Ultrazvuku je důležitou metodou zpracování pro izolaci viru opičích neštovic (MPXV) z analytických vzorků, pro fragmentaci DNA viru, stejně jako při výrobě vakcíny proti opičím neštovicím. Pro přípravu vzorků před diagnostikou a analýzou (PCR, ELISA atd.) ultrazvuku se používá k lyzaci buněk za účelem uvolnění viru opičích neštovic z buněčného vnitřku a / nebo fragmentace DNA. Při výrobě vakcín se aplikace pohybují od přípravy virových částic / DNA, zapouzdření v nosičích léčiv a formulaci inokula.
Níže naleznete podrobné informace o ultrazvukové přípravě vzorků viru opičích neštovic, stejně jako ultrazvukem asistované výrobě vakcíny MPXV.

Co najdete na této stránce:

• Ultrazvuková lýza pro extrakci viru opičích neštovic
• Ultrazvuková fragmentace DNA viru opičích neštovic
• Ultrazvukové aplikace ve výrobě vakcín MPXV

Ultrazvuková lýza a fragmentace DNA před polymerázovou řetězovou reakcí (PCR)

Infekce virem opičích neštovic je detekována amplifikací nukleových kyselin (NAAT) pomocí real-time nebo konvenční polymerázové řetězové reakce (PCR) pro detekci jedinečných sekvencí virové DNA. Vzorek (např. z výměny nosohltanu nebo kožní biopsie) obsahuje virus v buňkách.
Pro analýzu musí být virus uvolněn z buněk a virová DNA musí být fragmentována pro PCR.

Ultrazvuková lýza:

Ultrazvukové narušení / lýza buněk je spolehlivá a účinná metoda izolace virů z buněčných vzorků, a tím vhodnější technika před chemickými látkami, jako je lysozym, proteináza K a různé detergenty, které se alternativně používají k dosažení buněčné lýzy a uvolnění DNA.
Použití takových chemických činidel však vyžaduje časově náročnou přípravu vzorku v několika krocích před analýzou PCR, aby se zabránilo inhibici reakce PCR. Vzhledem k tomu, že inhibitory PCR ovlivňují účinnost amplifikace, malé odchylky v množství inhibitorů, které nejsou odstraněny, mohou vést k velkým odchylkám v amplifikaci produktu PCR (Diaco, 1995).
Výhodou ultrazvuku pro lýzu je, že úplné narušení buněčných struktur a uvolnění DNA bez nutnosti lyzujících činidel a časově náročné přípravy vzorků jsou žádoucí. (srov. Fykse et al., 2003)

Ultrazvuková fragmentace DNA:

Ultrazvuková fragmentace DNA je jednoduchá a spolehlivá, protože produkuje fragmenty DNA laditelné na délku (basepairs, bp). Pomocí ultrazvuku může být DNA účinně fragmentována na cílovou délku DNA. Přesná kontrola ultrazvukových parametrů a sofistikované možnosti chlazení zabraňují degradaci DNA.
Přečtěte si více o ultrazvukové fragmentaci DNA!

Ultrazvukové aplikace ve vakcíně proti viru opičích neštovic

Vakcíny používané proti viru opičích neštovic jsou v současné době živými virovými vakcínami. Nově vyvinuté vakcíny mohou používat jiné platformy, jako je DNA-based V současné době obsahuje modifikovaný Vaccinia Ankara viurs, oslabený, nereplikující se orthopoxvirus. Obsahuje také Tris (tris-aminomethan) a chlorid sodný. Vakcína může také obsahovat malé množství DNA a bílkovin z fibroblastových buněk kuřecího embrya, které se používají k růstu vakcinačního viru, benzonázy a antibiotických sloučenin, jako je gentamicin a ciprofloxacin.

Ultrazvuková homogenizace se používá při výrobě živých oslabených virových vakcín, DNA vakcín, multivalentních DNA koktejlů, mRNA vakcín, rekombinantních proteinových vakcín, virových částicových vakcín atd.

Můžete najít podrobnější informace o ultrazvukových aplikacích pro lepší výrobu vakcín!

Protokol pro ultrazvukovou izolaci viru opičích neštovic

Výzkumný tým Stittelaar (2005) použil ultrazvukovou lýzu k uvolnění viru opičích neštovic z růstové hostitelské buněčné kultury, stejně jako z buněk získaných prostřednictvím výměn hrdla od infikovaných primátů.

Příprava vakcíny proti opičím neštovicím:

Viry opičích neštovic byly pěstovány na fibroblastových buňkách kuřecích embryí bez specifických patogenů. Po inkubaci po dobu 1 až 2 dnů byla suspenze virových buněk odebrána jedním kolem zmrazení a poté koncentrována centrifugací. Peleta byla resuspendována a podrobena několika kolům ultrazvukové homogenizace.

Izolace viru opičích neštovic od očkovaných makaků:

Vzorky byly třikrát zmrazeny a sonikovány v ultrazvukovém CupHornu. K naočkování monovrstev Vero buněk v šestijamkových destičkách byla použita dvě ředění (1:10 a 1:100) v transportním médiu doplněná 1% fetálním bovinním sérem. Po 1 hodině inkubace při teplotě 37 °C byly inokuly odstraněny a nahrazeny kultivačním médiem doplněným 1% fetálním bovinním sérem. Monovrstvy byly kultivovány po dobu 5 dnů při teplotě 37 °C a obarveny krystalifaliálním roztokem.
(srov. Stittelaar et al., 2005)

Ultrasonicators pro analýzu virů a výrobu vakcín

Hielscher Ultrasonics široké portfolio produktů nabízí ideální ultrasonicator pro výzkumné a analytické laboratoře, stejně jako pro průmyslovou výrobu vakcín.
Hielscher Ultrasonics se specializuje na návrh, výrobu a distribuci vysoce výkonných ultrasonicators a sono-bioreaktorů pro použití ve výzkumných a analytických laboratořích, stejně jako pro implementaci v průmyslové výrobě vakcín (např. vakcíny, Rozhraní api).
Sonikace může být aplikována na otevřené nádoby, uzavřené kontinuálně míchané reaktory a kontinuální průtokové reaktory. Všechny části ultrazvukových systémů, které se dostanou do kontaktu s kapalným médiem, jsou vyrobeny z nerezové oceli, titanu nebo skla. Autoklávovatelné díly a sanitární armatury zajišťují výrobu pod farmaceutické podmínky.
Automatické nahrávání dat: Inteligentní software zaznamenává parametry procesu sonikace automaticky na integrovanou paměťovou kartu SD. Přesná kontrola všech parametrů procesu zajišťuje reprodukovatelnost, standardizace výrobya usnadňuje plnění norem bezpečnosti farmaceutických výrobků.
Hielscher Ultrazvuk’ ultrazvukové procesory jsou vysoce spolehlivé a mohou být přesně řízeny. Všechny průmyslové ultrasonicators mohou nastavit tak, aby poskytovaly plný rozsah od nižších až po velmi vysoké amplitudy. Robustnost Hielscherových ultrazvukových systémů umožňuje provoz 24/7 při vysokém zatížení a v náročných prostředích.

Níže uvedená tabulka vám dává informaci o přibližné zpracovatelské kapacity našich ultrasonicators: