FFPE Yüksek Verimli Numune Hazırlama: Protein Ekstraksiyonu ve Nükleik Asit Kesme

SSS
Aşağıda, FFPE doku hazırlığı ve FFPE örneklerinin ultrasonikasyonu ile ilgili sık sorulan soruları yanıtlıyoruz.

FFPE doku nasıl hazırlanır?

FFPE Doku Hazırlama Adımları: Taze dokunun titiz bir şekilde işlenmesi ve işlenmesi, yüksek kaliteli FFPE numuneleri oluşturmak için kritik öneme sahiptir. Hücresel mimarinin, nükleik asitlerin ve proteinlerin korunmasını sağlamak, doğru aşağı akış analizi için çok önemlidir. Toplamadan gömmeye kadar her adım, histolojik inceleme, immünohistokimya ve moleküler çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli analizler için numunenin bütünlüğünü korumak için hassasiyet gerektirir. Düzgün bir şekilde yürütülen bu fiksasyon ve gömme işlemi, korunan dokunun in vivo durumu doğru bir şekilde yansıtmasını sağlayarak güvenilir teşhis ve araştırma sonuçları sağlar.
FFPE doku örneklerinin gömülmesi sürecinin 6 ana adımında size yol gösteriyoruz.

• Doku Toplama
  Canlı memelilerden alınan biyopsiler ve doku kültürleri, FFPE numune hazırlama için taze doku elde etmek için uygun kaynaklardır.
  Aseptik bir teknik kullanmak önemlidir: Kontaminasyonu önlemek için steril aletler ve eldivenler kullanın. İdeal olarak, dokuları cerrahi süit veya laminer akış başlığı gibi steril bir ortamda toplayın.
  Numune çok hassas olduğundan, hassas kullanımı esastır: İşlemedeki gecikmeleri en aza indirin ve eksizyondan hemen sonra doku işlemeye başlayın. Bu, otoliz ve bozulmayı önlemek için çok önemlidir. Dokuyu oda sıcaklığında tutun; Buz kristali oluşumuna ve doku hasarına neden olabileceğinden donmaktan kaçının.
• Doku Fiksasyonu
  İlk olarak, doku fiksatif bir çözelti ile muamele edilir: Nötr bir pH'a tamponlanmış, sudaki% 4 formaldehite eşdeğer olan% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) kullanın.
  Dokuyu tamamen formaline batırın. En az 10:1'lik bir fiksatif-doku-hacim oranı sağlayın. Fiksasyon süresi, doku tipine ve boyutuna bağlı olarak tipik olarak 6 ila 24 saat arasında değişir. Fiksatifin dokuya iyice nüfuz edebilmesi önemlidir. Bununla birlikte, aşırı fiksasyon, antijen alımını zorlaştıran çapraz bağlanmaya yol açabilirken, yetersiz fiksasyon, zayıf doku korumasına neden olabilir.
• Doku Düzeltme
  İkinci olarak, fiksatifin yeterli penetrasyonuna izin vermek için dokuyu yaklaşık 3-5 mm kalınlığa kadar kesin. İlgili histolojik yapıları yakalamak için dokunun uygun şekilde yönlendirildiğinden emin olun. Bu, doku daha sonra analiz için kullanıldığında ekstraksiyon işlemini kolaylaştırır.
• Sabitlenmiş numunenin işlenmesi
  Şimdi, sabit doku dehidre edilmelidir: Fiksasyondan sonra, parafin mumunun tam olarak nüfuz etmesini sağlamak için dokunun kurutulması gerekir. Suyu çıkarmak için dokuyu kademeli bir etanol serisinden (p, �, � ve 0) geçirin.
  Ksilen ile temizleme: Parafin mumu suda çözünmez, ancak ksilen içinde çözünür. Bu nedenle, dokudaki su ksilen ile değiştirilmelidir. Bununla birlikte, ksilenin kendisi suda çözünmez, ancak alkolde çözünür, bu da suyun ilk olarak alkolle değiştirildiği bir ara adım gerektirir. Etanolü çıkarmak ve dokuyu parafin infiltrasyonu için hazırlamak için dokuyu ksilen veya bir ksilen ikamesine daldırın.
  Parafin kullanarak sızma: Dokuyu erimiş parafin mumuna gömün ve tam sızmayı sağlayın. Bu adım tipik olarak, tam bir emprenye işlemi sağlamak için birkaç parafin değişikliğini içerir.
• Dokunun Gömülmesi
  Bu adımda, doku bir doku bloğu halinde kalıplanır: Dokuyu istenen yönde bir kalıba yerleştirin ve üzerine erimiş parafin dökün. Parafinin oda sıcaklığında veya soğuk bir tabakta soğutarak katılaşmasına izin verin.
• Kesit Alma ve Montaj
  Mikrotomi: Gömülü dokuyu dilimlemek için, parafin bloğundan ince kesitleri (tipik olarak 4-5 mikrometre) kesmek için bir mikrotom kullanın. Daha sonra numune monte edilir ve daha sonra boyama ve mikroskobik analiz için bölümler cam slaytlara yerleştirilir.
  Son olarak, histolojinin kalitesini kontrol edin: Uygun fiksasyon ve işlemeyi sağlamak için ilk bölümleri mikroskop altında değerlendirin. Doku tipine ve gözlemlenen kaliteye göre protokolleri gerektiği gibi ayarlayın.

