FFPE’den Deparafinizasyon ve Protein Ekstraksiyonu

VialTweeter çok tüplü ultrasonikatörü ile deparafinizasyon, çözünürleştirme ve sonikasyonun optimize edilmiş bir kombinasyonunu kullanarak formalinle fikse edilmiş, parafine gömülmüş (FFPE) doku kesitlerinden protein ekstraksiyonunu kolaylaştırın. Bu protokol, sonraki aşamalardaki kütle spektrometrisine dayalı proteomik analizleri destekler ve SP3 temizleme ve enzimatik sindirim iş akışlarıyla uyumludur.

Bu standart çalışma prosedürü (SOP), yüksek performanslı sonikasyon kullanarak FFPE doku örneklerinin proteomik analizini yapan laboratuvar personeline yöneliktir. VialTweeter çok tüplü sonikatörü kullanılarak paralel işlenen en fazla on FFPE numunesi için optimize edilmiştir.

Protokol: VialTweeter Kullanılarak FFPE Numunelerinden Protein Ekstraksiyonu

Malzemeler ve Reaktifler

Reaktifler

• Ksilen (histoloji saflığında)
• Etanol (mutlak %96)
• Lizis tamponu:

6 M Guanidin hidroklorür
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-Kloroasetamid)

• Proteaz inhibitörü (isteğe bağlı; ör., cOmplete™ mini EDTA-free)

Ekipman

• VialTweeter Çok Tüplü Ultrasonikatörü
• 1,5 mL veya 2,0 mL düşük bağlanmalı mikrosantrifüj tüpleri
• Isıtma bloğu veya inkübatör (95°C ve 80°C ayarları)
• Mikrosantrifüj
• Termomikser (isteğe bağlı ancak önerilir)

Başlangıç Numune Miktarı

• Numune başına (yani vial başına) 10 µm kalınlığında 1–2 FFPE doku kesiti

VEYA

• Numune başına (yani vial başına) toplam ~100 µg doku

Not: Parafin kalıntılarıyla kontaminasyonu en aza indirmek için mikrotomide yeni bıçaklar kullanın.

İşlem

1. Deparafinizasyon
   1. FFPE kesitlerini düşük bağlanmalı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   2. 1 mL ksilen ekleyin, kısa süre vorteksleyin.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   4. 14.000 × g’de 2 dakika santrifüjleyin; süpernatantı atın.
   5. Ksilenle yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (Adımlar 2–4).
   6. Peleti 1 mL %96 etanolle yıkayın, vorteksleyin, ardından 14.000 × g’de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın.
   7. Etanolle yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (toplam 2 etanol yıkaması).
   8. Kalan etanolün buharlaşması için peleti kapaklar açık olarak oda sıcaklığında 10 dakika havada kurutun.
2. Protein Ekstraksiyonu ve Sonikasyon
   1. Her kuru pelete 200 µL lizis tamponu ekleyin.

      Not: Sonikatör en fazla 1 mL hacmi alabilse de sonraki işlemler için en uygun hacim 200 µL’dir.

   2. Vorteksleyerek veya nazikçe pipetleyerek karıştırın.
3. Birinci Termal İnkübasyon
   1. Tüpleri bir termomikser veya ısıtma bloğu kullanarak 400 rpm’de çalkalamayla 95 °C’de 30 min inkübe edin.
   2. Numuneleri oda sıcaklığında 5 min soğumaya bırakın.
4. VialTweeter ile Birinci Sonikasyon
   1. Tüpleri VialTweeter cihazına yerleştirin.
   2. VialTweeter UP200St cihazını aşağıdaki değerlere ayarlayın ve sonikasyon uygulayın.
Sonikatör Ayarları
• Genliği (A) %100’e ayarlayın
• Darbeli çalışma modunu (C) %100’e ayarlayın
• Periyot Zamanlayıcısı: Açık
• Açık Kalma Süresi: 60s
• Kapalı Kalma Süresi: 30s
• Sınır Değeri: 15 min (10 döngüye karşılık gelir)
(Hesaplama Notu: (60 s Açık + 30 s Kapalı) × 10 döngü = 900 s = 15 min)
5. İkinci Termal İnkübasyon
   Tüpleri çıkarın ve yeniden 95 °C’de 15 min boyunca, 400 rpm’de inkübe edin.
6. İkinci Sonikasyon
   VialTweeter cihazında aynı ayarları (yukarıdaki gibi) kullanarak ilave 10 döngü (toplam 15 min) boyunca sonikasyonu tekrarlayın.
7. Lizatın Berraklaştırılması
   1. Numuneleri 23°C’de (oda sıcaklığı) 13.000 × g’de 10 min santrifüjleyin.
   2. Süpernatantı dikkatlice yeni bir 2,0 mL Safe-lock Eppendorf tüpüne alın. Peleti yerinden oynatmamaya dikkat edin.
8. Sonraki İşlemler
   Lizat artık SP3 temizleme ve enzimatik sindirim için hazırdır.

Notlar ve En İyi Uygulamalar

1. Sonikasyon sırasında aşırı ısınma riski, programlanmış AÇIK/KAPALI döngüleriyle azaltılır.
2. Protein agregasyonunu önlemek için sonikasyondan sonra vortekslemekten kaçının.

Atık Bertarafı ve Güvenlik

Aşağıdaki tablo, laboratuvar boyutundaki ultrasonikatörlerimizin yaklaşık işleme kapasitesi hakkında fikir verir: