Fremstilling af liposomer med ultralyd

Liposomer fremstillet med ultralyd udviser en meget høj indkapslingseffektivitet, høj kapacitet for optagelse af aktive stoffer og en ensartet lille, kugleformet størrelse. Dermed giver ultralydsfremstillede liposomer fremragende biotilgængelighed. Hielscher Ultrasonics tilbyder ultralydsapparater til pålidelig fremstilling af liposomer af farmaceutisk kvalitet i batchdrift og kontinuerlig drift.

Fordele ved fremstilling af liposomer med ultralyd

Liposomindkapsling med ultralyd er en teknik, der bruges til at indkapsle lægemidler eller andre terapeutiske stoffer i liposomer ved hjælp af ultralydsenergi. Sammenlignet med andre metoder til liposomindkapsling har indkapsling med ultralyd flere fordele, der gør den til den overlegne fremstillingsteknik.

• Højt indhold af aktive stoffer, høj indkapslingseffektivitet: Fremstilling af liposomer med ultralyd er kendt for at give liposomer med et højt indhold af aktive stoffer, f.eks. C-vitamin, lægemiddelmolekyler osv. Samtidig udviser sonikeringsmetoden en høj indkapslingseffektivitet. Det betyder, at en høj procentdel af det aktive stof indkapsles ved ultralydsbehandling. Samlet set gør dette ultralydsbehandling til en meget effektiv metode til fremstilling af liposomer.
• Ensartet små liposomer: En fordel ved liposomindkapsling med ultralyd er dens evne til at fremstille meget ensartede liposomer med en snæver størrelsesfordeling. Ultralydsenergi kan bruges til at nedbryde større liposomer eller lipidaggregater til mindre, mere ensartede liposomer. Det giver større ensartethed i liposomernes størrelse og form, hvilket kan være vigtigt ved lægemiddellevering, hvor partiklernes størrelse kan påvirke deres farmakokinetik og virkning.
• Kan anvendes til alle molekyler: En anden fordel ved liposomindkapsling med ultralyd er dens evne til at indkapsle en bred vifte af lægemidler og andre terapeutiske stoffer. Teknikken kan bruges til at indkapsle både hydrofile og hydrofobe lægemidler, hvilket kan være vanskeligt med andre metoder. Desuden kan ultralydsenergi bruges til at indkapsle makromolekyler og nanopartikler, som kan være for store til at blive indkapslet med andre metoder.
• Hurtig og pålidelig: Liposomindkapsling med ultralyd er også en forholdsvis enkel og hurtig proces. Den kræver ikke brug af aggressive kemikalier eller høje temperaturer, som kan skade de terapeutiske stoffer, der indkapsles.
• Opskalering: Desuden kan teknikken nemt opskaleres til produktion i stor skala, hvilket gør den til en omkostningseffektiv mulighed til lægemiddellevering.

Sammenfattende er liposomindkapsling med ultralyd en overlegen teknik til liposomindkapsling på grund af dens evne til at fremstille ensartede liposomer med en snæver størrelsesfordeling og indkapsle en bred vifte af terapeutiske stoffer samt dens enkelhed og skalerbarhed.

Efter dannelsen af en lipidfilm og efterfølgende rehydrering bruges sonikering til at fremme indkapslingen af aktive stoffer i liposomet. Desuden opnås den ønskede liposomstørrelse ved sonikering.

Fremstilling af liposomer med ultralyd til lægemidler og kosmetik

Liposomer (lipidbaserede vesikler), transferosomer (ultradeformerbare liposomer), ethosomer (ultradeformerbare vesikler med højt alkoholindhold) og niosomer (syntetiske vesikler) er mikroskopiske vesikler, der kan fremstilles kunstigt som kugleformede bærere, hvori aktive molekyler kan indkapsles. Disse vesikler med diametre mellem 25 og 5000 nm bruges ofte som lægemiddelbærere i den farmaceutiske og kosmetiske industri, f.eks. til oral eller topikal lægemiddellevering, genterapi og immunisering. Ultralydsbehandling er en videnskabeligt dokumenteret metode til meget effektiv fremstilling af liposomer. Hielschers ultralydsapparater fremstiller liposomer med et højt indhold af aktive stoffer og overlegen biotilgængelighed.

