FFPE'den Deparafinizasyon ve Protein Ekstraksiyonu

Bir VialTweeter çok tüplü ultrasonicator ile optimize edilmiş bir deparafinizasyon, çözündürme ve sonikasyon kombinasyonu kullanarak formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku bölümlerinden protein ekstraksiyonunu kolaylaştırın. Bu protokol, aşağı akış kütle spektrometresi tabanlı proteomikleri destekler ve SP3 temizleme ve enzimatik sindirim iş akışlarıyla uyumludur.

Bu SOP, yüksek performanslı sonikasyon kullanarak FFPE doku örneklerinin proteomik analizinde yer alan laboratuvar personeli için tasarlanmıştır. VialTweeter Çok Tüplü Sonikatör kullanılarak paralel olarak işlenen on adede kadar FFPE numunesi için optimize edilmiştir.

Protokol: VialTweeter kullanılarak FFPE Örneklerinden Protein Ekstraksiyonu

Malzemeler ve Reaktifler

Reaktif

• Ksilen (histoloji derecesi)
• Etanol (mutlak% 96)
• Lizis tamponu:

6 M Guanidin hidroklorür
50 mM Tris-HCl, pH 8.5
10 mM TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin)
40 mM CAA (2-Kloroasetamid)

• Proteaz inhibitörü (isteğe bağlı; örneğin, cOmplete™ mini EDTA içermez)

Ekipman

• VialTweeter Çok Tüplü Ultrasonikatör
• 1.5 mL veya 2.0 mL düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri
• Isı bloğu veya inkübatör (95°C ve 80°C ayarları)
• Mikrosantrifüj
• Termomikser (isteğe bağlı ancak önerilir)

Örnek Giriş

• Örnek başına 10 μm kalınlığında FFPE dokusunun 1-2 bölümü (ör. flakon başına)

veya

• Örnek başına toplam ~ 100 μg doku (ör. flakon başına)

Not: Parafin kalıntıları kontaminasyonunu en aza indirmek için mikrotomi için yeni bıçaklar kullanın.

Prosedür

1. Deparafinizasyon
   1. FFPE bölümlerini düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   2. 1 mL ksilen ekleyin, kısaca girdaplayın.
   3. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   4. 14.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin; süpernatanı atın.
   5. Ksilen yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (Adım 2-4).
   6. Peleti 1 mL � etanol, girdap ile yıkayın, ardından 14.000 × g'da 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
   7. Etanol yıkamayı bir kez daha tekrarlayın (toplam 2 etanol yıkama).
   8. Artık etanolü buharlaştırmak için açık kapaklarla oda sıcaklığında 10 dakika boyunca havayla kurutun.
2. Protein Ekstraksiyonu ve Sonikasyon
   1. Her kuru pelete 200 μL lizis tamponu ekleyin.
      Not: Sonikatör 1 mL'ye kadar barındırmasına rağmen, 200 μL aşağı akış işleme için idealdir.

   2. Girdaplama veya hafif pipetleme ile karıştırın.
3. İlk Termal İnkübasyon
   1. Tüpleri 95 ° C'de 30 dakika inkübe edin, bir termomikser veya ısı bloğu kullanarak 400 rpm'de çalkalayın.
   2. Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika soğumaya bırakın.
4. VialTweeter ile İlk Sonikasyon
   1. Tüpleri VialTweeter'a yerleştirin.
   2. VialTweeter UP200St'yi aşağıdaki değerlere ayarlayın ve sonikasyon.
Sonikatör Ayarları
• Genliği (A) 0'e ayarlayın
• Nabız modunu (C) 0'e ayarlayın
• Dönem Saati: Açık
• Zamanında Açılma Süresi: 60s
• Kapalı Kalma Süresi: 30s
• Sınır Değer: 15 dk (10 döngüye karşılık gelir)
(Hesaplama Notu: (60 sn Açık + 30 sn Kapalı) × 10 döngü = 900 sn = 15 dk)
5. İkinci Termal İnkübasyon
   Tüpleri çıkarın ve 95 ° C'de 15 dakika, 400 rpm boyunca tekrar inkübe edin.
6. İkinci Sonication
   Ek 10 döngü (toplam 15 dakika) için aynı ayarları (yukarıdaki gibi) kullanarak VialTweeter'da sonikasyonu tekrarlayın.
7. Lizatın Açıklığa Kavuşturulması
   1. Numuneleri 13.000 × g'da 23°C'de (oda sıcaklığında) 10 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanı dikkatlice yeni bir 2.0 mL Güvenli kilitli Eppendorf tüpüne toplayın. Peleti rahatsız etmekten kaçının.
8. Aşağı Akış İşleme
   Lizat artık SP3 temizliği ve enzimatik sindirim için hazırdır.

Notlar ve En İyi Uygulamalar

1. Sonikasyon sırasında aşırı ısınma riski, programlanmış ON / OFF döngüsü ile azaltılır.
2. Protein agregasyonunu önlemek için sonikasyon sonrası girdaptan kaçının.

Atık Bertarafı ve Güvenliği

Aşağıdaki tablo size laboratuvar boyutu ultrasonicators yaklaşık işleme kapasitesi hakkında bir gösterge vermektedir: