Protokol testu minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC)

Test minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) založený na biofilme je kľúčovou metódou na hodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti mikroorganizmom spojeným s biofilmom, ktoré vykazujú zvýšenú rezistenciu vďaka svojej ochranné extracelulárnej matrici. Kľúčovým krokom v tomto teste je oddelenie štruktúr biofilmu s cieľom uvoľniť v ňom uviaznuté bunky a umožniť tak presné posúdenie ich životaschopnosti. Ultrazvukový prístroj UIP400MTP pre viacjamkové platničky uľahčuje tento proces využitím zameraného ultrazvuku na vytvorenie kontrolovanej kavitácie, čím efektívne uvoľňuje bunky z biofilmu a rozptyľuje ich do rovnomernej suspenzie. Toto presné a reprodukovateľné narušenie biofilmu zvyšuje spoľahlivosť a priepustnosť testov MIC, čím sa zariadenie UIP400MTP stáva nevyhnutným nástrojom pri pokroku vo výskume biofilmu.

Prečo by som mal pri stanoveniach MIC používať sonikáciu?

• Presné a reprodukovateľné údaje: Získajte homogénne bunkové suspenzie, ktoré eliminujú vplyv matrice, čím zabezpečíte, že počty kolónií a namerané hodnoty optickej hustoty skutočne odrážajú antimikrobiálnu účinnosť.
• Vysoká priepustnosť: Spracujte celú 96-jamkovú platňu naraz za pouhých 1–3 minúty a nahraďte tak pomalé a nekonzistentné ručné škrabanie zefektívneným pracovným postupom.
• Zachovaná životaschopnosť buniek: Jemne uvoľnite ulpené bunky bez fyzického poškodenia spôsobeného škrabaním, čím sa zachová vyššia miera prežitia pre spoľahlivé výpočty MIC/MBEC.
• Nulové riziko krížovej kontaminácie: Využite výhody bezkontaktnej konštrukcie s miskou a rohom, ktorá spracováva všetky jamky rovnomerne bez toho, aby sa sondy dotýkali jednotlivých vzoriek alebo jamiek.
• Súlad s normami: Zosúlaďte svoju metodiku s overenými odvetvovými protokolmi, ako je ASTM E2799-22, čím zvýšite dôveryhodnosť svojich údajov na regulačné účely alebo na účely publikovania.
• Liečivo Confident & Skríning liečby: Spoliehajte sa na výsledky citlivostných testov, aby ste mohli prijímať informovanejšie rozhodnutia týkajúce sa účinnosti antimikrobiálnych látok, profilovania rezistencie alebo vývoja liečebných postupov.

Sonikácia na oddelenie biofilmu

Test MIC na báze biofilmu zvyčajne meria životaschopnosť baktérií alebo inhibíciu rastu pomocou metód, ako je pokovovanie, počítanie kolónií alebo meranie optickej hustoty. Sonikácia je kritickým krokom v testoch MIC na báze biofilmu pri hodnotení antimikrobiálnej citlivosti mikroorganizmov spojených s biofilmom. Jeho primárnou funkciou je oddeliť a rozptýliť bunky vložené do matrice biofilmu do rovnomernej suspenzie pre presnú analýzu.
Biofilmy sú výrazne odolnejšie voči antimikrobiálnym látkam v porovnaní s planktónovými bunkami, takže správne oddelenie je rozhodujúce pre presnú analýzu. Počas tohto procesu ultrazvukové vlny vytvárajú riadenú kavitáciu, rozbíjajú matricu biofilmu a uvoľňujú vložené bunky do rovnomernej suspenzie v regeneračnom médiu. Tento krok umožňuje presné posúdenie životaschopnosti buniek dispergovaných v biofilme pomocou metód, ako je pokovovanie, riedenie a počítanie kolónií. Správne narušenie biofilmu pomocou sonikácie zabraňuje zvyškovým zložkám matrice chrániť bunky, čo by inak mohlo viesť k podhodnoteniu antimikrobiálnej aktivity. Na tento účel je obzvlášť vhodný UIP400MTP sonikátor s viacjamkovými doštičkami, ktorý ponúka presné a reprodukovateľné podmienky sonikácie na zabezpečenie spoľahlivej a vysokovýkonnej prípravy testovacích platní.

Prečo je sonikácia potrebná pri testoch minimálnej inhibitronej koncentrácie na báze biofilmu

Na meranie životaschopnosti a počítanie buniek je potrebné úplné a spoľahlivé oddelenie a rozptýlenie jednotlivých buniek. UIP400MTP podporuje rovnomerné, nepoškodzujúce oddelenie biofilmu a bunkovú disperziu pre robustné výsledky testu.

• Zložitosť biofilmu: Biofilmy sú štruktúrované mikrobiálne spoločenstvá uzavreté v matrici extracelulárnej polymérnej látky (EPS), ktorá chráni mikroorganizmy a zvyšuje ich odolnosť voči antimikrobiálnym látkam.
• Rovnomerný rozptyl: Na presné meranie životaschopnosti buniek vložených do biofilmu alebo ich náchylnosti na antimikrobiálne látky sa biofilm musí najskôr uvoľniť a rozložiť na homogénnu suspenziu.

Protokol o stanovení minimálnej inhibičnej koncentrácie na báze biofilmu

Test minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) určuje najnižšiu koncentráciu antimikrobiálneho činidla potrebnú na inhibíciu viditeľného rastu mikroorganizmov. Tento protokol je určený pre mikroorganizmy spojené s biofilmom, pričom na narušenie biofilmu sa používa UIP400MTP sonikátor s viacjamkovými platňami.

Krok 1: Príprava bakteriálneho inokula

1. Pripravte bakteriálnu suspenziu:
   Pestujte baktérie vo vhodných médiách do strednej logaritmickej fázy.
   Zrieďte kultúru, aby ste dosiahli štandardizovanú hustotu buniek (napr. 0,5 McFarlandovho štandardu alebo OD600 ~ 0,1).
2. Pripravte antimikrobiálne roztoky:
   Antimikrobiálne činidlo sa zriedi vo vhodnom médiu, aby sa vytvoril rozsah koncentrácií (napr. dvojité sériové riedenia).
3. Dávkovajte do 96jamkovej platne:
   Pridajte antimikrobiálne roztoky do jamiek štandardnej 96-jamkovej platne s konečným objemom jamiek ~150–200 μl.
   Zahŕňajú kontrolu rastu (bez antimikrobiálnych látok) a kontrolu sterility (bez bakteriálneho inokula).

Krok 2: Tvorba biofilmu na veku kolíka

• Nasaďte veko kolíka:
  Umiestnite špecializované veko kolíka na naočkované jamky a uistite sa, že kolíky sú úplne ponorené v bakteriálnej suspenzii.
• Inkubujte tanier:
  Inkubujte pri vhodnej teplote (napr. 37 °C) počas stanoveného obdobia (napr. 24 hodín) za statických podmienok, aby sa umožnila tvorba biofilmu na kolíkoch.

Krok 3: Expozícia antimikrobiálnym látkam

• Opláchnite kolíky:
  Odstráňte viečko kolíčka z bakteriálnej suspenzie a jemne opláchnite sterilným fyziologickým roztokom alebo PBS, aby ste odstránili voľne pripojené planktónové bunky.
• Vystavte antimikrobiálnym látkam:
  Preneste veko kolíka do novej 96jamkovej platne obsahujúcej predtým pripravené antimikrobiálne riedenia.
  Inkubujte po stanovenú dobu (napr. 24 hodín) za statických podmienok, aby antimikrobiálne činidlo mohlo pôsobiť na biofilmy.

Krok 4: Sonikácia pomocou Microplate Sonicator UIP400MTP

Krok sonikácie je rozhodujúci pre oddelenie biofilmov z viečok kolíkov na posúdenie životaschopnosti. Pre UIP400MTP sonikátor postupujte podľa týchto krokov:

1. Pripravte nastavenie:
   Naplňte čerstvú 96-jamkovú platňu regeneračným médiom (napr. neutralizačným vývarom alebo sterilným rastovým médiom) do každej jamky.
2. Preneste veko kolíka:
   Odstráňte veko kolíka z antimikrobiálnej ošetrovacej dosky.
   Opláchnite veko kolíka v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS, aby ste odstránili zvyšky antimikrobiálnych látok.
3. Umiestnite platňu do sonikátora:
   Pripevnite veko kolíka k doske regeneračného média.
   Vložte dosku regeneračného média do UIP400MTP sonikátora a uistite sa, že doska sedí v strede a stabilne, ako je popísané v návode.
4. Upravte parametre sonikácie:
   Parametre sonikácie nastavte na UIP400MTP (nastavenia je možné upraviť podľa biofilmu):
   Amplitúda: 70–100%.
   Čas sonikácie: 1–3 minúty (upravte na základe štruktúry biofilmu) v režime cyklu.
5. Sonikujte:
   Spustite proces sonikácie. Ultrazvukové vlny narušia matricu biofilmu a uvoľnia bunky do regeneračného média.
6. Sledujte proces:
   Pomocou zásuvného snímača teploty monitorujte teplotu vzorky v jamkách. UIP400MTP je možné pripojiť k laboratórnemu chladiču na chladenie.
7. Manipulácia po sonikácii:
   Regeneračné médium obsahujúce oddelené biofilmy sa ihneď prenesie do čerstvej sterilnej platne na následnú analýzu.

(A) platňa obsahujúca TSB s 2 % glukózy používaná na tvorbu biofilmu, regeneráciu buniek a stanovenie MIC a MBEC; (B) Veko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov.
Biofilmové bunky vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology) na 5 minút v 96-jamkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na obnovu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira a kol., 2016)

Krok 4: Posúdenie životaschopnosti

Biofilmy oddelené od platní a kultúry:

1. Vykonajte sériové riedenia regeneračného média a platne na agar, aby ste vymenovali jednotky tvoriace kolónie (CFU).
2. Vyhodnoťte MIC:
   Určte MIC ako najnižšiu antimikrobiálnu koncentráciu, ktorá úplne inhibuje viditeľný mikrobiálny rast v regeneračnom médiu.

Minimálna inhibičná koncentrácia MIC: Príklad mikrotitračnej platne a interpretácia výsledkov mikroriedenia.
(Štúdia a obrázok: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Komu prináša sonikácia výhody pri testoch na stanovenie minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC)?

• Výrobcovia zdravotníckych pomôcok: Cieľom je otestovať účinnosť povrchových povlakov a overiť protokoly čistenia zariadení, na ktorých sa ľahko tvorí biofilm.
• Klinickí mikrobiológovia: Na presnú diagnostiku infekcií súvisiacich s implantátmi (napríklad PJI) prostredníctvom izolácie baktérií z implantátov.
• Vývojári liekov: Cieľom je vyhodnotiť účinnosť nových antimikrobiálnych látok proti rezistentným patogénom zakotveným v biofilme.
• Akademickí výskumníci: Cieľom je uskutočňovať štúdie s vysokou priepustnosťou a reprodukovateľnými výsledkami zamerané na biológiu biofilmov a mechanizmy antimikrobiálnej rezistencie.
• Tímy pre kontrolu kvality v priemysle: Na posúdenie biologického znečistenia a účinnosti dezinfekčných prostriedkov v priemyselnom prostredí (napr. podľa noriem ASTM E2799-22).

Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu sonikátory Hielscher.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Prečítajte si, ako sa UIP400MTP používa na oddelenie biofilmu v protokole ASTM E2799 – Testovanie účinnosti dezinfekčného prostriedku proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocou testu MBEC.