 
FFPE dokuları, RNA, DNA ve proteinleri geri kazanmanın yanı sıra kanser veya diğer hastalıkların belirtilerini keşfetmek için kullanılabilir. Yıllarca saklanabilirler ve araştırmacıların ve doktorların teşhis ve araştırma için doku örneklerinden nasıl yararlandıklarının önemli bir parçasıdırlar.

FFPE doku ile ilgili yaygın sorunlar ve zorluklar nelerdir?

Formalinle Sabitlenmiş, Parafine Gömülü (FFPE) doku örnekleri araştırma ve teşhiste yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak çeşitli zorluklar ve yaygın problemler sunarlar:

• Biyomoleküllerin Bozunması: Uzun süreli fiksasyon, DNA, RNA ve proteinlerin bozulmasına yol açabilir ve bu da sonraki uygulamalar için yüksek kaliteli nükleik asitlerin veya proteinlerin çıkarılmasını zorlaştırır. Dokunun korunması için doğru fiksasyon (az ve aşırı fiksasyondan kaçınmak) esastır.

Çapraz bağlama: Formalin fiksasyonu, proteinlerin ve nükleik asitlerin çapraz bağlanmasına neden olur, bu da moleküler analizi engelleyebilir ve immünohistokimya ve diğer tahlillerin doğruluğunu etkileyebilir.

• Antijen Maskeleme: Fiksasyon işlemi, immünohistokimya ve diğer immünolojik testlerde antikor bağlanmasının etkinliğini azaltarak antijenik bölgeleri maskeleyebilir. Bu genellikle antijen alımını gerektirir, bu da bir epitopun maskelenmesinin tersine çevrildiği ve epitop-antikor bağlanmasının yeniden sağlandığı bir prosedürdür. Bununla birlikte, tam antijenite her zaman geri yüklenemeyebilir.
• Değişken Fiksasyon Kalitesi: Fiksasyon süreleri ve koşullarındaki farklılıklar, sonuçların tekrarlanabilirliğini ve karşılaştırılabilirliğini etkileyerek tutarsız numune kalitesine yol açabilir. Güvenilir fiksasyon protokolleri kullanın ve yetersiz ve aşırı fiksasyondan kaçının.
• DNA Hasarı ve Parçalanması: FFPE örneklerinin formalin fiksasyonu, sitozin deaminasyonu (C'den T'ye mutasyonlar), oksidatif hasar (örneğin, G'den T'ye mutasyonlara yol açan 8-okso-guanin) dahil olmak üzere çeşitli DNA hasarlarına ve ayrıca DNA polimeraz aktivitesini engelleyen çentikler, boşluklar ve abazik bölgeler gibi fiziksel bozulmalara neden olabilir. Formalin fiksasyon işlemi, DNA'nın parçalanmasına neden olarak PCR ve dizileme gibi genetik ve genomik analizleri karmaşıklaştırabilir.
• RNA Kalitesi: FFPE dokularından ekstrakte edilen RNA genellikle parçalanır ve kimyasal olarak modifiye edilir, bu da yüksek kaliteli transkriptomik analizlerin gerçekleştirilmesini zorlaştırır.
• Protein Modifikasyonları: Formalin, proteinlerde kimyasal modifikasyonlara neden olabilir, yapılarını ve işlevlerini etkileyebilir ve bu da proteomik analizlere müdahale edebilir.
• Örnek İşleme Eserleri: Gömme ve kesit alma işlemi sırasında, mekanik stres ve ısı, artefaktlara neden olabilir ve dokuya daha fazla zarar verebilir.
• Partiden partiye değişkenlik: Farklı partiler arasındaki fiksasyon ve gömme protokollerindeki farklılıklar, sonuçlarda önemli değişkenliğe yol açarak çalışmalar arasındaki karşılaştırmaları zorlaştırabilir.
• Depolama Sorunları: FFPE bloklarının uzun süreli depolanması, zaman içinde ek bozulmaya ve nükleik asit bütünlüğünün kaybına yol açarak arşiv örneklerinin retrospektif çalışmalar için uygulanabilirliğini etkileyebilir.

Optimize edilmiş protokollerin kullanılması, dikkatli numune işleme ve gelişmiş tekniklerin uygulanması, FFPE dokularından elde edilen verilerin kalitesini ve güvenilirliğini artırmaya yardımcı olur.

FFPE ve donmuş doku arasındaki fark nedir?

FFPE (Formalinle Sabitlenmiş, Parafin Gömülü) doku, dokuyu sabitlemek için formalin kullanılarak korunur ve daha sonra parafin mumuna gömülür, bu da doku morfolojisini korurken oda sıcaklığında uzun süreli depolamaya izin verir. Buna karşılık, donmuş doku, nükleik asitlerin ve proteinlerin bütünlüğünü daha iyi koruyan ancak çok düşük sıcaklıklarda depolama gerektiren dondurma yoluyla hızla korunur.

FFPE gömme için hangi kimyasallar kullanılır?

FFPE gömme için kullanılan kimyasallar normalde sabitleme için formalin ve gömme için parafin mumu içerir. FFPE gömme için, dokular tipik olarak ya  (h/h) nötr tamponlu formalin (FA) ya da paraformaldehit tozundan yapılmış taze hazırlanmış %4 (a/h) formaldehit çözeltisi (PFA) kullanılarak sabitlenir. Sudaki bir formaldehit çözeltisi olan formalin, doku morfolojisini korumak ve aşırı çapraz bağlanmayı önlemek için nötr bir pH'a tamponlanır. Paraformaldehit bazlı çözelti ayrıca proteinleri çapraz bağlayarak etkili bir fiksasyon sağlar, böylece daha sonra parafin mumuna gömülmek üzere doku yapısını stabilize eder. Bu kimyasallar, fiksasyon ve gömme işlemi sırasında doku bütünlüğünü ve morfolojisini korumak için gereklidir.

FFPE örneklerinden parafin nasıl çıkarılır?

FFPE örneklerinden parafini çıkarmak için, doku bölümleri tipik olarak bir dizi ksilen yıkamasına tabi tutulur, ardından kademeli bir dizi alkol ve son olarak su yoluyla rehidrasyon yapılır. Ksilen oldukça toksik olduğundan, solunum sorunları, cilt tahrişi ve tekrarlanan maruz kalma ile potansiyel uzun vadeli etkiler gibi sağlık riskleri oluşturduğundan, ultrasonik parafin giderimi birçok laboratuvarda umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmaktadır. Bu yöntem, ksilen gibi toksik çözücülere ihtiyaç duymadan parafini verimli ve güvenli bir şekilde uzaklaştırmak için yoğun ultrasonik dalgalar kullanır, böylece laboratuvar personeli için riski azaltır ve daha güvenli bir çalışma ortamı yaratır.

İyi bir FFPE numune kalitesi için dokularımı ne kadar süre sabitlemeliyim?

Fiksasyon süresi için genel öneriler tipik olarak doku örneklerinin 24 ila 48 saat boyunca formalin içinde sabitlenmesini önerir. Bu süre genellikle doku morfolojisini ve hücresel yapıları korumak için yeterlidir ve aşırı fiksasyonu en aza indirirken, nükleik asitlerin ve proteinlerin aşırı çapraz bağlanmasına ve bozulmasına yol açabilir. Bununla birlikte, optimal fiksasyon süresi, dokunun boyutuna ve tipine bağlı olarak değişebilir ve daha küçük veya daha hassas numuneler daha kısa fiksasyon süreleri gerektirir. Doku otolizini ve bozulmasını önlemek için yeterli fiksasyonu dengelemek ve aynı zamanda aşağı akış moleküler analizlerini karmaşıklaştırabilecek uzun süreli fiksasyondan kaçınmak çok önemlidir.