Ultrazvukové aplikace u viru opičích neštovic
Ultrazvuku je důležitou metodou zpracování pro izolaci viru opičích neštovic (MPXV) z analytických vzorků, pro fragmentaci DNA viru a také při výrobě vakcíny proti opičím neštovicím. Pro přípravu vzorku před diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atd.) se ultrazvuku používá k lýze buněk, aby se uvolnil virus opičích neštovic z vnitřku buňky a? nebo fragmentace DNA. Při výrobě vakcín se aplikace pohybují od přípravy virových částic? DNA, přes zapouzdření do nosičů léčiv až po formulaci inokuly.
Níže naleznete podrobné informace o přípravě vzorku viru opičích neštovic ultrazvukem a také o ultrazvukem asistované výrobě vakcíny MPXV.
Co najdete na této stránce:
- Ultrazvuková lýza pro extrakci viru opičích neštovic
- Ultrazvuková fragmentace DNA viru opičích neštovic
- Ultrazvukové aplikace při výrobě vakcín MPXV
Tento systém 2x 1kW ultrasonicators pro nepřetržitý průtok je instalován v zařízení na výrobu vakcín.
Ultrazvuková lýza a fragmentace DNA před polymerázovou řetězovou reakcí (PCR)
Infekce virem opičích neštovic se detekuje testováním amplifikace nukleových kyselin (NAAT) pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase nebo konvenční polymerázové řetězové reakce (PCR) pro detekci jedinečných sekvencí virové DNA. Vzorek (např. z výměny nosohltanu nebo kožní biopsie) obsahuje virus v buňkách.
Pro analýzu musí být virus uvolněn z buněk a virová DNA musí být fragmentována pro PCR.
Ultrazvuková lýza:
Ultrazvukové narušení? lýza buněk je spolehlivá a účinná metoda izolace virů z buněčných vzorků, a tím preferovaná technika před chemickými činidly, jako je lysozym, proteináza K a různé detergenty, které se alternativně používají k dosažení lýzy buněk a uvolnění DNA.
Použití takových chemických činidel však vyžaduje časově náročnou přípravu vzorku v několika krocích před analýzou PCR, aby se zabránilo inhibici PCR reakce. Vzhledem k tomu, že inhibitory PCR ovlivňují účinnost amplifikace, malé odchylky v množství inhibitorů, které nejsou odstraněny, mohou vést k velkým variacím v amplifikaci produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou ultrazvuku pro lýzu je, že je žádoucí úplné narušení buněčných struktur a uvolnění DNA bez nutnosti lýzových činidel a časově náročné přípravy vzorku. (srov. Fykse et al., 2003)
Ultrazvuková fragmentace DNA:
Ultrazvuková fragmentace DNA je jednoduchá a spolehlivá, protože produkuje fragmenty DNA laditelné na délku (páry bází, bp). Pomocí ultrazvuku lze DNA účinně fragmentovat na cílovou délku DNA. Přesná kontrola nad ultrazvukovými parametry a sofistikované možnosti chlazení zabraňují degradaci DNA.
Přečtěte si více o ultrazvukové fragmentaci DNA!
Ultrazvukové aplikace ve vakcíně proti viru opičích neštovic
Vakcíny používané proti viru opičích neštovic jsou v současné době vakcíny s živým virem. Nově vyvinuté vakcíny by mohly využívat jiné platformy, jako je DNA založené na V současné době obsahuje modifikovaný Vaccinia Ankara viurs, oslabený, nereplikující se orthopoxvirus. Obsahuje také Tris (tris-aminomethan) a chlorid sodný. Vakcína může také obsahovat malé množství DNA a proteinu z fibroblastových buněk kuřecích embryí, které se používají k růstu vakcinačního viru, benzonázy a antibiotických sloučenin, jako je gentamicin a ciprofloxacin.
Ultrazvuková homogenizace se používá při výrobě živých atenuovaných virových vakcín, DNA vakcín, vícevalentních DNA koktejlů, mRNA vakcín, rekombinantních proteinových vakcín, viru podobných částicových vakcín atd.
- disperze virových částic a agens
- Emulgace
- Inaktivace virů
- formulace lékových nosičů (NLC, SLN)
- zapouzdření
- Rozpouštění činidel
- Příprava adjuvans
- Odplyňování? odvzdušňování
Můžete najít podrobnější informace o ultrazvukových aplikacích pro lepší výrobu vakcín!
Protokol pro ultrazvukovou izolaci viru opičích neštovic
Výzkumný tým Stittelaara (2005) použil ultrazvukovou lýzu k uvolnění viru opičích neštovic z růstové kultury hostitelských buněk a také z buněk získaných výměnou hrdla od infikovaných primátů.
Příprava vakcíny proti opičím neštovicím:
Viry opičích neštovic byly pěstovány na fibrózních buňkách kuřecích embryí bez specifických patogenů. Po inkubaci po dobu 1 až 2 dnů byla suspenze virových buněk odebrána jedním kolem zmrazení a rozmrazení a poté koncentrována centrifugací. Peleta byla resuspendována a podrobena několika kolům ultrazvukové homogenizace.
Izolace viru opičích neštovic od očkovaných makaků:
Vzorky byly třikrát zmrazeny a sonikovány v ultrazvukovém CupHornu. K inokulaci monovrstev Vero buněk v šestijamkových destičkách byla použita dvě ředění (1:10 a 1:100) v transportním médiu doplněné o 1% fetální hovězí sérum. Po 1 hodině inkubace při 37 °C byly inokuly odstraněny a nahrazeny kultivačním médiem doplněným o 1% fetálního bovinního séra. Monovrstvy byly kultivovány po dobu 5 dnů při 37 °C a obarveny roztokem krystalové violeti.
(srov. Stittelaar et al., 2005)
Ultrasonicators pro analýzu virů a výrobu vakcín
Hielscher Ultrasonics široké portfolio produktů nabízí ideální ultrasonikátor pro výzkumné a analytické laboratoře, stejně jako pro průmyslovou výrobu vakcín.
Hielscher Ultrasonics se specializuje na návrh, výrobu a distribuci vysoce výkonných ultrazvukových přístrojů a sono-bioreaktorů pro použití ve výzkumných a analytických laboratořích, jakož i pro implementaci v průmyslové výrobě vakcín (např. Vakcíny, Rozhraní api).
Sonikace může být aplikována na otevřené nádoby, uzavřené kontinuálně míchané reaktory a kontinuální průtokové reaktory. Všechny části ultrazvukových systémů, které přicházejí do styku s kapalným médiem, jsou vyrobeny z nerezové oceli, titanu nebo skla. Autoklávovatelné díly a sanitární armatury zajišťují výrobu za podmínek podmínky farmaceutické kvality.
Automatické zaznamenávání dat: Inteligentní software zaznamenává parametry procesu sonikace automaticky na integrovanou paměťovou kartu SD. Přesné řízení všech procesních parametrů zajišťuje reprodukovatelnost, Standardizace výrobya usnadňuje plnění norem bezpečnosti farmaceutických výrobků.
Hielscher Ultrasonics’ Ultrazvukové procesory jsou vysoce spolehlivé a lze je přesně ovládat. Všechny průmyslové ultrasonicators lze upravit tak, aby poskytovaly plný rozsah od nižších po velmi vysoké amplitudy. Robustnost ultrazvukových systémů Hielscher umožňuje provoz 24 hodin denně, 7 dní v týdnu při velkém zatížení a v náročných prostředích.
Níže uvedená tabulka vám poskytuje přibližný přehled o zpracovatelské kapacitě našich ultrasonicators:
| Objem dávky | Průtok | Doporučená zařízení |
|---|---|---|
| vícejamkové? mikrotitrační destičky | není k dispozici | UIP400MTP |
| 1 až 500 ml | 10 až 200 ml? min | UP100H |
| 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 až 20L | 0.2 až 4 l/min | UIP2000hdT |
| 10 až 100 l | 2 až 10 l/min | UIP4000hdT |
| není k dispozici | 10 až 100 l? min | UIP16000 |
| není k dispozici | větší | shluk UIP16000 |
Kontaktujte nás!? Zeptejte se nás!
Ultrazvukové stříhání DNA
Literatura? Reference
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fakta, která stojí za to vědět
Virus opičích neštovic
Opičí neštovice (MPV, MPXV nebo hMPXV) jsou druhem dvouvláknového DNA viru, který způsobuje virové zoonotické onemocnění. Toto onemocnění je známé jako infekce opičími neštovicemi a může se vyskytovat u lidí a zvířat. Patří do rodu Orthopoxvirus v čeledi Poxviridae. Virus opičích neštovic je jedním z lidských orthopoxvirů spolu s viry varioly (VARV), kravských neštovic (CPX) a vakcinie (VACV). Orthopoxviry se vyznačují velkými virovými částicemi ve tvaru cihly, které obsahují dvouřetězcový genom DNA přibližně 200 000 bp.
Test ELISA
ELISA je zkratka pro Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay a je značený imunotest, který je považován za zlatý standard imunoanalýz. ELISA je imunologický test, ceněný pro svou vysokou diagnostickou citlivost, používá se k detekci a kvantifikaci molekul, včetně protilátek, antigenů, proteinů, glykoproteinů a hormonů. Princip testu ELISA je založen na interakci antigen-protilátka. Při této interakci antigen-protilátka se specifické protilátky vážou na svůj cílový antigen. Teprve když dojde k interakci, substrát se může vázat na enzym a lze pozorovat následnou přeměnu substrátu, což znamená, že je dosaženo pozitivního výsledku.
Hielscher Ultrasonics vyrábí vysoce výkonné ultrazvukové homogenizátory od laboratoř k průmyslová velikost.