การแยกกลุ่มเซลล์ในตัวอย่างแบคทีเรียด้วยอัลตราซาวนด์

ตัวอย่างแบคทีเรียที่ได้รับมักไม่ได้อยู่ในรูปสารแขวนลอยของเซลล์เดี่ยวอย่างแท้จริง เชื้อเพาะเลี้ยงเจริญเป็นสายและฟล็อก เชื้อที่แยกได้จากสิ่งแวดล้อมก่อตัวเป็นกลุ่มที่ยึดกันด้วยสารพอลิเมอร์นอกเซลล์ และตะกอนที่ได้จากการปั่นเหวี่ยงมักแขวนลอยใหม่ได้ยาก แม้จะผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์อย่างทั่วถึงแล้วก็ตาม การนับเซลล์ที่มีชีวิต การวัดความหนาแน่นเชิงแสง โฟลว์ไซโตเมทรี และการวิเคราะห์องค์ประกอบไมโครไบโอมล้วนตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าอนุภาคหนึ่งอนุภาคเท่ากับเซลล์หนึ่งเซลล์ การแยกกลุ่มเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์แก้ข้อขัดแย้งนี้ได้ โดยการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์เป็นช่วงสั้น ๆ อย่างควบคุมจะแยกกลุ่มเซลล์ออกเป็นเซลล์เดี่ยวโดยไม่ทำให้เซลล์แตก

เหตุใดการรวมกลุ่มของเซลล์จึงทำให้ผลลัพธ์ของคุณคลาดเคลื่อน

การรวมกลุ่มเป็นลักษณะทางชีววิทยา ไม่ใช่ข้อผิดพลาดในการเตรียมตัวอย่าง Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces และสิ่งมีชีวิตอีกหลายชนิดจากสิ่งแวดล้อมเจริญเป็นสาย กลุ่ม หรือชิ้นส่วนไบโอฟิล์ม และ DNA นอกเซลล์กับพอลิแซ็กคาไรด์ยึดเซลล์เข้าด้วยกันในตะกอนและของเหลวที่ชะออกจากก้านป้ายตัวอย่าง ผลกระทบต่อการวิเคราะห์เกิดขึ้นอย่างเป็นระบบดังนี้:

• จำนวนโคโลนีถูกประเมินต่ำกว่าความเป็นจริง เพราะกลุ่มเซลล์หนึ่งกลุ่มให้โคโลนีหนึ่งโคโลนี ไม่ว่าจะมีเซลล์อยู่กี่เซลล์ก็ตาม
• การวัดความหนาแน่นเชิงแสงและเครื่องนับอนุภาครายงานกลุ่มเซลล์แทนเซลล์ ทำให้เส้นโค้งการเจริญเติบโตคลาดเคลื่อน
• โฟลว์ไซโตเมทรีและการคัดแยกเซลล์นับเหตุการณ์ที่เกิดจากเซลล์ซึ่งจับกลุ่มกันผิดพลาด และตัดเหตุการณ์เหล่านั้นออกจากการวิเคราะห์
• การสกัด DNA และโปรตีนสะท้อนเฉพาะเซลล์ที่อยู่บนผิวของกลุ่มเซลล์ ทำให้ข้อมูลไมโครไบโอมและโอมิกส์คลาดเคลื่อน

วิธีแก้ไขแบบดั้งเดิมทำงานช้า ให้ผลไม่สมบูรณ์ หรือก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงทางเคมี การดูดจ่ายด้วยปิเปตและการผสมด้วยเครื่องวอร์เท็กซ์อย่างแรงยังคงเหลือกลุ่มเซลล์ขนาดเล็กไว้ การทำให้กระจายด้วยเอนไซม์หรือสารคีเลตเปลี่ยนแปลงผิวเซลล์ที่คุณอาจตั้งใจจะวิเคราะห์ การแยกกลุ่มด้วยกลไกทางกายภาพผ่านคาวิเทชันที่ควบคุมได้ทำงานภายในไม่กี่วินาทีและไม่ต้องใช้สารเติมแต่ง

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์แยกกลุ่มเซลล์โดยไม่ทำให้เซลล์แตกได้อย่างไร

การแยกกลุ่มเซลล์ด้วยอัลตราซาวนด์อาศัยความแตกต่างของความแข็งแรงเชิงกล กลุ่มแบคทีเรียยึดกันด้วยพันธะระหว่างเซลล์ที่ค่อนข้างอ่อนและเมทริกซ์นอกเซลล์ ขณะที่ส่วนห่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ทนต่อแรงเฉือนได้สูงกว่ามาก เมื่อคลื่นอัลตราซาวนด์ที่ผ่านการสอบเทียบเข้าสู่สารแขวนลอย คาวิเทชันจากคลื่นเสียงจะสร้างการไหลระดับจุลภาค พัลส์ความดัน และแรงเฉือน ซึ่งออกฤทธิ์ที่รอยต่อของกลุ่มเซลล์ก่อน กลุ่มเซลล์ สายเซลล์ และชิ้นส่วนไบโอฟิล์มถูกแรงเฉือนแยกออกจากกัน (การแยกกลุ่มที่เกาะกัน) ก่อนที่พลังงานจะถึงระดับที่ทำให้เยื่อหุ้มแตก (การแตกของเซลล์)

การแยกกลุ่มเซลล์แบคทีเรียด้วยอัลตราซาวนด์

การแยกกลุ่มหรือการแตกของเซลล์ – พารามิเตอร์การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์มีความสำคัญอย่างไร

ผลในทางปฏิบัติคือ การแยกกลุ่มและการทำให้เซลล์แตกทำได้ด้วยเครื่องเดียวกันที่ใช้พารามิเตอร์ต่างกัน เมื่อใช้แอมพลิจูดปานกลาง รอบพัลส์สั้น และอุณหภูมิที่ควบคุมได้ คุณจะได้สารแขวนลอยของเซลล์เดี่ยวที่มีชีวิต การเพิ่มแอมพลิจูด ระยะเวลาที่ได้รับคลื่น หรืออุณหภูมิตัวอย่างจะเปลี่ยนกระบวนการไปสู่การทำลายเซลล์อย่างสมบูรณ์เพื่อเข้าถึงสารเป้าหมายภายในเซลล์ เครื่องกำเนิดคลื่นของ Hielscher ช่วยให้คุณตั้งค่าแอมพลิจูด กำลัง พัลส์ และพลังงานที่ป้อนได้อย่างแม่นยำ พร้อมบันทึกวิธีการไว้ จึงทำซ้ำขั้นตอนการแยกกลุ่มได้อย่างสม่ำเสมอระหว่างตัวอย่าง ผู้ปฏิบัติงาน และรอบการทำงาน

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์แบบไม่สัมผัสอย่างมีประสิทธิภาพ

การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ในอ่างไม่สามารถควบคุมได้เทียบเท่านี้ อ่างและถังทำความสะอาดด้วยอัลตราซาวนด์ให้พลังงานอัลตราซาวนด์เพียงระดับต่ำ ซึ่งส่งผลให้การเตรียมตัวอย่างไม่สมบูรณ์ และคาวิเทชันเกิดขึ้นไม่สม่ำเสมอ แต่ละหลอดจึงได้รับการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ตามตำแหน่งที่อยู่ในอ่าง VialTweeter ส่งแรงอัลตราซาวนด์ที่เข้มข้นและรวมเฉพาะจุดผ่านผนังภาชนะโดยตรงเข้าสู่ตัวอย่างที่ปิดสนิทได้สูงสุด 10 ตัวอย่างพร้อมกัน กระบวนการที่ต้องใช้เวลาสัมผัสคลื่นนานและแปรผันในอ่างจะเสร็จสมบูรณ์ด้วยรูปแบบพัลส์ที่เป็นมาตรฐาน
เครื่องอัลตราซาวนด์แบบไม่สัมผัสของ Hielscher ส่งคลื่นอัลตราซาวนด์ที่เข้มข้นและรวมเฉพาะจุดผ่านผนังขวดที่ปิดสนิท VialTweeter ประมวลผลขวดได้สูงสุด 10 ขวดพร้อมกันด้วยความเข้มเท่ากัน โดยไม่มีหัวโพรบอยู่ในตัวอย่าง ไม่มีการปนเปื้อนข้าม และไม่มีการปล่อยละอองลอย เมื่อจำเป็นต้องรองรับตัวอย่างจำนวนมาก เครื่องอัลตราซาวนด์สำหรับไมโครเพลต UIP400MTP และ UIP550MTP จะขยายการถ่ายโอนพลังงานที่ควบคุมได้แบบเดียวกันนี้ไปยังเพลตหลายหลุม

ข้อดีของการแยกกลุ่มด้วยอัลตราซาวนด์แบบไม่สัมผัส

• ไม่มีการปนเปื้อนข้าม: เนื่องจากขวดปิดสนิทอยู่ตลอดเวลาและไม่มีหัวโพรบจุ่มลงในตัวอย่าง จึงหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนข้ามและการสูญเสียตัวอย่างได้อย่างสมบูรณ์ ไม่มีสิ่งใดต้องทำให้ปราศจากเชื้อระหว่างตัวอย่าง และรอบการทำงานหนึ่งไม่สามารถส่งผลกระทบต่อรอบถัดไปได้
• การป้องกันละอองลอย: การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ด้วยหัวโพรบในระบบเปิดก่อให้เกิดละอองลอยที่มีเชื้อและทำให้พื้นผิวเครื่องมือปนเปื้อน การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์กับขวดที่ปิดสนิทกักตัวอย่างไว้ภายในหลอดของตัวอย่างเอง ซึ่งมีความสำคัญเมื่อจัดการแบคทีเรียก่อโรค เช่น Mycobacterium tuberculosis และเชื้ออื่น ๆ ในระดับ BSL-2 หรือ BSL-3
• ไม่มีการสึกกร่อนของปลายหัวโพรบ: หัวโพรบไทเทเนียมสามารถปล่อยอนุภาคขนาดเล็กปริมาณเล็กน้อยลงในตัวอย่างระหว่างการทำงาน อนุภาคเหล่านั้นทำให้ค่าความหนาแน่นเชิงแสงและจำนวนอนุภาคในขั้นตอนถัดไปเปลี่ยนไป การใช้คลื่นอัลตราซาวนด์ทางอ้อมผ่านผนังภาชนะขจัดแหล่งกำเนิดของแข็งนี้ได้ทั้งหมด
• การประมวลผลตัวอย่างอย่างสม่ำเสมอ: VialTweeter ส่งคลื่นอัลตราซาวนด์ที่มีความเข้มเท่ากันไปยังขวดแต่ละขวดได้สูงสุด 10 ขวด ผลการใช้คลื่นอัลตราซาวนด์จึงสม่ำเสมอและทำซ้ำได้ ผลกระทบจากตำแหน่งที่เป็นปัญหาในอ่างและการใช้หัวโพรบกับตัวอย่างทีละตัวอย่างหมดไป และค่าฐานของคุณยังคงเปรียบเทียบกันได้ระหว่างตัวอย่างซ้ำ
• ความสมบูรณ์ของตัวอย่าง: หลอดปิดสนิทตลอดกระบวนการ ตัวอย่างจึงไม่สามารถปนเปื้อน เสื่อมสภาพ หรือระเหยได้ สามารถใช้กับปริมาตรเล็กน้อยโดยไม่ต้องเจือจาง รวมถึงตะกอนตัวอย่างทางคลินิกอันมีค่าที่ไม่สามารถเพิ่มขั้นตอนการถ่ายย้ายได้
• การควบคุมกระบวนการ: แอมพลิจูดปรับได้ตั้งแต่ 20 ถึง 100% โหมดพัลส์ปรับได้ตั้งแต่ 0 ถึง 100% และระบบรองรับการตรวจติดตามอุณหภูมิ เพื่อให้สายพันธุ์และโปรตีนที่ไวต่ออุณหภูมิอยู่ต่ำกว่าระดับที่ก่อให้เกิดความเสียหาย

การใช้งานทั่วไป

• การวิเคราะห์ไมโครไบโอมและสิ่งที่อยู่ภายในลำไส้: ทำให้ Lactobacillus, Bifidobacterium และตัวอย่างอุจจาระกระจายตัวก่อนเพาะบนเพลตหรือหาลำดับเบส เพื่อไม่ให้กลุ่มเซลล์ทำให้จำนวนที่นับได้ต่ำลง
• จุลชีววิทยาอาหารและน้ำ: แยกฟล็อกในตัวอย่างจากก้านป้าย ของเหลวล้าง และอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวเพิ่มจำนวน เพื่อให้ตรวจหาจำนวนโคโลนีและการมีชีวิตได้อย่างแม่นยำ
• การวิจัยไบโอฟิล์ม: แยกเก็บเซลล์จากวัสดุรองรับและพื้นผิวให้อยู่ในรูปสารแขวนลอยของเซลล์เดี่ยว โดยไม่ใช้เอนไซม์ซึ่งจะกำจัดโปรตีนบนผิวเซลล์ออก
• การวินิจฉัยทางคลินิก: ทำให้เสมหะ หนอง และของเหลวที่ชะออกจากก้านป้ายตัวอย่างแขวนลอยใหม่ภายใต้สภาวะกักกัน
• การเพาะเลี้ยงเซลล์: แยกกลุ่มเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เซลล์แมลง และเซลล์ CHO ที่จับกันออกก่อนการนับและการถ่ายเลี้ยง
• การเตรียมตัวอย่างตลอดกระบวนการ: เครื่องเดียวกันที่แยกกลุ่มด้วยแอมพลิจูดต่ำสามารถทำลายเซลล์อย่างสมบูรณ์ได้เมื่อใช้ค่าตั้งที่สูงขึ้น จึงทำให้เซลล์แตก สกัดโปรตีน และทำให้ DNA แตกเป็นชิ้นต่อได้โดยไม่ต้องถ่ายย้ายหลอด

วรรณกรรม / เอกสารอ้างอิง

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.