Liposomer og liposomal formulering

Liposomer er unilamellære, oligolamellære eller multilamellære vesikulære systemer og består af det samme materiale som en cellemembran (lipiddobbeltlag). Med hensyn til sammensætning og størrelse skelnes der mellem følgende liposomer:

• multilamellære vesikler (MLV, 0,1–10μm)
• små unilamellære vesikler (SUV, <100 nm)
• store unilamellære vesikler (LUV, 100–500 nm)
• kæmpestore unilamellære vesikler (GUV, ≥1 μm)

Liposomernes hovedstruktur består af fosfolipider. Fosfolipider har en hydrofil hovedgruppe og en hydrofob halegruppe, som består af en lang kulbrintekæde.
Liposommembranen har en sammensætning, der minder meget om hudbarrierens, så liposomerne nemt kan integreres i menneskets hud. Når liposomerne fusionerer med huden, kan de frigive de indkapslede stoffer direkte på bestemmelsesstedet, hvor de aktive stoffer kan udføre deres funktioner. Dermed øger liposomerne hudens gennemtrængelighed/permeabilitet for de indkapslede farmaceutiske og kosmetiske stoffer. Også liposomer uden indkapslede stoffer, de tomme vesikler, er potente aktive stoffer for huden, da “phosphatidylcholin” indeholder to essentielle komponenter, som den menneskelige organisme ikke selv kan producere: linolsyre og cholin.
Liposomer bruges som biokompatible bærere af lægemidler, peptider, proteiner, “plasmic DNA”, antisense-oligonukleotider eller ribozymer til farmaceutiske, kosmetiske og biokemiske formål. Den enorme variation i partikelstørrelse og i lipidernes fysiske parametre giver et attraktivt potentiale for at konstruere skræddersyede bærere til en bred vifte af anvendelser. (Ulrich 2002)

Dannelse af liposomer med ultralyd

Liposomer kan dannes ved hjælp af ultralyd. Grundmaterialet til fremstilling af liposomer er “amphilic”-molekyler, der er afledt af eller baseret på biologiske membranlipider. Til dannelse af små unilamellære vesikler (SUV) sonikeres lipiddispersionen skånsomt – f.eks. med det håndholdte ultralydsapparat UP50H (50W, 30kHz), VialTweeter eller ultralydsreaktoren CupHorn – i et isbad. En sådan ultralydsbehandling varer ca. 5 – 15 minutter. En anden metode til fremstilling af små unilamellære vesikler er sonikering af multilamellære liposomvesikler.
Dinu-Pirvu et al. (2010) beskriver fremstilling af transferosomer ved sonikering af MLV ved stuetemperatur.
Hielscher Ultrasonics tilbyder forskellige ultralydsapparater, sonotroder og tilbehør og kan dermed levere den bedst egnede ultralydsopsætning til meget effektiv liposomindkapsling i enhver skala.

Indkapsling af aktive stoffer i liposomer med ultralyd

Liposomer fungerer som bærere for aktive stoffer såsom vitaminer, terapeutiske molekyler, peptider osv. Ultralyd er et effektivt redskab til at fremstille og danne liposomer til indkapsling af aktive stoffer. Samtidig understøtter sonikering indkapslingsprocessen, så der fremstilles liposomer med et højt indhold af aktive stoffer. Før indkapslingen har liposomerne tendens til at danne klynger på grund af vekselvirkningen mellem overfladeladningerne på fosfolipidernes polære hoveder (jf. Míckova et al. 2008), og desuden skal de åbnes. Som eksempel beskriver Zhu et al. (2003) indkapsling af biotinpulver i liposomer ved ultralydsbehandling. Da biotinpulveret blev tilsat vesikelsuspensionen, blev opløsningen sonikeret. Efter denne behandling var biotin indkapslet i liposomerne.
Læs mere om indkapsling af GLP-1 “peptrides” (f.eks. semaglutid) i liposomer med ultralyd!

