Ultrazvuková disagregácia buniek v bakteriálnych vzorkách

Bakteriálne vzorky sa zriedkavo získavajú ako skutočné suspenzie jednotlivých buniek. Kultúry rastú v reťazcoch a vločkách, izoláty z prostredia tvoria agregáty viazané extracelulárnymi polymérnymi látkami a pelety získané centrifugáciou často odolávajú resuspendovaniu aj napriek dôkladnému premiešaniu na vortexe. Stanovenie počtu životaschopných buniek, optická hustota, prietoková cytometria aj profilovanie mikrobiómu vychádzajú z predpokladu, že jedna častica zodpovedá jednej bunke. Ultrazvuková disagregácia buniek rieši tento rozpor: krátke, kontrolované sonikačné impulzy rozdeľujú agregáty na jednotlivé bunky bez ich lýzy.

Prečo agregácia buniek skresľuje vaše výsledky

Agregácia je biologická vlastnosť, nie chyba pri príprave. Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces a mnohé druhy z prostredia rastú v reťazcoch, zhlukoch alebo fragmentoch biofilmu a extracelulárna DNA a polysacharidy spájajú bunky v peletách a eluátoch z výterov. Analytické dôsledky sú systematické:

• Počty kolónií sa podhodnocujú, pretože jeden zhluk vytvorí jednu kolóniu bez ohľadu na to, koľko buniek obsahuje.
• Meranie optickej hustoty a počítadlá častíc zaznamenávajú agregáty namiesto buniek, čím skresľujú rastové krivky.
• Pri prietokovej cytometrii a triedení buniek sa udalosti zodpovedajúce zhlukom nesprávne započítavajú a vylučujú z analýzy.
• Extrakty DNA a proteínov reprezentujú iba bunky na povrchu agregátu, čím skresľujú údaje o mikrobióme a údaje z omických analýz.

Bežné nápravné postupy sú pomalé, neúplné alebo spôsobujú chemické zmeny. Intenzívne pipetovanie a premiešavanie na vortexe neodstránia všetky mikroagregáty. Enzymatická dispergácia alebo dispergácia pomocou chelatačných činidiel mení povrch buniek, ktorý možno zamýšľate analyzovať. Mechanická disagregácia riadenou kavitáciou účinkuje v priebehu sekúnd a nevyžaduje žiadne prísady.

Ako sonikácia rozdeľuje bunkové agregáty bez lýzy buniek

Ultrazvuková disagregácia buniek využíva rozdiel v mechanickej pevnosti. Bakteriálne agregáty držia pohromade relatívne slabé medzibunkové väzby a extracelulárna matrica, zatiaľ čo neporušený bunkový obal odoláva podstatne vyššiemu šmykovému namáhaniu. Keď kalibrovaný ultrazvuk vstupuje do suspenzie, akustická kavitácia vytvára mikroprúdenie, tlakové impulzy a šmykové sily, ktoré pôsobia najprv na rozhraniach agregátov. Zhluky, reťazce a fragmenty biofilmu sa šmykovými silami rozdeľujú (deaglomerácia) skôr, než sa dosiahne úroveň energie, pri ktorej praskajú membrány (lýza).

Ultrazvuková disagregácia zhlukov bakteriálnych buniek

Disagregácia alebo lýza – aký význam majú parametre sonikácie

V praxi to znamená, že disagregácia a lýza sa vykonávajú tým istým prístrojom pri rôznych parametroch. Pri miernej amplitúde, krátkych pulzných cykloch a riadenej teplote získate suspenziu jednotlivých životaschopných buniek. Zvýšenie amplitúdy, času expozície alebo teploty vzorky posúva proces smerom k úplnému rozrušeniu buniek na získanie intracelulárnych cieľových zložiek. Generátory Hielscher umožňujú presne nastaviť amplitúdu, výkon, pulzy a prívod energie a uložiť metódu, takže krok disagregácie je reprodukovateľný pri rôznych vzorkách, obsluhujúcich pracovníkoch aj cykloch spracovania.

Účinná bezkontaktná sonikácia

Sonikácia v kúpeli nedokáže zabezpečiť takúto úroveň kontroly. Ultrazvukové čistiace kúpele a nádrže poskytujú iba nízku ultrazvukovú energiu, čo vedie k neúplnej príprave, a kavitácia prebieha nerovnomerne, takže každá skúmavka sa spracúva podľa svojej polohy v kúpeli. VialTweeter prenáša intenzívne, sústredené ultrazvukové sily priamo cez stenu nádoby až do 10 uzavretých vzoriek súčasne. Ošetrenia, ktoré v kúpeli vyžadujú dlhú a premenlivú expozíciu, sa vykonajú pomocou štandardizovanej sekvencie impulzov.
Bezkontaktné sonikátory Hielscher aplikujú intenzívny, sústredený ultrazvuk cez steny uzavretých liekoviek. VialTweeter spracúva až 10 liekoviek súčasne pri rovnakej intenzite, bez sondy vo vzorke, bez krížovej kontaminácie a bez uvoľňovania aerosólov. Ak si to vyžaduje kapacita spracovania vzoriek, sonikátory mikrotitračných platničiek UIP400MTP a UIP550MTP rozširujú rovnaký riadený prenos energie aj na viacjamkové platničky.

