Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) Test Protokolü

Biyofilm Bazlı Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) testi, koruyucu hücre dışı matrisleri nedeniyle yüksek direnç gösteren biyofilm ile ilişkili mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal ajanların etkinliğini değerlendirmek için önemli bir yöntemdir. Bu tahlildeki çok önemli bir adım, doğru canlılık değerlendirmesi için gömülü hücreleri serbest bırakmak için biyofilm yapılarının bozulmasıdır. UIP400MTP çok kuyulu plaka sonikatörü, kontrollü kavitasyon oluşturmak için odaklanmış ultrason kullanarak, biyofilm hücrelerini verimli bir şekilde ayırarak ve bunları düzgün bir süspansiyona dağıtarak bu işlemi kolaylaştırır. Bu hassas ve tekrarlanabilir biyofilm bozulması, MIC testlerinin güvenilirliğini ve verimini artırarak UIP400MTP biyofilm araştırmalarını ilerletmede önemli bir araç haline getirir.

Biyofilm Dekolmanı için Sonikasyon

Biyofilm Bazlı MIC Testi tipik olarak kaplama, koloni sayımı veya optik yoğunluk ölçümleri gibi yöntemleri kullanarak bakteriyel canlılığı veya büyüme inhibisyonunu ölçer. Sonikasyon, biyofilm ile ilişkili mikroorganizmaların antimikrobiyal duyarlılığını değerlendirirken biyofilm bazlı MIC testlerinde kritik bir adımdır. Birincil işlevi, biyofilm matrisine gömülü hücreleri, doğru analiz için tek tip bir süspansiyon halinde ayırmak ve dağıtmaktır.
Biyofilmler, planktonik hücrelere kıyasla antimikrobiyal ajanlara karşı önemli ölçüde daha dirençlidir ve bu da doğru analiz için uygun ayrılmayı kritik hale getirir. Bu işlem sırasında, ultrasonik dalgalar kontrollü kavitasyon oluşturur, biyofilm matrisini parçalar ve gömülü hücreleri geri kazanım ortamı içinde düzgün bir süspansiyona bırakır. Bu adım, kaplama, seyreltme ve koloni sayımı gibi yöntemlerle biyofilm ile dağılmış hücrelerin kesin canlılık değerlendirmelerini sağlar. Sonikasyon yoluyla uygun biyofilm bozulması, artık matris bileşenlerinin hücreleri korumasını önler, aksi takdirde antimikrobiyal aktivitenin hafife alınmasına yol açabilir. Çok kuyulu plaka sonikatör UIP400MTP, bu amaç için özellikle uygundur ve tahlil plakalarının güvenilir ve yüksek verimli bir şekilde hazırlanmasını sağlamak için hassas ve tekrarlanabilir sonikasyon koşulları sunar.

Biyofilm Bazlı Minimum İnhibitör Konsantrasyon Testlerinde Sonikasyon Neden Gereklidir?

Canlılık ölçümleri ve hücre sayımı için, tek hücrelerin tam ve güvenilir bir şekilde ayrılması ve dağıtılması gerekir. UIP400MTP, sağlam tahlil sonuçları için tek tip, zarar vermeyen bir biyofilm ayrılmasını ve hücre dağılımını destekler.

• Biyofilm Karmaşıklığı: Biyofilmler, mikroorganizmaları koruyan ve onları antimikrobiyal ajanlara karşı daha dirençli hale getiren hücre dışı polimerik madde (EPS) matrisi ile kaplanmış yapılandırılmış mikrobiyal topluluklardır.
• Üniforma Dağılımı: Biyofilme gömülü hücrelerin canlılığını veya antimikrobiyallere karşı duyarlılıklarını doğru bir şekilde ölçmek için, biyofilm önce yerinden çıkarılmalı ve homojen bir süspansiyona ayrılmalıdır.

Biyofilm Bazlı Minimum İnhibitör Konsantrasyon Test Protokolü

Minimum İnhibitör Konsantrasyon (MIC) testi, mikroorganizmaların görünür büyümesini inhibe etmek için gereken bir antimikrobiyal ajanın en düşük konsantrasyonunu belirler. Bu protokol, biyofilm bozulması için çok kuyulu UIP400MTP plaka sonikatörü kullanan biyofilm ile ilişkili mikroorganizmalar için tasarlanmıştır.

Adım 1: Bakteriyel İnokulumun Hazırlanması

1. Bakteriyel süspansiyonu hazırlayın:
   Bakterileri uygun ortamda orta logaritmik faza kadar büyütün.
   Standartlaştırılmış bir hücre yoğunluğu elde etmek için kültürü seyreltin (ör., 0.5 McFarland standardı veya OD600 ~ 0.1).
2. Antimikrobiyal çözeltiler hazırlayın:
   Bir dizi konsantrasyon oluşturmak için antimikrobiyal ajanı uygun bir ortamda seyreltin (ör., iki katlı seri seyreltmeler).
3. 96 kuyulu plakaya dağıtın:
   Antimikrobiyal çözeltileri, son kuyu hacmi ~150-200 μL olan standart 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin.
   Büyüme kontrollerini (antimikrobiyal yok) ve sterilite kontrollerini (bakteri aşısı yok) dahil edin.

