96 Kuyucuklu Plaka Sonikatörü UIP400MTP ile MBEC Test Protokolü

MBEC testi, pimli kapaklarda oluşan biyofilmleri ortadan kaldırmak için gereken antimikrobiyal ajan konsantrasyonunu belirlemek amacıyla kullanılır. Biyofilm canlılığını değerlendirmek için biyofilmler önce 96 kuyucuklu bir plakanın pimli kapağından ayrılmalıdır. Sonikasyon, bu ayırma işlemi için en güvenilir ve en verimli yöntemdir. Çok kuyucuklu plaka sonikatörü UIP400MTP, test plakalarını maksimum verimlilik ve kullanım kolaylığıyla işlemek üzere özel olarak tasarlanmıştır; yüksek numune işleme kapasiteli MBEC testlerini kolaylaştırır ve hızlandırır.

Biyofilmlerin Ayrılması için Sonikasyon

Sonikasyon, Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu (MBEC) testlerinde kritik bir adımdır ve biyofilm hücrelerinin tutundukları yüzeyden etkili biçimde ayrılmasını mümkün kılar. Biyofilmler, doğaları gereği hücre dışı bir matriks içinde bulunan yapılandırılmış mikroorganizma topluluklarıdır; bu özellik onları planktonik hücrelere kıyasla antimikrobiyal ajanlara karşı önemli ölçüde daha dirençli kılar. MBEC testleri sırasında sonikasyon, kontrollü kavitasyon oluşturmak için ultrasonik dalgalar kullanarak biyofilm matriksini parçalar ve matriks içindeki hücreleri bir süspansiyona serbest bırakır. Bu adım, biyofilm hücrelerinin geri kazanım besiyerinde homojen biçimde dağılmasını sağlayarak ekim, seyreltme veya spektrofotometrik yöntemlerle doğru canlılık değerlendirmeleri yapılmasını kolaylaştırır. Biyofilmler uygun biçimde ayrılmadığında, kalan matriks bileşenleri hücreleri koruyabilir ve antimikrobiyal etkinliğin olduğundan düşük değerlendirilmesine yol açabilir. Bu nedenle sonikasyon, test edilen ajanların gerçek eradikasyon potansiyelini yansıtan güvenilir ve tekrarlanabilir MBEC değerleri elde etmek için vazgeçilmezdir. Çok kuyucuklu plaka sonikatörü UIP400MTP, test plakalarında yüksek numune işleme kapasitesiyle kolay numune hazırlamaya olanak tanır.

Minimum Biyofilm Eradikasyon Konsantrasyonu (MBEC) Test Protokolü

Adım 1: Biyofilm Oluşumu

1. Bakteri süspansiyonunu hazırlayın:
   Bakterileri uygun besiyerlerinde logaritmik büyüme fazına kadar büyütün.
   Bakteri kültürünü belirli bir optik yoğunluğa (ör. OD600 ~0,1) kadar seyreltin.
2. 96 kuyucuklu plakayı inoküle edin:
   Standart bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasının her kuyucuğuna bakteri süspansiyonunu (ör. 150–200 µL) ekleyin.
3. Pimli kapağı takın:
   Pim yüzeylerinde biyofilm oluşumuna olanak tanımak için pimli kapağı inoküle edilmiş plakanın üzerine yerleştirin.
4. Plakayı inkübe edin:
   Biyofilm büyümesini desteklemek için düzeneği uygun bir sıcaklıkta (ör. 37°C), çalkalamadan 24–48 saat inkübe edin.

Adım 2: Antimikrobiyal Ajanlarla İşlem

• Antimikrobiyal çözeltileri hazırlayın:
  Taze besiyerlerinde farklı konsantrasyonlarda antimikrobiyal çözeltiler hazırlayın.
  Biyofilmleri antimikrobiyal ajanlara maruz bırakın:
  Pimli kapağı bakteri kültüründen çıkarın ve planktonik hücreleri uzaklaştırmak için steril salin veya PBS ile durulayın.
  Pimli kapağı, antimikrobiyal çözeltileri içeren yeni bir 96 kuyucuklu plakaya yerleştirin.
• Plakayı inkübe edin:
  Antimikrobiyal maruziyetin gerçekleşmesi için belirli bir süre (ör. 24 saat) inkübe edin.

