Applications ultrasoniques dans le virus MonkeyPox
L'ultrasonication est une méthode de traitement importante pour l'isolement du virus de la variole du singe (MPXV) à partir d'échantillons analytiques, pour la fragmentation de l'ADN du virus ainsi que pour la fabrication de vaccins contre la variole du singe. Pour la préparation des échantillons avant les diagnostics et les analyses (PCR, ELISA, etc.), l'ultrasonication est utilisée pour lyser les cellules afin de libérer le virus de la variole du singe de l'intérieur des cellules et/ou de fragmenter l'ADN. Dans la production de vaccins, les applications vont de la préparation des particules virales et de l'ADN à l'encapsulation dans des vecteurs médicamenteux et à la formulation des inocula.
Vous trouverez ci-dessous des informations détaillées sur la préparation d'échantillons du virus de la variole du singe par ultrasons ainsi que sur la production de vaccins MPXV assistée par ultrasons.
Ce que vous trouverez sur cette page :
- Lyse ultrasonique pour l'extraction du virus de la variole du singe
- Fragmentation ultrasonique de l'ADN du virus de la variole du singe
- Applications ultrasoniques dans la production du vaccin MPXV
Ce système composé de deux ultrasons de 1 kW fonctionnant en flux continu est installé dans une usine de production de vaccins.
Lyse ultrasonique et fragmentation de l'ADN avant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR)
Une infection par le virus de la variole du singe est détectée par un test d'amplification de l'acide nucléique (TAAN), utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel ou conventionnelle, pour détecter des séquences uniques d'ADN viral. L'échantillon (provenant par exemple d'un swap nasopharyngé ou de biopsies cutanées) contient le virus dans des cellules.
Pour l'analyse, le virus doit être libéré des cellules et l'ADN viral doit être fragmenté pour la PCR.
Lyse ultrasonique :
La désintégration / lyse cellulaire par ultrasons est une méthode fiable et efficace pour isoler les virus à partir d'échantillons cellulaires et constitue donc une technique préférable aux agents chimiques, tels que le lysozyme, la protéinase K et différents détergents, qui sont utilisés alternativement pour obtenir la lyse cellulaire et la libération de l'ADN.
Toutefois, l'utilisation de ces réactifs chimiques nécessite une préparation longue de l'échantillon en plusieurs étapes avant l'analyse PCR afin d'éviter l'inhibition de la réaction PCR. Étant donné que les inhibiteurs de la PCR affectent l'efficacité de l'amplification, de petites variations de la quantité d'inhibiteurs qui ne sont pas éliminés peuvent entraîner de grandes variations dans l'amplification du produit de la PCR (Diaco, 1995).
L'avantage de l'ultrasonication pour la lyse est qu'il est souhaitable d'obtenir une rupture complète des structures cellulaires et la libération de l'ADN sans avoir recours à des réactifs de lyse et à une préparation d'échantillon fastidieuse. (cf. Fykse et al., 2003)
Fragmentation ultrasonique de l'ADN :
La fragmentation ultrasonique de l'ADN est simple et fiable, car elle produit des fragments d'ADN dont la longueur est réglable (paires de bases, pb). Les ultrasons permettent de fragmenter efficacement l'ADN à la longueur voulue. Un contrôle précis des paramètres ultrasoniques et des options de refroidissement sophistiquées empêchent la dégradation de l'ADN.
En savoir plus sur la fragmentation de l'ADN par ultrasons !
Applications ultrasoniques dans le vaccin contre le virus de la variole du singe
Les vaccins utilisés contre le virus de la variole du singe sont actuellement des vaccins à virus vivant. Les vaccins nouvellement développés pourraient utiliser d'autres plates-formes, telles que celles basées sur l'ADN. Il contient également du Tris (tris-aminométhane) et du chlorure de sodium. Le vaccin peut également contenir de petites quantités d'ADN et de protéines provenant de cellules de fibroblastes d'embryons de poulet, qui sont utilisées pour cultiver le virus du vaccin, de la benzonase et des composés antibiotiques tels que la gentamicine et la ciprofloxacine.
L'homogénéisation par ultrasons est utilisée dans la production de vaccins à virus vivants atténués, de vaccins à ADN, de cocktails d'ADN multivalents, de vaccins à ARNm, de vaccins à protéines recombinantes, de vaccins à particules apparentées à des virus, etc.
- dispersion de particules et d'agents viraux
- émulsification
- inactivation des virus
- la formulation du vecteur médicamenteux (NLC, SLN)
- encapsulation
- dissolution des agents
- préparation d'adjuvants
- Dégazage / Désaération
Protocole d'isolement ultrasonique du virus de la variole du singe
L'équipe de recherche de Stittelaar (2005) a utilisé la lyse ultrasonique pour libérer le virus de la variole du singe de la culture cellulaire de l'hôte de croissance ainsi que des cellules obtenues par échange de gorge de primates infectés.
