Protokol testu minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC)

Test minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) na báze biofilmu je základnou metódou na hodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti mikroorganizmom spojeným s biofilmom, ktoré vykazujú zvýšenú rezistenciu vďaka svojej ochrannej extracelulárnej matrici. Rozhodujúcim krokom v tomto teste je narušenie štruktúr biofilmu s cieľom uvoľniť vložené bunky na presné posúdenie životaschopnosti. Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP uľahčuje tento proces tým, že využíva sústredený ultrazvuk na generovanie riadenej kavitácie, účinne oddeľuje bunky biofilmu a rozptyľuje ich do rovnomernej suspenzie. Toto presné a reprodukovateľné narušenie biofilmu zvyšuje spoľahlivosť a priepustnosť testov MIC, vďaka čomu je UIP400MTP základným nástrojom pri pokroku vo výskume biofilmu.

Sonikácia na oddelenie biofilmu

Test MIC na báze biofilmu zvyčajne meria životaschopnosť baktérií alebo inhibíciu rastu pomocou metód, ako je pokovovanie, počítanie kolónií alebo meranie optickej hustoty. Sonikácia je kritickým krokom v testoch MIC na báze biofilmu pri hodnotení antimikrobiálnej citlivosti mikroorganizmov spojených s biofilmom. Jeho primárnou funkciou je oddeliť a rozptýliť bunky vložené do matrice biofilmu do rovnomernej suspenzie pre presnú analýzu.
Biofilmy sú výrazne odolnejšie voči antimikrobiálnym látkam v porovnaní s planktónovými bunkami, takže správne oddelenie je rozhodujúce pre presnú analýzu. Počas tohto procesu ultrazvukové vlny vytvárajú riadenú kavitáciu, rozbíjajú matricu biofilmu a uvoľňujú vložené bunky do rovnomernej suspenzie v regeneračnom médiu. Tento krok umožňuje presné posúdenie životaschopnosti buniek dispergovaných v biofilme pomocou metód, ako je pokovovanie, riedenie a počítanie kolónií. Správne narušenie biofilmu pomocou sonikácie zabraňuje zvyškovým zložkám matrice chrániť bunky, čo by inak mohlo viesť k podhodnoteniu antimikrobiálnej aktivity. Na tento účel je obzvlášť vhodný UIP400MTP sonikátor s viacjamkovými doštičkami, ktorý ponúka presné a reprodukovateľné podmienky sonikácie na zabezpečenie spoľahlivej a vysokovýkonnej prípravy testovacích platní.

Prečo je sonikácia potrebná pri testoch minimálnej inhibitronej koncentrácie na báze biofilmu

Na meranie životaschopnosti a počítanie buniek je potrebné úplné a spoľahlivé oddelenie a rozptýlenie jednotlivých buniek. UIP400MTP podporuje rovnomerné, nepoškodzujúce oddelenie biofilmu a bunkovú disperziu pre robustné výsledky testu.

• Zložitosť biofilmu: Biofilmy sú štruktúrované mikrobiálne spoločenstvá uzavreté v matrici extracelulárnej polymérnej látky (EPS), ktorá chráni mikroorganizmy a zvyšuje ich odolnosť voči antimikrobiálnym látkam.
• Rovnomerný rozptyl: Na presné meranie životaschopnosti buniek vložených do biofilmu alebo ich náchylnosti na antimikrobiálne látky sa biofilm musí najskôr uvoľniť a rozložiť na homogénnu suspenziu.

Protokol o stanovení minimálnej inhibičnej koncentrácie na báze biofilmu

Test minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) určuje najnižšiu koncentráciu antimikrobiálneho činidla potrebnú na inhibíciu viditeľného rastu mikroorganizmov. Tento protokol je určený pre mikroorganizmy spojené s biofilmom, pričom na narušenie biofilmu sa používa UIP400MTP sonikátor s viacjamkovými platňami.

