Ultrazvuková disagregácia buniek v bakteriálnych vzorkách
Bakteriálne vzorky sa zriedka dodávajú vo forme skutočných jednobunkových suspenzií. Kultúry rastú v reťazcoch a zhlukoch, izoláty z prostredia tvoria agregáty viazané extracelulárnymi polymérnymi látkami a odstredené pelety sa často nedajú resuspendovať ani napriek dôkladnému premiešavaniu na vortexe. Počty životaschopných buniek, optická hustota, prietoková cytometria aj profilovanie mikrobiómu vychádzajú z predpokladu, že jedna častica sa rovná jednej bunke. Ultrazvuková dezagregácia buniek tento konflikt rieši: krátke, kontrolované impulzy ultrazvuku rozdeľujú agregáty na jednotlivé bunky bez ich lýzy.
Prečo agregácia buniek negatívne ovplyvňuje vaše výsledky
Agregácia je biologický jav, nie chyba pri príprave vzorky. Baktérie rodu Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces a mnohé druhy pochádzajúce z prostredia rastú v reťazcoch, zhlukoch alebo vo fragmentoch biofilmu, pričom extracelulárna DNA a polysacharidy spájajú bunky do zhlukov v peletách a eluátoch z výterov. Analytické dôsledky sú systematické:
- Počet kolónií je podhodnotený, pretože jeden zhluk tvorí jednu kolóniu bez ohľadu na to, koľko buniek obsahuje.
- Meranie optickej hustoty a počítadlá častíc zaznamenávajú agregáty namiesto buniek, čo skresľuje krivky rastu.
- Pri prietokovej cytometrii a triedení buniek sa zhluknuté udalosti nesprávne spočítajú a sú vylúčené z analýzy.
- Extrakcie DNA a bielkovín zachytávajú iba bunky nachádzajúce sa na povrchu agregátu, čo skresľuje údaje o mikrobióme a omických analýzach.
Bežné metódy sú pomalé, neúplné alebo spôsobujú chemické zmeny. Intenzívne pipetovanie a miešanie vo vortexe zanechávajú mikroagregáty. Enzymatická disperzia alebo disperzia na báze chelátorov mení povrch buniek, ktoré chcete analyzovať. Mechanická dezagregácia pomocou riadenej kavitácie pôsobí v priebehu sekúnd a nevyžaduje žiadne prísady.
Jeden agregát sa rovná jednej kolónii – a jeden nesprávny výsledok. Pozrite sa, ako ultrazvuková dezagregácia vytvára skutočné jednobunkové suspenzie bez lýzy, aerosólov alebo manipulácie so sondami. Vyžiadajte si ďalšie informácie!
Sonikátor s viacerými trubicami VialTweeter pre bezkontaktnú prípravu vzoriek: Rozbijte zhluky buniek v uzavretých skúmavkách
Ako sonikácia rozdeľuje bunky bez ich lýzy
Ultrazvuková dezintegrácia buniek využíva rozdiel v mechanickej pevnosti. Bakteriálne agregáty sú držané pohromade relatívne slabými medzibunkovými väzbami a extracelulárnou matricou, zatiaľ čo intaktný bunkový obal odoláva podstatne vyššiemu šmykovému namáhaniu. Keď kalibrované ultrazvukové vlny preniknú do suspenzie, akustická kavitácia vytvára mikroprúdy, tlakové impulzy a šmykové sily, ktoré pôsobia najskôr na rozhraniach agregátov. Zhluky, reťazce a fragmenty biofilmu sa od seba oddelia (deaglomerácia) ešte pred dosiahnutím energetickej hladiny, pri ktorej dochádza k prasknutiu membrán (lýza).
Ultrazvuková dezagregácia zhlukov bakteriálnych buniek
Rozklad alebo lýza – Prečo sú parametre ultrazvukovej úpravy dôležité
Z toho prakticky vyplýva, že dezagregácia a lýza sú rovnaké postupy vykonávané s rôznymi parametrami. Pri strednej amplitúde, krátkych pulzných cykloch a kontrolovanej teplote získate životaschopnú suspenziu jednotlivých buniek. Zvýšením amplitúdy, doby pôsobenia alebo teploty vzorky sa proces posúva smerom k úplnému rozrušeniu buniek pre intracelulárne ciele. Generátory spoločnosti Hielscher vám umožňujú presne nastaviť amplitúdu, výkon, impulzy a prísun energie a uložiť metódu, vďaka čomu je krok dezagregácie reprodukovateľný naprieč vzorkami, obsluhou a sériami meraní.
