Bakteriyel Örneklerin Ultrasonik Hücre Parçalanması

Bakteriyel numuneler nadiren gerçek tek hücreli süspansiyonlar halinde gelir. Kültürler zincir ve topaklar halinde büyür, çevresel izolatlar hücre dışı polimerik maddelerle birbirine bağlanmış agregatlar oluşturur ve santrifüjlenmiş peletler, iyice vortekslenmesine rağmen genellikle yeniden süspansiyona girmez. Canlı sayımı, optik yoğunluk, akış sitometrisi ve mikrobiyom profillemesi, hepsi bir partikülün bir hücreye eşit olduğu varsayımına dayanır. Ultrasonik hücre ayrıştırma bu çelişkiyi ortadan kaldırır: Kısa, kontrollü sonikasyon patlamaları, agregaları parçalamadan tek tek hücrelere ayırır.

Hücre Topaklanması Neden Sonuçlarınızı Etkiler?

Aggregasyon, bir hazırlık hatası değil, biyolojik bir özelliktir. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces ve birçok çevresel tür, zincirler, kümeler veya biyofilm parçaları halinde çoğalır; hücre dışı DNA ve polisakkaritler ise hücreleri peletler ve sürüntü eluatlarında birbirine yapıştırır. Bunun analitik sonuçları sistematiktir:

• Koloni sayıları olduğundan az tahmin edilmektedir; çünkü bir küme, içinde kaç hücre olursa olsun tek bir koloni oluşturur.
• Optik yoğunluk ve partikül sayıcılar, hücreler yerine agregaları rapor eder; bu da büyüme eğrilerini çarpıtmaktadır.
• Akış sitometrisi ve hücre ayırma yöntemleri, kümelenmiş olayları yanlış sayar ve bunları analizden hariç tutar.
• DNA ve protein ekstraksiyonları yalnızca agrega yüzeyindeki hücreleri temsil ettiğinden, mikrobiyom ve omik verilerde çarpıklığa yol açmaktadır.

Geleneksel yöntemler yavaş, yetersiz veya kimyasal değişikliklere yol açar. Yoğun pipetleme ve vorteksleme işlemleri, mikro agregaların geride kalmasına neden olur. Enzimatik veya şelatlayıcı bazlı dispersiyon, analiz etmeyi amaçladığınız hücre yüzeyini değiştirir. Kontrollü kavitasyon yoluyla gerçekleştirilen mekanik ayrıştırma, saniyeler içinde etki eder ve herhangi bir katkı maddesi gerektirmez.

Sonikasyon, Hücreleri Parçalamadan Nasıl Ayrıştırır?

Ultrasonik hücre ayrıştırma, mekanik mukavemet farkından yararlanır. Bakteriyel agregatlar, nispeten zayıf hücreler arası bağlar ve bir hücre dışı matris tarafından bir arada tutulurken, bozulmamış bir hücre zarı önemli ölçüde daha yüksek kesme kuvvetine dayanır. Kalibre edilmiş ultrason süspansiyona girdiğinde, akustik kavitasyon, öncelikle agregat arayüzlerinde etki eden mikro akıntılar, basınç darbeleri ve kesme kuvvetleri oluşturur. Topaklar, zincirler ve biyofilm parçaları, zarların yırtıldığı (lizis) enerji seviyesine ulaşılmadan önce birbirinden ayrılır (deaglomerasyon).

Bakteriyel Hücre Topaklarının Ultrasonik Parçalanması

Parçalanma veya Lizis – Sonikasyon Parametrelerinin Önemi

Bunun pratikteki sonucu, ayrıştırma ve lizizin farklı parametrelerde çalıştırılan aynı cihaz olmasıdır. Orta genlik, kısa darbeli döngüler ve kontrollü sıcaklık koşullarında, canlı tek hücreli bir süspansiyon elde edersiniz. Genlik, maruz kalma süresi veya numune sıcaklığı artırıldığında, süreç hücre içi hedefler için tam hücre parçalanmasına doğru kayar. Hielscher jeneratörleri, genlik, güç, darbe ve enerji girişini hassas bir şekilde ayarlamanıza ve yöntemi kaydetmenize olanak tanır; böylece ayrıştırma adımı, numuneler, operatörler ve çalıştırmalar arasında tekrarlanabilir hale gelir.

