Antimikrobiyal Değerlendirme için ASTM E2799-22 Protokolü

Hielscher UIP400MTP, ASTM E2799-22 protokolündeki sonikasyon adımını kolaylaştırmak üzere tasarlanmış, güçlü ve verimli bir çok kuyucuklu plak sonikatörüdür. UIP400MTP, mikrotitre plağının tamamına eşit dağılımlı ultrasonik enerji ileterek hücrelere zarar vermeden veya numune bütünlüğünü bozmadan biyofilmlerin pimli kapaklardan tutarlı ve güvenilir biçimde ayrılmasını sağlar. Yüksek numune işleme kapasitesi ve kullanıcı dostu kullanımı, tekrarlanabilirliği artırırken işlem süresini önemli ölçüde azaltır; bu da cihazı biyofilm canlılık analizleri ve antimikrobiyal etkinlik testleri yapan laboratuvarlar için ideal bir çözüm haline getirir.

ASTM E2799

ASTM E2799, özellikle Pseudomonas aeruginosa’ya odaklanarak antimikrobiyal ajanların biyofilmlere karşı etkinliğini değerlendirmek üzere tasarlanmış, standartlaştırılmış bir test yöntemidir. Biyofilmler, yüzeylere tutunan ve antimikrobiyal uygulamalara karşı artmış direnç gösteren karmaşık mikrobiyal topluluklardır; bu nedenle sağlık hizmetlerinde, endüstride ve çevresel bağlamlarda önemli bir zorluk oluştururlar. Bu yöntem, dezenfektanların gerçekçi biyofilm koşullarında test edilmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir çerçeve sunmak amacıyla Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu (MBEC) analizini kullanır.

Sonikasyon ASTM E2799’a Nasıl Katkıda Bulunur?

Sonikasyon, biyofilmlerin test yüzeylerinden ayrılmasını kolaylaştırarak uygulama sonrasında mikrobiyal canlılığın doğru değerlendirilmesini sağlar ve ASTM E2799 protokolünde kritik bir rol oynar. Protokol, kontrollü ultrasonik enerji kullanarak hücrelere zarar vermeden biyofilmlerin verimli ve tutarlı biçimde parçalanmasını sağlar; böylece hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edilmesini mümkün kılar. Bu, ASTM E2799’u biyofilm araştırmalarını ilerletmek ve etkili antimikrobiyal stratejiler geliştirmek için vazgeçilmez bir araç haline getirir.

MBEC Analizi ASTM E2799-22’ye Uygun Olarak Nasıl Yürütülür?

ASTM E2799-22 protokolü, antimikrobiyal ajanların biyofilmlere karşı etkinliğini değerlendirme adımlarını tanımlar. Hielscher UIP400MTP mikrotitre plak sonikatörü kullanıldığında protokol, biyofilmlerin ayrılması için bu gelişmiş sonikasyon yöntemini içerecek şekilde uyarlanabilir. Aşağıda, UIP400MTP mikroplak sonikatörünün kullanımına uyarlanmış adımlar açıklanmaktadır:

1. Biyofilmlerin Hazırlanması
   Çıkarılabilir pimli kapakları olan steril bir 96 kuyucuklu mikrotitre plağı hazırlayın.
   Kuyucuklara, uygun bir üreme besiyerinde hazırlanmış standartlaştırılmış bir bakteri süspansiyonu inoküle edin.
   Pimlerin bakteri süspansiyonuna tamamen daldırıldığından emin olarak pimli kapağı plağın üzerine yerleştirin.
   Pimlerde biyofilm oluşumuna olanak tanımak için plağı kontrollü koşullarda (ör. sıcaklık ve süre) inkübe edin.
2. Antimikrobiyal Ajanlarla Uygulama
   Biyofilm oluşumundan sonra besiyerini, farklı konsantrasyonlarda test antimikrobiyal ajanlarını içeren taze besiyeriyle değiştirin.
   Pimli kapağı yeniden takın ve test tasarımında belirtilen koşullarda inkübe edin.
3. Biyofilmlerin Ayrılması için Hazırlık
   Uygulamadan sonra, kalıntı antimikrobiyal ajanları ve gevşek biçimde tutunmuş planktonik hücreleri uzaklaştırmak için pimli kapağı steril bir durulama çözeltisine daldırarak durulayın.
4. UIP400MTP Sonikatörü Kullanılarak Biyofilmlerin Ayrılması
   Hücrelerin geri kazanılması için bir besiyeri (ör. nötralize edici sıvı besiyeri) içeren yeni bir 96 kuyucuklu mikrotitre plağı hazırlayın.
   Pimli kapağı geri kazanım besiyerini içeren plağın kuyucuklarına yerleştirerek biyofilmleri ayırın.
   Kapak ve plağın düzgün hizalandığından emin olarak plağı UIP400MTP sonikatörüne yerleştirin.
   Hücre lizisi olmadan biyofilmlerin tutarlı biçimde ayrılmasını sağlamak için sonikatörü %70–%80 genliğe ayarlayın ve döngü modunda 3–4 dakika sonikasyon uygulayın.
5. Biyofilm Canlılığının Değerlendirilmesi
   Sonikasyondan sonra, ayrılmış biyofilm hücrelerini içeren geri kazanım besiyerini aşağıdaki gibi standart mikrobiyolojik veya analitik tekniklerle işleyin:
   • Koloni oluşturan birim (CFU) sayımları: Canlı hücreleri saymak için seri seyreltmeler yapın ve agar üzerine ekim yapın.
   • Optik yoğunluk (OD) ölçümleri: Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için spektrofotometrik analiz kullanın.
   • Floresans temelli canlılık analizleri: Floresan boyalar kullanarak canlı ve ölü hücrelerin miktarını belirleyin.
6. Veri Analizi
   Antimikrobiyal ajanların etkinliğini belirlemek için uygulama yapılmış ve yapılmamış biyofilmlerin canlılık verilerini karşılaştırın.
   Canlı biyofilm hücrelerini ortadan kaldırmak için gereken konsantrasyona dayanarak minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunu (MBEC) hesaplayın.
7. Kalite Kontrol
   UIP400MTP cihazını düzenli olarak kalibre ederek ve biyofilmleri ayırma işleminin önemli düzeyde hücre lizisine veya tahribatına yol açmadığını doğrulayarak tutarlı sonikasyon koşulları sağlayın.
   Sonuçları doğrulamak için uygulama yapılmamış biyofilmler ve yalnızca besiyeri içeren kör numuneler gibi uygun kontrolleri dahil edin.

Pimlerde oluşan biyofilm hücreleri, hücrelerin geri kazanılması için taze kültür besiyeri içeren 96 kuyucuklu plaklarda 5 min boyunca sonikasyon (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Almanya, UIP250MTP) uygulanarak yerlerinden ayrıldı.
(Görsel ve çalışma: ©de Oliveira et al., 2016)

UIP400MTP cihazının ASTM E2799-22 iş akışına entegre edilmesiyle biyofilmleri ayırma işlemi tutarlılık, verimlilik ve yüksek numune işleme kapasiteli uygulamalar açısından optimize edilir.