Efektívna bezkontaktná sonikácia
Ultrazvukové čistenie v kúpeľoch nedokáže dosiahnuť takúto kontrolu. Ultrazvukové čistiace kúpele a nádrže poskytujú len nízku úroveň ultrazvukovej energie, čo má za následok neúplnú prípravu, a kavitácia prebieha nerovnomerne, takže každá skúmavka je ošetrená podľa svojej polohy v kúpeli. VialTweeter prenáša intenzívne, zamerané ultrazvukové sily priamo cez stenu nádoby do až 10 uzavretých vzoriek súčasne. Ošetrenia, ktoré vyžadujú dlhé, variabilné pôsobenie v kúpeli, sa vykonávajú v štandardizovanom pulznom režime.
Bezkontaktné ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher pôsobia intenzívnym, zameraným ultrazvukom cez steny uzavretých skúmaviek. Zariadenie VialTweeter spracováva až 10 skúmaviek súčasne pri rovnakej intenzite, bez sondy vo vzorke, bez krížovej kontaminácie a bez uvoľňovania aerosólu. Ak to vyžaduje priepustnosť, ultrazvukové zariadenia pre mikrotitračné doštičky UIP400MTP a UIP550MTP rozširujú ten istý kontrolovaný prenos energie aj na doštičky s viacerými jamkami.
The VialTweeter sonikuje súčasne až 10 menších fľaštičiek a až 5 väčších skúmaviek.
Výhody bezkontaktnej ultrazvukovej dezagregácie
- Žiadna krížová kontaminácia: Keďže skúmavky zostávajú trvalo uzavreté a do vzorky sa neponára žiadna sonda, úplne sa tak zabráni krížovej kontaminácii a strate vzorky. Medzi jednotlivými vzorkami nie je potrebné nič sterilizovať a jeden cyklus nemôže ovplyvniť nasledujúci.
- Ochrana pred aerosólmi: Ultrazvuková úprava s otvorenou sondou vytvára infekčné aerosóly a kontaminuje povrchy prístrojov. Ultrazvuková úprava v uzavretej skúmavke udržiava vzorku vo vnútri vlastnej skúmavky, čo je dôležité pri manipulácii s patogénnymi baktériami, ako je Mycobacterium tuberculosis, a inými látkami triedy BSL-2 alebo BSL-3.
- Žiadna strata špičky: Titanové sondy môžu počas prevádzky uvoľňovať do vzorky malé množstvo mikročastíc. Tieto častice menia optickú hustotu a počet častíc v ďalšej časti systému. Nepriama ultrazvuková úprava cez stenu nádoby tento zdroj pevných látok úplne eliminuje.
- Rovnomerná priepustnosť: Zariadenie VialTweeter dodáva rovnakú intenzitu ultrazvuku do každej z až 10 skúmaviek, vďaka čomu sú výsledky sonikácie rovnomerné a reprodukovateľné. Vymiznú vplyvy polohy, ktoré sú problémom pri použití kúpeľov a sondovania jednotlivých vzoriek, a vaše základné hodnoty zostanú porovnateľné vo všetkých opakovaných meraniach.
- Integrita vzorky: Skúmavky zostávajú počas celého spracovania uzavreté, takže vzorka nemôže byť kontaminovaná, poškodená ani sa nemôže vyparovať. Malé objemy sa spracúvajú bez riedenia, vrátane cenných klinických peliet, pri ktorých si nemôžeme dovoliť ďalší krok s prenosom.
- Riadenie procesu: Amplitúda je nastaviteľná v rozmedzí od 20 do 100 %, pulzný režim od 0 do 100 % a systémy podporujú monitorovanie teploty, aby sa teplocitlivé kmene a proteíny udržali pod prahmi, ktoré by im mohli spôsobiť poškodenie.
Typické aplikácie
- Analýza mikrobiómu a obsahu čriev: rozptýlenie baktérií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium a vzoriek stolice pred nanesením na kultivačné platne alebo sekvenovaním, aby sa zabránilo skresleniu výsledkov zhlukovaním.