Liposomale emulsioner med ultralydsbehandling

For at øge den plejende virkning af fugtgivende cremer eller cremer mod hudens aldring, lotioner, geler og andre kosmeceutiske formuleringer tilsættes emulgatorer til de liposomale dispersioner for at stabilisere større mængder lipider. Undersøgelser har imidlertid vist, at liposomernes kapacitet generelt er begrænset. Ved tilsætning af emulgatorer vil denne effekt optræde tidligere, og de yderligere emulgatorer svækker fosfatidylcholins affinitet til hudbarrieren. Nanopartikler – sammensat af fosfatidylcholin og lipider – er svaret på dette problem. Disse nanopartikler dannes af en oliedråbe, der er dækket af et monolag af fosfatidylcholin. Brugen af nanopartikler muliggør formuleringer, der kan optage flere lipider og forblive stabile, så yderligere emulgatorer ikke er nødvendige.
Ultralydsbehandling er en dokumenteret metode til fremstilling af nanoemulsioner og nanodispersioner. Meget intensiv ultralyd leverer den effekt, der er nødvendig for at dispergere en væskefase (dispergeret fase) som små dråber i en anden fase (kontinuerlig fase). I dispergeringszonen fremkalder imploderende kavitationsbobler kraftige chokbølger i den omgivende væske og medfører dannelse af væskestråler med høj hastighed. For at stabilisere de nydannede dråber i den dispergerede fase mod koalescens tilsættes emulgatorer (overfladeaktive stoffer, tensider) og stabilisatorer til emulsionen. Da dråbernes koalescens efter opbrydningen påvirker den endelige dråbestørrelsesfordeling, bruges effektivt stabiliserende emulgatorer til at fastholde den endelige dråbestørrelsesfordeling på et niveau, der svarer til fordelingen umiddelbart efter dråbeopbrydningen i ultralydsdispergeringszonen.

Liposomale dispersioner ved hjælp af ultralydsbehandling

Liposomale dispersioner baseret på umættet “phosphatidylchlorine” har utilstrækkelig stabilitet over for oxidation. Dispersionen kan stabiliseres med antioxidanter, f.eks. et kompleks af C- og E-vitamin.
 

Dannelse af liposomer ved omvendt fasefordampning ved hjælp af sonikering

 
Ortan et al. (2002) opnåede gode resultater i deres undersøgelse af fremstilling af liposomer med æterisk olie fra Anethum graveolens ved hjælp af ultralyd. Efter sonikering var liposomernes størrelse mellem 70–150 nm og for MLV mellem 230–475 nm; disse værdier var også omtrent konstante efter 2 måneder, men steg efter 12 måneder, især i SUV-dispersionen (se histogrammerne nedenfor). Stabilitetsmålingen vedrørende tab af æterisk olie og størrelsesfordeling viste også, at de liposomale dispersioner bevarede indholdet af flygtig olie. Dette tyder på, at indkapslingen af den æteriske olie i liposomer øgede oliens stabilitet.

Ortan et al. (2009): Stabilitet af MLV- og SUV-dispersioner efter 1 år. Liposomale formuleringer blev opbevaret ved 4±1 ºC.

Hielschers ultralydsprocessorer er de ideelle apparater til anvendelser i den kosmetiske og farmaceutiske industri. Systemer bestående af flere ultralydsprocessorer på op til 16.000 watt hver giver den nødvendige kapacitet til at omsætte denne laboratorieanvendelse til en effektiv produktionsmetode til fremstilling af findispergerede emulsioner i kontinuerligt flow eller i batchdrift – med resultater, der er sammenlignelige med dem fra de bedste højtrykshomogenisatorer, der er tilgængelige i dag, såsom dyseventiler. Ud over denne høje effektivitet ved kontinuerlig emulgering kræver Hielschers ultralydsapparater meget lidt vedligeholdelse og er meget nemme at betjene og rengøre. Ultralyd understøtter faktisk rengøring og skylning. Ultralydseffekten er justerbar og kan tilpasses specifikke produkter og emulgeringskrav. Der fås også særlige gennemstrømningscellereaktorer, der opfylder de avancerede krav til CIP (rengøring på stedet) og SIP (sterilisering på stedet).

Ofte stillede spørgsmål om liposomer

Hvilke typer liposomer skelnes der mellem?

Liposomer klassificeres i forskellige typer ud fra deres størrelse og antallet af dobbeltlag, de indeholder. Disse kategorier omfatter:

• Små unilamellære vesikler (SUV): Disse er de mindste liposomer med et enkelt lipiddobbeltlag.
• Store unilamellære vesikler (LUV): Disse er større end SUV og har også et enkelt dobbeltlag.
• Multilamellære vesikler (MLV): Disse indeholder flere koncentriske dobbeltlag.
• Multivesikulære vesikler (MVV): Disse består af flere mindre vesikler inde i en større vesikel.

