Biyofilm ve Proteomik Analizde Hielscher Çok Örnekli Sonikatörleri Kullanan Protokol

VialTweeter Çok Tüplü Sonikatör ve UIP400MTP Mikroplaka Sonikatörü gibi çok örnekli sonikatörlerin kullanımı, yüksek verimli uygulamalar için laboratuvar iş akışlarını kolaylaştırır. Her iki cihaz da birden fazla numunede hassas ve tek tip ultrasonik işlemeye izin vererek değişkenliği en aza indirir ve tekrarlanabilirliği artırır. Bu, manuel veya tek numune yöntemlerinin daha az verimli olduğu ve tutarsızlığa eğilimli olduğu tutarlı numune lizisi, biyofilm ayrılması, protein ekstraksiyonu veya proteolitik sindirim gerektiren deneylerde özellikle avantajlıdır.

Çok Örnekli Sonikatörlerle İş Akışlarını Kolaylaştırın

Örneğin UIP400MTP, mikroplaka kuyularının eş zamanlı ultrasonik muamelesini mümkün kılarak, biyofilmlerin veya hücresel materyalin düzgün bir şekilde ayrılmasını sağlar. Bu arada, VialTweeter, çapraz kontaminasyon olmadan birden fazla tüp numunesinin hassas bir şekilde parçalanmasını ve homojenizasyonunu sağlar. Bu sonikatörler, işlem sürelerini önemli ölçüde azaltır, deneysel tekrarlanabilirliği geliştirir ve yüksek numune bütünlüğünü korur, bu da onları mikrobiyoloji, proteomik ve moleküler biyoloji araştırmalarında vazgeçilmez araçlar haline getirir.
Aşağıda, E. coli biyofilm oluşumu ve müteakip proteomik analizi içeren bir çalışmada Hielscher çok örnekli sonikatör modellerinin, VialTweeter Çok Tüplü Sonikatör ve Mikroplaka Sonikatör UIP400MTP'nin kullanımını örnekleyen ayrıntılı bir protokol bulunmaktadır.

Protokol: Hielscher Çok Örnekli Sonikatörler Kullanılarak Biyofilm Oluşumu, Ayrılması ve Proteomik Analiz

1. Bakteri Kültürü Hazırlama

• Kültür E. coli bakterileri (W3110 suşu), 30 ° C'de, E. coli biyofilm oluşumu için uygun bir sıcaklıkta, aşağıdakileri içeren tripton suyu (TB) ortamında:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Plazmid tutulmasını sağlamak için gerektiği kadar antibiyotik takviyesi yapın.
• Mikroskopi ve promotör aktivite çalışmaları için, rplL promotörün kontrolü altında genomik geliştirilmiş bir GFP (eGFP) raportörü ile W3110 E. coli suşunu kullanın.
• Çeşitli promotörler için GFP raportör plazmitlerini kullanın (örn. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) destekleyici faaliyetleri ölçmek için.

2. Biyofilm Yetiştirme ve Ayırma

• Oyuk başına 1.5 mL seyreltilmiş bakteri kültürünü 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın (CellStar 12 oyuklu plakalar, Greiner Bio-One).
• Biyofilm oluşumuna izin vermek için inkübe edin.
• Planktonik (yapışmayan) kültürü dikkatlice çıkarın.

– Her kuyuyu 500 μL PBS ile yıkayın.
– UIP400MTP mikroplaka sonikatöründeki 12 oyuklu plakayı sonikleştirerek bağlı hücreleri ayırın. UIP400MTP, tüm kuyucuklarda tutarlı ultrasonik enerji sağlayarak düzgün bir ayrılma sağlar.
– Sonikasyon ayarları:% 60 genlik, döngü modu: 60 sn AÇIK / 30 sn KAPALI.

3. Hücre Toplama ve Lizis

• Ayrılmış biyofilm hücrelerini 4.500 g'da 5 dakika santrifüjleyin.
• Peletlenmiş hücreleri PBS ile yıkayın.
• Hücreleri 100 μL% 2 sodyum lauroil sarkosinat (SLS) içinde yeniden süspanse edin ve 95 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
• Tam hücre lizizini sağlamak için VialTweeter Çok Tüplü Sonikatör kullanarak sonikasyon.
  – Sonikasyon ayarları:% 100 genlik, 10 dakika toplam çalışma süresi için 50 s AÇIK / 10 s KAPALI; Numuneleri buz üzerinde tutun.

4. İndirgeme ve Alkilasyon

• Disülfid bağlarını azaltmak için 5 mM Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) ekleyin ve 95 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
• Proteinleri 10 mM iyodoasetamid ile 25°C'de 30 dakika boyunca alkilat edin.

5. Protein Miktar Tayini ve Sindirimi

• Kalıntıları temizlemek için lizatları santrifüjleyin.
• Pierce BCA Protein Test Kitini kullanarak toplam protein içeriğini ölçün.
• % 2 SLS ve 100 mM amonyum bikarbonat içeren bir çözelti içinde 50 μg toplam proteini 1 μg tripsin ile sindirin.
• Sindirim reaksiyonunu gece boyunca 30 ° C'de inkübe edin.

6. Peptit Saflaştırma

• % 1.5 trifloroasetik asit (TFA) ve ardından santrifüj ekleyerek SLS'yi çökeltin.
• C18 mikrospin kolonlarını kullanarak peptitleri saflaştırın.
• Saflaştırılmış peptitleri kurutun ve% 0.1 TFA'da yeniden süspanse edin.

7. Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (LC-MS/MS)

• Peptitleri Ultimate 3000 RSLC nano sistemi ile birleştirilmiş bir Q-Exactive Plus kütle spektrometresinde analiz edin.
• C18 reçinesi (2,4 μm) ile paketlenmiş ters fazlı bir HPLC kolonu (75 μm × 42 cm) kullanarak peptitleri ayırın.
• 140 dakika boyunca %2 ila 5 çözücü B (%0.15 formik asitli asetonitril) arasında bir gradyan uygulayın.
• Yüksek çözünürlüklü MS taramalarını ve ardından en yoğun 10 iyonun tandem MS/MS taramalarını kullanarak veri elde edin.

8. Veri Analizi

• Progenesis yazılımını kullanarak ham LC-MS verilerini işleyin.
• .mgf dosyalarını dışa aktarın ve MASKOT ile analiz edin.
• Kalite kontrol ve yanlış keşif ayarlaması için SafeQuant kullanarak peptit miktar tayini gerçekleştirin.
• Tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm deneyleri iki veya üç kopya halinde gerçekleştirin.

Yüksek Verimli Numune Hazırlama için Çoklu Numune Sonikatörleri

Çok örnekli sonikatör modelleri VialTweeter ve UIP400MTP, özellikle biyofilm araştırmaları ve proteomikte deneysel iş akışlarının hassasiyetini ve verimliliğini önemli ölçüde artırır. Birden fazla numuneyi aynı şekilde işleme yetenekleri, veri kalitesinden ödün vermeden yüksek verim kapasitesi sağlar. Bu faydalar, yukarıda özetlenen aerodinamik iş akışlarıyla birleştiğinde, Hielscher çok örnekli sonikatörleri modern biyolojik araştırmalar için temel araçlar haline getirir.

Tasarım, İmalat ve Danışmanlık – Almanya'da Üretilen Kalite

Hielscher ultrasonicators en yüksek kalite ve tasarım standartları için iyi bilinir. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonicators'ımızın endüstriyel tesislere sorunsuz bir şekilde entegre edilmesini sağlar. Zorlu koşullar ve zorlu ortamlar Hielscher ultrasonicators tarafından kolayca ele alınır.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknoloji ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonicators'a özel önem vermektedir. Tabii ki, Hielscher ultrasonicators CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gereksinimlerini karşılar.