- Mikrobiológia potravín a vody: rozpad flokúl vo výteroch, výplachoch a obohacovacích živných médiách na účely presného stanovenia počtu kolónií a životaschopnosti.
- Výskum biofilmov: izolácia buniek z nosičov a povrchov vo forme suspenzí jednotlivých buniek bez enzymatickej úpravy, ktorá by odstránila povrchové proteíny.
- Klinická diagnostika: resuspendovanie spúta, hnisu a eluátov z výterov za podmienok izolácie.
- Bunka kultúra: oddelenie zhluknutých agregátov cicavcov, hmyzu a CHO pred spočítaním a pasážovaním.
- Príprava v rámci celého pracovného postupu: ten istý prístroj, ktorý pri nízkej amplitúde vykonáva dezintegráciu, pri vyšších nastaveniach zabezpečuje úplné rozbitie buniek, takže lýza, extrakcia bielkovín a fragmentácia DNA prebiehajú bez nutnosti prelievania do iných skúmaviek.
Sonikátor s viacerými jamkami UIP400MTP na vysokokapacitnú deaglomeráciu zhlukov buniek
Modely sonikátorov na mikrotitračné doštičky UIP400MTP a UIP550MTP spracúvajú nielen doštičky s viacerými jamkami, ale aj stojany na skúmavky.
Nájdite si ten správny sonikátor pre váš pracovný postup dezintegrácie
VialTweeter Multi-Tube Sonicator
Metóda voľby pre rozbíjanie aglomerátov v sterilných, uzavretých injekčných liekovkách. Vďaka 200-wattovému procesoru UP200St pracujúcemu na frekvencii 26 kHz s automatickým ladením VialTweeter nepriamo prenáša ultrazvuk cez steny až 10 uzavretých injekčných liekoviek súčasne, s výkonom až 10 W na jednu liekovku, čím zabezpečuje rovnomerné a reprodukovateľné výsledky bez krížovej kontaminácie a bez straty vzorky. Titanová sonotróda VialTweeter je autoklávovateľná a amplitúda aj impulz sú nastaviteľné a uložiteľné, čo predstavuje rozsah regulácie potrebný pre protokol deaglomerácie. Štandardná 10-pozíciová sonotróda je kompatibilná s fľaštičkami pre automatický vzorkovač, skúmavkami pre mikrocentrifúgu a skúmavkami Eppendorf alebo Nunc s objemom 1 až 5 ml. Upínacie zariadenie VialPress pojme až 5 väčších nádob s priemerom do 20 mm.
K dispozícii sú špecializované jednofľaškové modely VialTweeter určené pre trubice Falcon, ako aj pre jednotlivé fľašky prispôsobené veľkosti nádoby. Po rozobratí blokovej sonotródy funguje základná jednotka UP200St ako bežný sondový sonikátor na priamu úpravu malých až stredne veľkých vzoriek.
Ultrazvukové prístroje pre mikrotitračné doštičky
Rozšírenie na prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou pomocou ultrazvukovej úpravy na doskách s viacerými jamkami: V prípade pracovných postupov založených na doskách umožňujú ultrazvukové zariadenia pre mikrodosky UIP400MTP a UIP550MTP rozšíriť bezkontaktnú a rovnomernú ultrazvukovú úpravu z desiatich skúmaviek na celú dosku.
400-wattový prístroj UIP400MTP je určený na spracovanie štandardných mikrotitračných a viacjamkových doštičiek, vrátane formátov s 96 jamkami, a ponúka presné nastavenie amplitúdy, výkonu a pulzovania, ako aj časovač, teplotnú sondu a chladenie vo vodnom kúpeli. Odstraňovanie biofilmu a spracovanie bakteriálnych kultúr sú osvedčené aplikácie ultrazvukového zariadenia UIP400MTP pre mikrotitrové platničky.
Model UIP550MTP s výkonom 550 wattov je výkonnejšou voľbou – ideálne pre náročnejšie použitia.