Préparation du vaccin contre la variole du singe :
Les virus de la variole du singe ont été cultivés sur des cellules de fibroblastes d'embryons de poulet exempts de pathogènes spécifiques. Après une incubation de 1 à 2 jours, la suspension de cellules virales a été récoltée par un cycle de congélation-décongélation, puis concentrée par centrifugation. Le culot a été remis en suspension et soumis à plusieurs cycles d'homogénéisation par ultrasons.
Isolement du virus de la variole du singe chez des macaques vaccinés :
Les échantillons ont été congelés-décongelés trois fois et sonifiés dans un CupHorn à ultrasons. Deux dilutions (1:10 et 1:100) dans un milieu de transport supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal ont été utilisées pour inoculer des monocouches de cellules Vero dans des plaques à six puits. Après 1 heure d'incubation à 37°C, les inocula ont été enlevés et remplacés par du milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum bovin fœtal. Les monocouches ont été cultivées pendant 5 jours à 37°C et colorées avec une solution de cristal violet.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasons pour l'analyse des virus et la production de vaccins
La large gamme de produits Hielscher Ultrasonics offre l'ultrasoniseur idéal pour les laboratoires de recherche et d'analyse ainsi que pour la fabrication industrielle de vaccins.
Hielscher Ultrasonics est spécialisée dans la conception, la fabrication et la distribution d'ultrasons et de bioréacteurs soniques de haute performance destinés aux laboratoires de recherche et d'analyse ainsi qu'à la production industrielle de vaccins (par ex. vaccins, API).
La sonication peut être appliquée à des cuves ouvertes, à des réacteurs fermés à agitation continue et à des réacteurs à écoulement continu. Toutes les pièces des systèmes à ultrasons qui entrent en contact avec le milieu liquide sont fabriquées en acier inoxydable, en titane ou en verre. Les pièces autoclavables et les raccords sanitaires garantissent une production dans le respect des normes internationales. des conditions de qualité pharmaceutique.
Enregistrement automatique des données : Un logiciel intelligent enregistre automatiquement les paramètres du processus de sonication sur la carte mémoire SD intégrée. Le contrôle précis de tous les paramètres du processus garantit la Reproductibilité, la standardisation de la productionet facilite le respect des normes de sécurité des produits pharmaceutiques.
Hielscher Ultrasonics’ Les processeurs à ultrasons sont très fiables et peuvent être contrôlés avec précision. Tous les appareils industriels à ultrasons peuvent être réglés pour fournir une gamme complète d'amplitudes, des plus faibles aux plus élevées. La robustesse des systèmes à ultrasons de Hielscher leur permet de fonctionner 24 heures sur 24, 7 jours sur 7, dans des conditions difficiles et dans des environnements exigeants.
Le tableau ci-dessous vous donne une indication de la capacité de traitement approximative de nos ultrasons :
| Volume du lot | Débit | Dispositifs recommandés |
|---|---|---|
| plaques multi-puits / microtitres | s/o | UIP400MTP |
| 1 à 500mL | 10 à 200mL/min | UP100H |
| 10 à 2000mL | 20 à 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 à 20L | 0.2 à 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 à 100L | 2 à 10L/min | UIP4000hdT |
| s/o | 10 à 100L/min | UIP16000 |
| s/o | plus grande | groupe de UIP16000 |
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Cisaillement ultrasonique de l'ADN
Adapté de Jkwchui sous CC-BY-SA.03
Littérature / Références
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Qu'il faut savoir
Virus de la variole du singe
La variole du singe (MPV, MPXV ou hMPXV) est une espèce de virus à ADN double brin qui provoque une zoonose virale. Cette maladie est connue sous le nom d'infection à la variole du singe et peut survenir chez l'homme et l'animal. Il appartient au genre Orthopoxvirus de la famille des Poxviridae. Le virus de la variole du singe est l'un des orthopoxvirus humains avec les virus de la variole (VARV), de la variole de la vache (CPX) et de la vaccine (VACV). Les orthopoxvirus se caractérisent par de grandes particules virales en forme de brique, contenant un génome d'ADN double brin d'environ 200 000 pb.
Test ELISA
ELISA signifie Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay et est un test immunologique marqué qui est considéré comme l'étalon-or des tests immunologiques. ELISA est un test immunologique, apprécié pour sa grande sensibilité diagnostique, utilisé pour détecter et quantifier des molécules, notamment des anticorps, des antigènes, des protéines, des glycoprotéines et des hormones. Le principe de l'ELISA est basé sur une interaction antigène-anticorps. Par cette interaction antigène-anticorps, les anticorps spécifiques se lient à leur antigène cible. Ce n'est que lorsque l'interaction a lieu que le substrat peut se lier à l'enzyme et qu'une conversion subséquente du substrat peut être observée, ce qui signifie qu'un résultat positif est obtenu.
Hielscher Ultrasonics fabrique des homogénéisateurs à ultrasons très performants à partir de laboratoires à taille industrielle.