Výhody bezkontaktnej ultrazvukovej dezagregácie

• Žiadna krížová kontaminácia: Keďže liekovky zostávajú neustále uzavreté a do vzorky sa neponára žiadna sonda, krížová kontaminácia a strata vzorky sú úplne vylúčené. Medzi vzorkami nie je potrebné nič sterilizovať a jeden cyklus spracovania nemôže ovplyvniť nasledujúci.
• Ochrana pred aerosólmi: Sonikácia sondou v otvorenej nádobe vytvára infekčné aerosóly a kontaminuje povrchy prístroja. Pri sonikácii v uzavretej liekovke zostáva vzorka vo vlastnej skúmavke, čo je dôležité pri manipulácii s patogénnymi baktériami, ako je Mycobacterium tuberculosis, a inými biologickými agensmi úrovne BSL-2 alebo BSL-3.
• Žiadna erózia hrotu: Titánové sondy môžu počas prevádzky uvoľňovať do vzorky malé množstvo mikročastíc. Tieto častice menia optickú hustotu a počty častíc v následných meraniach. Nepriama sonikácia cez stenu nádoby tento zdroj pevných častíc úplne eliminuje.
• Rovnomerná kapacita spracovania vzoriek: VialTweeter dodáva rovnakú intenzitu ultrazvuku do každej z až 10 liekoviek, takže výsledky sonikácie sú rovnomerné a reprodukovateľné. Vplyvy polohy, ktoré komplikujú prácu s kúpeľmi a sondovou sonikáciou jednotlivých vzoriek, miznú a východiskové hodnoty zostávajú porovnateľné medzi replikátmi.
• Integrita vzorky: Skúmavky zostávajú počas celého spracovania uzavreté, takže vzorka sa nemôže kontaminovať, znehodnotiť ani vyprchať. Aj malé objemy možno spracovať bez riedenia vrátane cenných klinických peliet, pri ktorých si nemožno dovoliť ďalší krok prenosu.
• Riadenie procesu: Amplitúdu možno nastaviť od 20 do 100%, impulzný režim od 0 do 100% a systémy podporujú monitorovanie teploty, takže termosenzitívne kmene a proteíny zostávajú pod prahovými teplotami poškodenia.

Typické aplikácie

• Analýza mikrobiómu a črevného obsahu: dispergovanie baktérií rodov Lactobacillus a Bifidobacterium a fekálnych vzoriek pred výsevom na platne alebo sekvenovaním, aby zhluky neznižovali zistené počty.
• Mikrobiológia potravín a vody: dezagregácia vločiek vo výteroch, oplachových vzorkách a obohacovacích bujónoch na presné stanovenie počtu kolónií a životaschopnosti.
• Výskum biofilmov: získavanie buniek z nosičov a povrchov vo forme suspenzií jednotlivých buniek bez enzymatického ošetrenia, ktoré by odstránilo povrchové proteíny.
• Klinická diagnostika: resuspendovanie spúta, hnisu a eluátov z výterov za podmienok biologického uzavretia.
• Bunkové kultúry: rozdeľovanie zhlukov buniek cicavcov, hmyzu a CHO pred počítaním a pasážovaním.
• Príprava v rámci celého pracovného postupu: ten istý prístroj, ktorý pri nízkej amplitúde vykonáva dezagregáciu, pri vyšších nastaveniach úplne rozrušuje bunky, takže lýza, extrakcia proteínov a fragmentácia DNA nasledujú bez prenášania vzoriek medzi skúmavkami.

Literatúra / Referencie

• FactSheet VialTweeter – Sonicator for Simultaneous Sample Preparation
• FactSheet UIP400MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• FactSheet UIP550MTP Plate-Sonicator for High-Throughput Sample Preparation – English version – Hielscher Ultrasonics
• Bahnan W, Happonen L, Khakzad H, Kumra Ahnlide V, de Neergaard T, Wrighton S, André O, Bratanis E, Tang D, Hellmark T, Björck L, Shannon O, Malmström L, Malmström J, Nordenfelt P. (2023): A human monoclonal antibody bivalently binding two different epitopes in streptococcal M protein mediates immune function. EMBO Mol Med. 2023 Feb 8;15(2):e16208.
• Wrighton S., Ahnlide V.K., André O., Bahnan W., Nordenfelt P. (2023): Group A streptococci induce stronger M protein-fibronectin interaction when specific human antibodies are bound. Frontiers in Microbiology 14:1069789.
• De Oliveira A, Cataneli Pereira V, Pinheiro L, Moraes Riboli DF, Benini Martins K, Ribeiro de Souza da Cunha MDL (2016): Antimicrobial Resistance Profile of Planktonic and Biofilm Cells of Staphylococcus aureus and Coagulase-Negative Staphylococci. International Journal of Molecular Sciences 17(9):1423; 2016.