Adım 2: Peg Kapağında Biyofilm Oluşumu

• Mandal kapağını takın:
  Özel mandal kapağını aşılanmış kuyucukların üzerine yerleştirin ve mandalların bakteri süspansiyonuna tamamen daldırıldığından emin olun.
• Plakayı inkübe edin:
  Mandallar üzerinde biyofilm oluşumuna izin vermek için statik koşullar altında belirli bir süre (örneğin 24 saat) uygun sıcaklıkta (örn. 37°C) inkübe edin.

Adım 3: Antimikrobiyal Maruz Kalma

• Mandalları durulayın:
  Peg kapağını bakteri süspansiyonundan çıkarın ve gevşek bir şekilde tutturulmuş planktonik hücreleri çıkarmak için steril salin veya PBS ile nazikçe durulayın.
• Antimikrobiyallere maruz kalma:
  Peg kapağını, daha önce hazırlanan antimikrobiyal seyreltmeleri içeren yeni bir 96 kuyulu plakaya aktarın.
  Antimikrobiyal ajanın biyofilmler üzerinde etki etmesine izin vermek için statik koşullar altında belirli bir süre (örneğin 24 saat) inkübe edin.

Adım 4: Mikroplaka Sonicator ile Sonication UIP400MTP

Sonikasyon adımı, canlılığı değerlendirmek için biyofilmleri peg kapaklarından ayırmak için kritik öneme sahiptir. UIP400MTP sonikatörü için şu adımları izleyin:

1. Kurulumu hazırlayın:
   Her bir oyukta 96 oyuklu taze bir plakayı geri kazanım ortamı (örneğin, nötralize edici et suyu veya steril büyüme ortamı) ile doldurun.
2. Mandal kapağını aktarın:
   Peg kapağını antimikrobiyal tedavi plakasından çıkarın.
   Artık antimikrobiyal ajanları çıkarmak için peg kapağını steril tuzlu su veya PBS ile durulayın.
3. Plakayı sonikatörün içine yerleştirin:
   Mandal kapağını kurtarma ortamı plakasına takın.
   Kurtarma ortamı plakasını UIP400MTP sonikatörüne yerleştirin, plakanın açıklanan kılavuzda olduğu gibi ortalandığından ve sabit oturduğundan emin olun.
4. Sonikasyon parametrelerini ayarlayın:
   Sonikasyon parametrelerini UIP400MTP ayarlayın (ayarlar biyofilme göre ayarlanabilir):
   Genlik:% 70–100.
   Sonikasyon süresi: döngü modunda 1-3 dakika (biyofilm yapısına göre ayarlayın).
5. Sonikat:
   Sonikasyon işlemini başlatın. Ultrasonik dalgalar biyofilm matrisini bozacak ve hücreleri geri kazanım ortamına çıkaracaktır.
6. Süreci izleyin:
   Kuyucuklardaki numune sıcaklığını izlemek için tak-çıkar sıcaklık sensörünü kullanın. UIP400MTP, soğutma için bir laboratuvar soğutucusuna bağlanabilir.
7. Sonikasyon Sonrası İşleme:
   Ayrılmış biyofilmler içeren geri kazanım ortamını, sonraki analizler için hemen yeni bir steril plakaya aktarın.

(A) Biyofilm oluşumu, hücre geri kazanımı ve MIC ve MBEC tayini için kullanılan% 2 glikozlu TSB içeren plaka; (B) Stafilokok biyofilmlerinin oluşumu için pimli kapak.
Pimler üzerinde oluşan biyofilm hücreleri, hücrelerin geri kazanılması için taze kültür ortamı içeren 96 oyuklu plakalarda 5 dakika boyunca sonikasyon (Hielscher Ultrason Teknolojisi) ile yerinden çıkarıldı.
(Resim ve çalışma: ©de Oliveira ve ark., 2016)

Adım 4: Uygulanabilirlik Değerlendirmesi

Plaka ve kültür müstakil biyofilmler:

1. Koloni oluşturan birimleri (CFU) numaralandırmak için geri kazanım ortamının ve plakanın agar üzerine seri seyreltmelerini gerçekleştirin.
2. MIC'i değerlendirin:
   MIC'i, geri kazanım ortamında görünür mikrobiyal büyümeyi tamamen engelleyen en düşük antimikrobiyal konsantrasyon olarak belirleyin.

MIC Minimum İnhibitör Konsantrasyonu: Mikrotitre plakası örneği ve mikrodilüsyon sonuçlarının yorumlanması.
(Çalışma ve görüntü: ©Jaskiewicz ve ark. 2019)

Tasarım, İmalat ve Danışmanlık – Almanya'da Üretilen Kalite

Hielscher ultrasonicators en yüksek kalite ve tasarım standartları için iyi bilinir. Sağlamlık ve kolay kullanım, ultrasonicators'ımızın endüstriyel tesislere sorunsuz bir şekilde entegre edilmesini sağlar. Zorlu koşullar ve zorlu ortamlar Hielscher sonicators tarafından kolayca ele alınır.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknoloji ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı ultrasonicators'a özel önem vermektedir. Tabii ki, Hielscher ultrasonicators CE uyumludur ve UL, CSA ve RoHs gereksinimlerini karşılar.

ASTM E2799 protokolünde biyofilm ayırma için UIP400MTP nasıl kullanıldığını buradan okuyun – MBEC testi kullanılarak Pseudomonas aeruginosa biyofilmine karşı dezenfektan etkinliğinin test edilmesi.