Oba bezkontaktné ultrazvukové systémy spoľahlivo spracúvajú 6-, 12-, 24-, 48-, 96- a 384-jamkové platničky, ako aj stojany na skúmavky a Petriho misky. Sonikátory na mikrotitračné doštičky spoločnosti Hielscher fungujú s akoukoľvek štandardnou doštičkou, čím sa vyhnete nákladným proprietárnym spotrebným materiálom. Vďaka programovateľným teplotným limitom sa sonikácia automaticky pozastaví pri dosiahnutí maximálnej teploty vzorky a po ochladení sa opäť spustí, čím sa zachová životaschopnosť buniek aj pri opakovaných cykloch. Inteligentná a spoľahlivá príprava vzoriek s vysokou priepustnosťou pre opakovateľné výsledky.
V nasledujúcej tabuľke nájdete prehľad približnej spracovateľskej kapacity našich laboratórnych ultrazvukových zariadení na spracovanie vzoriek, ktoré sa používajú v oblasti prírodných vied, genomiky, proteomiky a diagnostiky:
| Odporúčané zariadenia | Objem dávky | Prietok |
|---|---|---|
| VialTweeter Multi-Tube Sonicator | 0ampulky s objemom 0,5 až 1,5 ml | N.A. |
| Ultrazvukový prístroj UIP400MTP pre viacjamkové platničky (440 wattov) | viacjamkové / mikrotitračné platne | N.A. |
| Ultrazvukový prístroj UIP550MTP pre platničky s viacerými jamkami (550 wattov) | viacjamkové / mikrotitračné platne | N.A. |
| Ultrazvukový CupHorn | CupHorn pre injekčné liekovky alebo kadičky | N.A. |
| UP100H – ultrazvukový prístroj so sondou s výkonom 100 wattov | 1 až 500 ml | 10 až 200 ml/min |
| UP200Ht, UP200St Modely ultrazvukových prístrojov s sondou s výkonom 200 wattov | 10 až 1000 ml | 20 až 200 ml/min |
| UP400St – ultrazvukový prístroj so sondou s výkonom 400 wattov | 10 až 2000 ml | 20 až 400 ml/min |
| GDmini2 | sterilný ultrazvukový reaktor s mikroprúdom | N.A. |
| Ultrazvuková trepačka na sito | N.A. | N.A. |
Najčastejšie otázky týkajúce sa ultrazvukovej dezintegrácie buniek
Aký je rozdiel medzi dezintegráciou buniek a lýzou buniek?
Disagregácia, nazývaná aj deaglomerácia, rozdeľuje zhluknuté bunky na suspenziu jednotlivých buniek, pričom bunky zostávajú neporušené a životaschopné. Lýza narúša bunkovú membránu a uvoľňuje intracelulárny obsah. Oba procesy sú poháňané kavitačným šmykom, pričom rozdiel spočíva v prívode energie. Vďaka optimalizovaným nastaveniam amplitúdy, impulzov a teploty sa pomocou sonikácie dosahuje dezagregácia pod prahom lýzy.
Prečo nie sú ultrazvukové kúpele vhodné na štandardizované rozrušovanie?
Kúpele poskytujú len nízku úroveň ultrazvukovej energie, čo vedie k neúplnej príprave, a kavitácia sa v nádrži vyvíja veľmi nerovnomerne, takže každá vzorka je spracovaná odlišne v závislosti od svojej polohy. Mikrobiologické stanovenia a porovnávacie štúdie závisia od porovnateľnosti. Bezkontaktné ultrazvukové zariadenia, ako je napríklad Multi-Tube Sonicator VialTweeter, ako aj modely ultrazvukových zariadení pre mikrotitračné doštičky UIP400MTP a UIP550MTP, spracúvajú všetky nádoby za nastavených ultrazvukových podmienok, čo zlepšuje reprodukovateľnosť medzi replikátmi.
Môže ultrazvuk poškodiť bunky?
Áno, ak nie sú parametre riadené. Nadmerná sonikácia alebo nekontrolované zahrievanie môžu poškodiť bunky a uvoľnená DNA zvyšuje viskozitu vzoriek a podporuje opätovnú agregáciu. Preto by mal byť tento proces starostlivo navrhnutý: stredná amplitúda, pulzné cykly, chladenie a prístroje s obmedzenou teplotou udržujú spracovanie na strane krivky, kde prebieha dezagregácia.
Všetky digitálne ultrazvukové zariadenia spoločnosti Hielscher ponúkajú presne regulovateľné parametre, pripojiteľné teplotné senzory, programovateľné nastavenia a automatické zaznamenávanie údajov pre spoľahlivú prípravu vzoriek.
Je potrebné vzorku preložiť do inej nádoby?
Nie. Skúmavky a doštičky sa spracúvajú v pôvodných, uzavretých obaloch. Nepriama sonikácia zabraňuje stratám pri prelievaní aj prenášaniu látky spojenému s manipuláciou so sondou.
Aké formáty injekčných liekoviek dokáže zariadenie VialTweeter spracovať?
Štandardná 10-pozíciová sonotróda je kompatibilná s fľaštičkami pre automatický vzorkovač, skúmavkami pre mikrocentrifúgu a skúmavkami Eppendorf alebo Nunc s objemom 1 až 5 ml. Príslušenstvo VialPress pojme až 5 väčších nádob s priemerom do 20 mm. K dispozícii sú špecializované modely VialTweeter pre jednu skúmavku, určené pre skúmavky Falcon a pre individuálne formáty s jednou skúmavkou alebo väčšie formáty.
Môžem na jednom prístroji vykonať separáciu a lýzu?
Áno. To isté zariadenie, ktoré pri strednej amplitúde rozdeľuje bunky, pri vyššej amplitúde a dlhšej expozícii spôsobuje úplné rozrušenie buniek, takže prípravu suspenzie z jednotlivých buniek a následnú extrakciu je možné vykonávať za sebou bez zmeny platformy.
Používa sa v testoch MBEC ultrazvuková liečba?
Ultrazvuková liečba je osvedčená a vo veľkej miere štandardná súčasť postupu. V teste MBEC s kolíkmi a viečkom sa po vypestovaní biofilmov na polystyrénových kolíkoch a ich vystavení antibiotiku kolíky prenesú do čerstvého média a podrobia sa vortexovaniu a sonikácii, aby sa uvoľnili a deagregovali priľnuté bunky biofilmu do planktónovej suspenzie pred sériovým riedením a stanovením počtu životaschopných buniek (MBEC sa interpretuje ako najnižšia koncentrácia, pri ktorej sa počet izolovaných buniek zníži o ≥3 log10 v porovnaní s neošetreným biofilmom). Sonikácia výrazne zlepšuje kvalitu disperzie: neúplné uvoľnenie zakorenených buniek z EPS matice vedie k podhodnoteniu eradikácie a k nadhodnoteniu hodnôt MBEC. Cielená sonikácia jamiek s držiakmi kolíkov na testovacích platniach pomocou mikrotitračného sonikátora UIP400MTP prekonáva tradičné slabé stránky sonikácie v kúpeli – konkrétne nerovnomerné rozloženie energie, prehrievanie a riziko kontaminácie aerosólmi alebo krížovej kontaminácie.
Zistite, ako bezkontaktný ultrazvukový prístroj na mikrotitrové doštičky UIP400MTP uľahčuje vykonávanie MBEC testov!
Používa sa ultrazvuk pri stanovovaní minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC)?
Ultrazvuk sa využíva v rôznych pracovných postupoch súvisiacich s MIC s cieľom zvýšiť efektívnosť a reprodukovateľnosť:
- mykobakteriológia, kde sa spútum a iné viskózne vzorky pred testovaním citlivosti rutinne dekontaminujú a homogenizujú, niekedy pomocou ultrazvuku, a kde je pre získanie presných hodnôt MIC vhodné krátke rozptýlenie zhlukov tvoriacich mykobakteriálnych inokúl;
- organizmy náchylné na tvorbu agregátov (napr. streptokoky, stafylokoky vo forme zhlukov), pri ktorých mikroagregáty skresľujú hustotu inokula; a
- kombinovaná diagnostika, ako napríklad ultrazvuková analýza implantátu a kultivácia tekutiny s následným testovaním citlivosti pri infekcii kĺbovej náhrady (aplikácia podobná metóde MBEC, nie klasickému stanoveniu MIC).
Literatúra / Referencie
- FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
- FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
- Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
- Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
- De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.
Vyberte si svoj tanier! Ultrazvukový prístroj pre mikrotitračné doštičky UIP550MTP rozdeľuje bakteriálne vzorky v akejkoľvek štandardnej doske s viacerými jamkami.
Modely sonikátorov Hielscher s viacerými vzorkami UIP400MTP pre mikroplatničky, VialTweeter a Cuphorn: vysokorýchlostná a vysoko výkonná príprava vzoriek