Adım 3: 96 Kuyucuklu Plaka Sonikatörü UIP400MTP ile Sonikasyon

Sonikasyon adımı, canlılığı değerlendirmek üzere biyofilmleri pimli kapaklardan ayırmak için kritik öneme sahiptir. UIP400MTP sonikatörü için şu adımları izleyin:

1. Düzeneği hazırlayın:
   Yeni bir 96 kuyucuklu plakanın her kuyucuğunu geri kazanım besiyeriyle (ör. nötralize edici sıvı besiyeri veya taze büyüme besiyeri) doldurun.
2. Pimli kapağı aktarın:
   Pimli kapağı antimikrobiyal işlem plakasından çıkarın.
   Kalan antimikrobiyal ajanları uzaklaştırmak için pimli kapağı steril salin veya PBS ile durulayın.
3. Plakayı ve sonikatörü konumlandırın:
   Pimli kapağı geri kazanım besiyeri içeren plakaya takın.
   Geri kazanım besiyeri içeren plakayı UIP400MTP sonikatörünün platformuna yerleştirin ve plakanın ortalanmış ve sabit olduğundan emin olun.
4. Sonikasyon parametrelerini ayarlayın:
   UIP400MTP sonikatöründe sonikasyon parametrelerini ayarlayın (ayarlar biyofilme göre uyarlanabilir):
   Genlik: %70–100.
   Sonikasyon süresi: döngü modunda 1–3 dakika (biyofilmin dayanıklılığına göre ayarlayın).
5. Sonikasyon uygulayın:
   Sonikasyon işlemini başlatın. Ultrasonik titreşim, biyofilmleri pim yüzeylerinden ayırarak geri kazanım besiyerine aktaracaktır.
6. İşlemi izleyin:
   Kuyucuklardaki numune sıcaklığını izlemek için takılabilir sıcaklık sensörünü kullanın. UIP400MTP, soğutma amacıyla bir laboratuvar soğutucusuna bağlanabilir.
7. Sonikasyon sonrası işlemler:
   Geri kazanım besiyerini (artık ayrılmış biyofilmleri içeren) sonraki analizler için hemen yeni bir steril plakaya aktarın.

(A) %2 glikoz içeren TSB bulunan, biyofilm oluşumu, hücrelerin geri kazanılması ve
MIC ve MBCB tayini için kullanılan plaka; (B) Stafilokokal biyofilmlerin oluşumu için pimli kapak. MIC ve MBCB tayini; (B) Stafilokokal biyofilmlerin oluşumu için pimli kapak.
Pimlerde oluşan biyofilm hücreleri, hücrelerin geri kazanılması için taze kültür besiyeri içeren 96 kuyucuklu plakalarda 5 min boyunca sonikasyon (Hielscher Ultrasound Technology) uygulanarak ayrıldı.
(Görsel ve çalışma: ©de Oliveira et al., 2016)

Adım 4: Canlılık Değerlendirmesi

Ayrılmış biyofilmleri ekin ve kültüre alın:

1. Koloni oluşturan birimleri (CFU) saymak için geri kazanım besiyerinin seri seyreltmelerini yapın ve agar üzerine ekin.
   Alternatif olarak kolorimetrik veya floresans temelli bir canlılık testi kullanın.
2. Sonuçları kaydedin:
   MBEC değerini, saptanabilir biyofilm canlılığını ortadan kaldıran en düşük antimikrobiyal konsantrasyon olarak belirleyin.

Tasarım, Üretim ve Danışmanlık – Almanya’da Üretilen Kalite

Hielscher sonikatörleri, en yüksek kalite ve tasarım standartlarıyla tanınır. Dayanıklılık ve kolay kullanım, sonikatörlerimizin endüstriyel tesislere sorunsuz biçimde entegre edilmesine olanak tanır. Hielscher sonikatörleri, zorlu koşulların ve güçlük yaratan ortamların kolayca üstesinden gelir.

Hielscher Ultrasonics, ISO sertifikalı bir şirkettir ve en son teknolojiye ve kullanıcı dostu özelliklere sahip yüksek performanslı sonikatörlere özel önem verir. Elbette Hielscher sonikatörleri CE gerekliliklerine uygundur ve UL, CSA ve RoHs gerekliliklerini karşılar.

MBEC testiyle Pseudomonas aeruginosa biyofilmine karşı dezenfektan etkinliğini test etmek için uygulanan ASTM E2799 protokolü sırasında, UIP400MTP sonikatörünün numune hazırlama adımı olarak biyofilmlerin ayrılmasında nasıl kullanıldığını buradan okuyun.