Verimli Temassız Sonikasyon

Banyo tipi ultrasonik işlem, bu kontrol düzeyine ulaşamaz. Ultrasonik temizleme banyoları ve tankları yalnızca düşük seviyede ultrasonik enerji sağlar; bu da hazırlığın eksik kalmasına neden olur ve kavitasyon düzensiz bir şekilde gerçekleşir, dolayısıyla her bir tüp, banyo içindeki konumuna göre işlenir. VialTweeter, yoğun ve odaklanmış ultrasonik kuvvetleri doğrudan kap duvarından geçerek aynı anda 10 adede kadar kapalı numuneye iletir. Banyoda uzun süreli ve değişken maruz kalma gerektiren işlemler, standart bir darbe düzeninde tamamlanır.
Hielscher temassız sonikatörleri, kapalı şişelerin duvarlarından yoğun ve odaklanmış ultrason uygular. VialTweeter, numuneye prob sokmadan, çapraz bulaşma ve aerosol salınımı olmaksızın, aynı yoğunlukta aynı anda en fazla 10 şişeyi işler. İş hacminin gerektirdiği durumlarda, UIP400MTP ve UIP550MTP mikroplaka sonikatörleri, aynı kontrollü enerji aktarımını çok kuyulu plakalara da genişletir.

Temassız Ultrasonik Parçalama Yönteminin Avantajları

• Sıfır çapraz bulaşma: Şişeler sürekli kapalı kaldığından ve numuneye hiçbir prob daldırılmadığından, çapraz bulaşma ve numune kaybı tamamen önlenir. Numuneler arasında sterilize edilmesi gereken hiçbir şey yoktur ve bir analiz, bir sonrakini etkilemez.
• Aerosol koruması: Açık problu sonikasyon, bulaşıcı aerosoller oluşturur ve cihaz yüzeylerini kirletir. Kapalı şişeli sonikasyon, numuneyi kendi tüpünün içinde tutar; bu durum, Mycobacterium tuberculosis gibi patojenik bakteriler ve diğer BSL-2 veya BSL-3 ajanlarıyla çalışılırken önemlidir.
• Bahşiş kaybı yok: Titanyum problar, çalışma sırasında numuneye az miktarda mikro parçacık salabilir. Bu parçacıklar, işlem hattının ilerleyen kısımlarında optik yoğunluğu ve parçacık sayısını değiştirir. Kap duvarı aracılığıyla dolaylı sonikasyon, bu katı madde kaynağını tamamen ortadan kaldırır.
• Sabit verim: VialTweeter, en fazla 10 şişenin her birine aynı ultrason yoğunluğunu sağlar; böylece sonikasyon sonuçları homojen ve tekrarlanabilir olur. Banyo yöntemlerinde ve tek numune problamada sıkça görülen konum etkileri ortadan kalkar ve tekrarlar arasında temel değerleriniz karşılaştırılabilir kalır.
• Numune bütünlüğü: Tüp, işleme süreci boyunca kapalı kalır; bu sayede numune kontamine olamaz, bozulamaz veya buharlaşamaz. Ekstra bir aktarım adımına izin verilemeyen değerli klinik peletler de dahil olmak üzere, küçük hacimli numuneler seyreltilmeden işlenebilir.
• Süreç Kontrolü: Genlik ile 0 arasında, darbe modu ise %0 ile 0 arasında ayarlanabilir; ayrıca sistemler sıcaklık izleme özelliğine sahiptir, böylece ısıya duyarlı suşlar ve proteinler zararlı eşik değerlerin altında kalır.

Tipik Uygulamalar

• Mikrobiyom ve bağırsak içeriği analizi: Lactobacillus, Bifidobacterium ve dışkı örneklerinin plakaya ekilmeden veya dizileme işlemine tabi tutulmadan önce dağıtılması; böylece topaklanmalar nedeniyle sayım sonuçlarının düşmemesi sağlanır.
• Gıda ve su mikrobiyolojisi: Doğru koloni ve canlılık tayini için sürüntü, durulama sıvıları ve zenginleştirme besiyerlerindeki topakların ayrıştırılması.
• Biyofilm araştırması: Yüzey proteinlerini yok edecek enzimatik işlem uygulanmaksızın, taşıyıcılardan ve yüzeylerden hücrelerin tek hücreli süspansiyonlar halinde elde edilmesi.
• Klinik teşhis: Koruma önlemleri altında balgam, irin ve sürüntü elüatlarının yeniden süspansiyon haline getirilmesi.
• Hücre kültürü: Sayım ve pasajlama öncesinde, memeli, böcek ve CHO hücrelerinin topaklanmış agregatlarının ayrılması.
• Tüm iş akışının hazırlığı: Düşük genlikte ayrıştırma yapan aynı cihaz, daha yüksek ayarlarda tam hücre parçalaması gerçekleştirir; böylece lizis, protein ekstraksiyonu ve DNA parçalanması, tüp aktarımına gerek kalmadan birbirini izler.

Literatür / Referanslar