 
Andre specialiserede typer omfatter:

• PEGylerede liposomer: Liposomer modificeret med polyethylenglycol (PEG) for at øge stabiliteten og cirkulationstiden.
• Nanoliposomer: Meget små liposomer, der typisk bruges til målrettet lægemiddellevering.

Hvilke vesikelstrukturer kan liposomer have?

Liposomer inddeles yderligere i syv hovedtyper ud fra deres vesikelstruktur:

• Store multilamellære vesikler (MLV): Indeholder flere dobbeltlag.
• Oligolamellære vesikler (OLV): Har nogle få dobbeltlag.
• Små unilamellære vesikler (SUV): De mindste med et enkelt dobbeltlag.
• Mellemstore unilamellære vesikler (MUV): Mellemstor størrelse med et enkelt dobbeltlag.
• Store unilamellære vesikler (LUV): Større med et enkelt dobbeltlag.
• Kæmpestore unilamellære vesikler (GUV): Meget store med et enkelt dobbeltlag.
• Multivesikulære vesikler (MVV): Flere vesikler inde i en enkelt stor vesikel.

Hvad er forskellene mellem liposomer og niosomer?

Liposomer og niosomer adskiller sig hovedsageligt i deres sammensætning:
Liposomer: Fremstillet af fosfolipider med to kæder, som kan være enten neutrale eller ladede.
Niosomer: Fremstillet af uladede tensider med én kæde og kolesterol.
Begge strukturer dannes ved sonikering, som fremmer samlingen af vesikler med dobbeltlag.

Hvad er den ideelle størrelse på et liposom?

Til terapeutisk levering er den ideelle størrelse på et liposom teoretisk mellem 50 og 200 nanometer i diameter. Dette størrelsesinterval optimerer stabiliteten og biotilgængeligheden. Sonikering bruges almindeligvis til at reducere vesiklen til den ønskede størrelse.

Kan liposomer transportere hydrofile lægemidler?

Ja, liposomer kan transportere hydrofile lægemidler. De værdsættes i biomedicinske anvendelser for deres evne til at indkapsle både hydrofobe og hydrofile stoffer. Desuden har de høj biokompatibilitet og biologisk nedbrydelighed, hvilket gør dem til effektive leveringssystemer.

Hvordan fremstilles liposomer?

De mest almindelige teknikker til fremstilling af liposomer er tyndfilmsmetoden og metoden med omvendt fasefordampning.
Tyndfilmshydreringsmetoden:

1. Opløs lipider i et organisk opløsningsmiddel.
2. Fordamp opløsningsmidlet for at danne en tynd lipidfilm.
3. Hydrér filmen med en vandig opløsning ved hjælp af sonikering for at danne multilamellære vesikler.

Metoden med omvendt fasefordampning:

1. Opløs lipider i vand og ethanol.
2. Sonikér opløsningen ved 60°C i ca. 10 minutter for at danne en lipidpasta.
3. Afkøl lipidsuspensionen, og tilsæt vand eller buffer dråbevis under omrøring.
4. Hydrér suspensionen i 1 time for at danne multilamellære vesikler.
5. Reducér liposomstørrelsen ved yderligere sonikering.

Hvad er arkæosomer?

Arkæosomer er liposomer fremstillet af arkælipider, som er kendt for deres stabilitet og modstandsdygtighed over for ekstreme forhold. Disse egenskaber gør arkæosomer særligt nyttige til lægemiddellevering og vaccineudvikling i udfordrende miljøer.

Hvordan fremstilles arkæosomer?

Sonikeringsprocedure ifølge Pise (2022): Arkæosomer kan fremstilles af den polære lipidfraktion “PLF” fra Sulfolobussolfataricus ved sonikering ved 60°C uden behov for ekstern tilførsel af lipider. Ved 0°C blev polære lipider fra Sulfolobusacidocaldarius effektivt sonikeret for at danne arkæosomer. Arkæosomer med BMD og konventionelle liposomer samt arkælipider isoleret fra Archaea H. salinarum og beriget med fosfatidylcholin blev fremstillet ved hjælp af sonikeringsteknikker. Sonikerede vesikler til topikal levering blev fremstillet ved at sonikere MLV-dispersioner ved 80 procent amplitude i 4 minutter med et Hielscher UP50H sonikeringsapparat med sonde (se billedet til venstre).

Litteratur/referencer

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.