre dans la production industrielle de vaccins (par ex. vaccins, API).
La sonication peut être appliquée aux cuves ouvertes, aux réacteurs fermés à agitation continue et aux réacteurs à flux continu. Toutes les pièces des systèmes à ultrasons, qui entrent en contact avec le milieu liquide, sont fabriquées en acier inoxydable, en titane ou en verre. Les pièces autoclavables et les raccords sanitaires garantissent une production dans des conditions normales. conditions de qualité pharmaceutique.
Enregistrement automatique des données : Un logiciel intelligent enregistre automatiquement les paramètres du processus de sonication sur la carte mémoire SD intégrée. Le contrôle précis de tous les paramètres du processus permet de s'assurer que reproductibilité, normalisation de la productionet facilite le respect des normes de sécurité des produits pharmaceutiques.
Hielscher Ultrasonics’ Les processeurs à ultrasons sont très fiables et peuvent être contrôlés avec précision. Tous les ultrasons industriels peuvent être réglés pour délivrer la gamme complète des amplitudes, des plus faibles aux plus élevées. La robustesse des systèmes à ultrasons Hielscher leur permet de fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, dans des conditions de travail difficiles et dans des environnements exigeants.

Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasonicators: