Ultrazvukové aplikace u viru opičích neštovic

Sonikace je důležitou metodou zpracování při izolaci viru opičích neštovic (MPXV) z analytických vzorků, při fragmentaci virové DNA i při výrobě vakcín proti opičím neštovicím. Při přípravě vzorků před diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atd.) se sonikace používá k lýze buněk za účelem uvolnění viru opičích neštovic z jejich nitra a / nebo k fragmentaci DNA. Při výrobě vakcín zahrnují aplikace přípravu virových částic / DNA, enkapsulaci do nosičů léčiv a formulaci inokul.
Níže naleznete podrobné informace o ultrazvukové přípravě vzorků viru opičích neštovic i o výrobě vakcín proti MPXV za pomoci ultrazvuku.

Co na této stránce naleznete:

• Ultrazvuková lýza pro extrakci viru opičích neštovic
• Ultrazvuková fragmentace DNA viru opičích neštovic
• Ultrazvukové aplikace při výrobě vakcín proti MPXV

Ultrazvuková lýza a fragmentace DNA před polymerázovou řetězovou reakcí (PCR)

Infekce virem opičích neštovic se zjišťuje pomocí testování amplifikací nukleových kyselin (NAAT), které využívá polymerázovou řetězovou reakci (PCR) v reálném čase nebo konvenční PCR k detekci jedinečných sekvencí virové DNA. Vzorek (např. z výtěru z nosohltanu nebo z kožních biopsií) obsahuje virus v buňkách.
Pro analýzu je nutné virus uvolnit z buněk a virovou DNA fragmentovat pro PCR.

Ultrazvuková lýza:

Ultrazvuková dezintegrace buněk / lýza je spolehlivou a účinnou metodou izolace virů z buněčných vzorků, a proto je vhodnější technikou než použití chemických látek, jako jsou lysozym, proteináza K a různé detergenty, které se alternativně používají k dosažení lýzy buněk a uvolnění DNA.
Použití těchto chemických činidel však vyžaduje časově náročnou přípravu vzorků v několika krocích před analýzou PCR, aby se zabránilo inhibici reakce PCR. Jelikož inhibitory PCR ovlivňují účinnost amplifikace, mohou malé rozdíly v množství neodstraněných inhibitorů vést k velkým rozdílům v amplifikaci produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou sonikace při lýze je, že úplná dezintegrace buněčných struktur a uvolnění DNA bez potřeby lyzačních činidel a časově náročné přípravy vzorků jsou žádoucí. (srov. Fykse et al., 2003)

Ultrazvuková fragmentace DNA:

Ultrazvuková fragmentace DNA je jednoduchá a spolehlivá, protože vytváří fragmenty DNA s nastavitelnou délkou (páry bází, bp). Pomocí ultrazvuku lze DNA účinně fragmentovat na cílovou délku. Přesné řízení ultrazvukových parametrů a pokročilé možnosti chlazení zabraňují degradaci DNA.
Přečtěte si více o ultrazvukové fragmentaci DNA!

Ultrazvukové aplikace u vakcín proti viru opičích neštovic

Vakcíny používané proti viru opičích neštovic jsou v současnosti vakcínami obsahujícími živý virus. Nově vyvíjené vakcíny by mohly využívat jiné platformy, například založené na DNA… V současnosti obsahuje modifikovaný virus Vaccinia Ankara, oslabený, nereplikující se orthopoxvirus. Obsahuje také Tris (tris-aminomethan) a chlorid sodný. Vakcína může obsahovat také malá množství DNA a proteinů z fibroblastů kuřecích embryí, které se používají ke kultivaci vakcinačního viru, benzonázu a antibiotické látky, jako jsou gentamicin a ciprofloxacin.

Ultrazvuková homogenizace se používá při výrobě vakcín obsahujících živé oslabené viry, DNA vakcín, multivalentních DNA koktejlů, mRNA vakcín, vakcín obsahujících rekombinantní proteiny, vakcín obsahujících částice podobné virům atd.

Zde naleznete podrobnější informace o ultrazvukových aplikacích pro zdokonalení výroby vakcín!

Protokol ultrazvukové izolace viru opičích neštovic

Výzkumný tým Stittelaara (2005) použil ultrazvukovou lýzu k uvolnění viru opičích neštovic z kultury hostitelských buněk používané ke kultivaci i z buněk získaných výtěry z krku infikovaných primátů.

Příprava vakcíny proti opičím neštovicím:

Viry opičích neštovic byly kultivovány na fibroblastech kuřecích embryí prostých specifických patogenů. Po inkubaci po dobu 1 až 2 dnů byla suspenze virů a buněk sklizena jedním cyklem zmrazení a rozmrazení a poté koncentrována centrifugací. Peleta byla resuspendována a podrobena několika cyklům ultrazvukové homogenizace.

Izolace viru opičích neštovic z očkovaných makaků:

Vzorky byly třikrát zmrazeny a rozmrazeny a sonikovány v ultrazvukovém zařízení CupHorn. Dvě ředění (1:10 a 1:100) v transportním médiu doplněném o 1% fetálního bovinního séra byla použita k inokulaci monovrstev buněk Vero v šestijamkových destičkách. Po 1 h inkubace při 37°C byla inokula odstraněna a nahrazena kultivačním médiem doplněným o 1% fetálního bovinního séra. Monovrstvy byly kultivovány po dobu 5 dnů při 37°C a obarveny roztokem krystalové violeti.
(srov. Stittelaar et al., 2005)

Sonikátory pro analýzu virů a výrobu vakcín

Široké produktové portfolio společnosti Hielscher Ultrasonics nabízí ideální sonikátor pro výzkumné a analytické laboratoře i pro průmyslovou výrobu vakcín.
Hielscher Ultrasonics se specializuje na návrh, výrobu a distribuci vysoce výkonných sonikátorů a sonobioreaktorů pro použití ve výzkumných a analytických laboratořích i pro zavedení do průmyslové výroby vakcín (např. vakcíny, účinné farmaceutické látky (API)).
Sonikaci lze použít v otevřených nádobách, uzavřených reaktorech s nepřetržitým mícháním a kontinuálních průtokových reaktorech. Všechny části ultrazvukových systémů, které přicházejí do styku s kapalným médiem, jsou vyrobeny z nerezové oceli, titanu nebo skla. Autoklávovatelné díly a hygienické armatury zajišťují výrobu za podmínek odpovídajících farmaceutickým požadavkům.
Automatický záznam dat: Inteligentní software automaticky zaznamenává parametry procesu sonikace na integrovanou paměťovou kartu SD. Přesné řízení všech procesních parametrů zajišťuje reprodukovatelnost, standardizaci výroby a usnadňuje plnění norem bezpečnosti farmaceutických výrobků.
Ultrazvukové procesory společnosti Hielscher Ultrasonics jsou vysoce spolehlivé a lze je přesně řídit. Všechny průmyslové sonikátory lze nastavit tak, aby poskytovaly celý rozsah amplitud od nižších po velmi vysoké. Robustnost ultrazvukových systémů společnosti Hielscher umožňuje provoz 24/7 při vysokém zatížení a v náročných prostředích.

Níže uvedená tabulka Vám poskytuje představu o přibližné kapacitě zpracování našich sonikátorů: