Biyofilm ve Proteomik Analizde Hielscher Çok Numuneli Sonikatörlerinin Kullanıldığı Protokol

VialTweeter çok tüplü sonikatörü ve UIP400MTP mikroplaka sonikatörü gibi çok numuneli sonikatörlerin kullanımı, yüksek numune işleme kapasitesi gerektiren uygulamalarda laboratuvar iş akışlarını kolaylaştırır. Her iki cihaz da birden fazla numunenin hassas ve eşit biçimde ultrasonik olarak işlenmesine olanak tanıyarak değişkenliği en aza indirir ve tekrarlanabilirliği artırır. Bu, özellikle tutarlı numune lizisi, biyofilm ayrılması, protein ekstraksiyonu veya proteolitik sindirim gerektiren deneylerde avantajlıdır; bu deneylerde manuel veya tek numuneli yöntemler daha az verimlidir ve tutarsızlığa yatkındır.

Çok Numuneli Sonikatörlerle İş Akışlarını Kolaylaştırın

Örneğin UIP400MTP, mikroplaka kuyucuklarının eş zamanlı ultrasonik işlemine olanak tanıyarak biyofilmlerin veya hücresel materyalin eşit biçimde ayrılmasını sağlar. VialTweeter ise birden fazla tüpteki numunelerin çapraz kontaminasyon olmadan hassas lizisini ve homojenizasyonunu sağlar. Bu sonikatörler işlem sürelerini önemli ölçüde kısaltır, deneysel tekrarlanabilirliği iyileştirir ve yüksek numune bütünlüğünü korur; bu özellikleri onları mikrobiyoloji, proteomik ve moleküler biyoloji araştırmalarında vazgeçilmez araçlar haline getirir.
Aşağıda, E. coli biyofilm oluşumunu ve ardından yapılan proteomik analizi içeren bir çalışmada Hielscher çok numuneli sonikatör modelleri olan VialTweeter çok tüplü sonikatörünün ve UIP400MTP mikroplaka sonikatörünün kullanımını örnekleyen ayrıntılı bir protokol yer almaktadır.

Protokol: Hielscher Çok Numuneli Sonikatörleriyle Biyofilm Oluşumu, Ayrılması ve Proteomik Analiz

1. Bakteri Kültürünün Hazırlanması

• E. coli bakterilerini (W3110 suşu), E. coli biyofilm oluşumu için elverişli bir sıcaklık olan 30°C’de, aşağıdakileri içeren tripton sıvı besiyerinde (TB) kültüre edin:
  – 10 g/L tripton
  – 5 g/L NaCl
• Plazmidin korunmasını sağlamak için gerektiğinde antibiyotik ekleyin.
• Mikroskopi ve promotör aktivitesi çalışmalarında, rplL promotörünün kontrolü altında genomik bir geliştirilmiş GFP (eGFP) raportörü taşıyan W3110 E. coli suşunu kullanın.
• Promotör aktivitelerini ölçmek için çeşitli promotörlere yönelik GFP raportör plazmidlerini (örneğin, csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) kullanın.

2. Biyofilmin Yetiştirilmesi ve Ayrılması

• 12 kuyucuklu bir plakaya (CellStar 12 kuyucuklu plakalar, Greiner Bio-One) her kuyucuk için 1,5 mL seyreltilmiş bakteri kültürü ekin.
• Biyofilm oluşumuna olanak tanımak için inkübe edin.
• Planktonik (yapışmamış) kültürü dikkatlice uzaklaştırın.

– Her kuyucuğu 500 µL PBS ile yıkayın.
– 12 kuyucuklu plakayı UIP400MTP mikroplaka sonikatöründe sonikasyona tabi tutarak yapışmış hücreleri ayırın. UIP400MTP, tüm kuyucuklara tutarlı ultrasonik enerji ileterek eşit bir ayrılma sağlar.
– Sonikasyon ayarları: %60 genlik, döngü modu: 60 sec AÇIK / 30 sec KAPALI.

3. Hücrelerin Toplanması ve Lizisi

• Ayrılmış biyofilm hücrelerini 4.500 g’de 5 dakika santrifüjleyin.
• Pelet halindeki hücreleri PBS ile yıkayın.
• Hücreleri 100 µL %2 sodyum lauroil sarkosinat (SLS) içinde yeniden süspanse edin ve 95°C’de 15 dakika inkübe edin.
• Hücre lizisinin tam olarak gerçekleşmesini sağlamak için VialTweeter çok tüplü sonikatörünü kullanarak sonikasyon uygulayın.
  – Sonikasyon ayarları: %100 genlik, toplam 10 min çalışma süresi boyunca 50 s AÇIK / 10 s KAPALI; numuneleri buz üzerinde tutun.

4. İndirgeme ve Alkilasyon

• Disülfit bağlarını indirgemek için 5 mM Tris(2-karboksietil)fosfin (TCEP) ekleyin ve 95°C’de 15 dakika inkübe edin.
• Proteinleri 10 mM iyodoasetamid ile 25°C’de 30 dakika alkilleyin.

5. Protein Miktar Tayini ve Sindirimi

• Kalıntıları uzaklaştırmak için lizatları santrifüjleyin.
• Pierce BCA Protein Assay Kit kullanarak toplam protein içeriğini nicel olarak belirleyin.
• 50 µg toplam proteini, %2 SLS ve 100 mM amonyum bikarbonat içeren bir çözeltide 1 µg tripsin ile sindirin.
• Sindirim reaksiyonunu gece boyunca 30°C’de inkübe edin.

6. Peptit Saflaştırma

• %1,5 trifloroasetik asit (TFA) ekleyerek SLS’yi çöktürün, ardından santrifüjleyin.
• Peptitleri C18 mikrospin kolonları kullanarak saflaştırın.
• Saflaştırılmış peptitleri kurutun ve %0,1 TFA içinde yeniden süspanse edin.

7. Sıvı Kromatografisi–Kütle Spektrometrisi (LC-MS/MS)

• Peptitleri, Ultimate 3000 RSLC nano sistemine bağlanmış bir Q-Exactive Plus kütle spektrometresinde analiz edin.
• Peptitleri C18 reçinesi (2,4 µm) ile doldurulmuş bir ters faz HPLC kolonu (75 µm × 42 cm) kullanarak ayırın.
• 140 dakika boyunca %2’den %35’e kadar çözücü B (%0,15 formik asit içeren asetonitril) gradyanı uygulayın.
• Yüksek çözünürlüklü MS taramalarını ve ardından en yüksek yoğunluğa sahip 10 iyonun tandem MS/MS taramalarını kullanarak veri elde edin.

8. Veri Analizi

• Ham LC-MS verilerini Progenesis yazılımını kullanarak işleyin.
• .mgf dosyalarını dışa aktarın ve MASCOT ile analiz edin.
• Kalite kontrolü ve yanlış keşif düzeltmesi için SafeQuant kullanarak peptit miktar tayini yapın.
• Tekrarlanabilirliği sağlamak için tüm deneyleri iki veya üç tekrarlı olarak gerçekleştirin.

Yüksek Numune İşleme Kapasitesiyle Numune Hazırlama İçin Çok Numuneli Sonikatörler

Çok numuneli sonikatör modelleri VialTweeter ve UIP400MTP, özellikle biyofilm araştırmaları ve proteomikte deneysel iş akışlarının hassasiyetini ve verimliliğini önemli ölçüde artırır. Birden fazla numuneyi eşit biçimde işleyebilmeleri, veri kalitesinden ödün vermeden yüksek numune işleme kapasitesi sağlar. Bu avantajlar, yukarıda açıklanan kolaylaştırılmış iş akışlarıyla birleşerek Hielscher çok numuneli sonikatörlerini modern biyolojik araştırmalar için vazgeçilmez araçlar haline getirir.

Tasarım, Üretim ve Danışmanlık – Almanya’da Üretilen Kalite

Hielscher sonikatörleri, en yüksek kalite ve tasarım standartlarıyla tanınır. Dayanıklılık ve kolay kullanım, sonikatörlerimizin endüstriyel tesislere sorunsuz entegrasyonunu sağlar. Hielscher sonikatörleri, zorlu koşullarla ve yüksek gereksinimler getiren ortamlarla kolayca başa çıkar.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en ileri teknolojiye ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı sonikatörlere özel önem verir. Elbette Hielscher sonikatörleri CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gerekliliklerini karşılar.