Krok 1: Príprava bakteriálneho inokula

1. Pripravte bakteriálnu suspenziu:
   Pestujte baktérie vo vhodných médiách do strednej logaritmickej fázy.
   Zrieďte kultúru, aby ste dosiahli štandardizovanú hustotu buniek (napr. 0,5 McFarlandovho štandardu alebo OD600 ~ 0,1).
2. Pripravte antimikrobiálne roztoky:
   Antimikrobiálne činidlo sa zriedi vo vhodnom médiu, aby sa vytvoril rozsah koncentrácií (napr. dvojité sériové riedenia).
3. Dávkovajte do 96jamkovej platne:
   Pridajte antimikrobiálne roztoky do jamiek štandardnej 96-jamkovej platne s konečným objemom jamiek ~150–200 μl.
   Zahŕňajú kontrolu rastu (bez antimikrobiálnych látok) a kontrolu sterility (bez bakteriálneho inokula).

Krok 2: Tvorba biofilmu na veku kolíka

• Nasaďte veko kolíka:
  Umiestnite špecializované veko kolíka na naočkované jamky a uistite sa, že kolíky sú úplne ponorené v bakteriálnej suspenzii.
• Inkubujte tanier:
  Inkubujte pri vhodnej teplote (napr. 37 °C) počas stanoveného obdobia (napr. 24 hodín) za statických podmienok, aby sa umožnila tvorba biofilmu na kolíkoch.

Krok 3: Expozícia antimikrobiálnym látkam

• Opláchnite kolíky:
  Odstráňte viečko kolíčka z bakteriálnej suspenzie a jemne opláchnite sterilným fyziologickým roztokom alebo PBS, aby ste odstránili voľne pripojené planktónové bunky.
• Vystavte antimikrobiálnym látkam:
  Preneste veko kolíka do novej 96jamkovej platne obsahujúcej predtým pripravené antimikrobiálne riedenia.
  Inkubujte po stanovenú dobu (napr. 24 hodín) za statických podmienok, aby antimikrobiálne činidlo mohlo pôsobiť na biofilmy.

Krok 4: Sonikácia pomocou Microplate Sonicator UIP400MTP

Krok sonikácie je rozhodujúci pre oddelenie biofilmov z viečok kolíkov na posúdenie životaschopnosti. Pre UIP400MTP sonikátor postupujte podľa týchto krokov:

1. Pripravte nastavenie:
   Naplňte čerstvú 96-jamkovú platňu regeneračným médiom (napr. neutralizačným vývarom alebo sterilným rastovým médiom) do každej jamky.
2. Preneste veko kolíka:
   Odstráňte veko kolíka z antimikrobiálnej ošetrovacej dosky.
   Opláchnite veko kolíka v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS, aby ste odstránili zvyšky antimikrobiálnych látok.
3. Umiestnite platňu do sonikátora:
   Pripevnite veko kolíka k doske regeneračného média.
   Vložte dosku regeneračného média do UIP400MTP sonikátora a uistite sa, že doska sedí v strede a stabilne, ako je popísané v návode.
4. Upravte parametre sonikácie:
   Parametre sonikácie nastavte na UIP400MTP (nastavenia je možné upraviť podľa biofilmu):
   Amplitúda: 70–100%.
   Čas sonikácie: 1–3 minúty (upravte na základe štruktúry biofilmu) v režime cyklu.
5. Sonikujte:
   Spustite proces sonikácie. Ultrazvukové vlny narušia matricu biofilmu a uvoľnia bunky do regeneračného média.
6. Sledujte proces:
   Pomocou zásuvného snímača teploty monitorujte teplotu vzorky v jamkách. UIP400MTP je možné pripojiť k laboratórnemu chladiču na chladenie.
7. Manipulácia po sonikácii:
   Regeneračné médium obsahujúce oddelené biofilmy sa ihneď prenesie do čerstvej sterilnej platne na následnú analýzu.

(A) platňa obsahujúca TSB s 2 % glukózy používaná na tvorbu biofilmu, regeneráciu buniek a stanovenie MIC a MBEC; (B) Veko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov.
Biofilmové bunky vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology) na 5 minút v 96-jamkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na obnovu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira a kol., 2016)

Krok 4: Posúdenie životaschopnosti

Biofilmy oddelené od platní a kultúry:

1. Vykonajte sériové riedenia regeneračného média a platne na agar, aby ste vymenovali jednotky tvoriace kolónie (CFU).
2. Vyhodnoťte MIC:
   Určte MIC ako najnižšiu antimikrobiálnu koncentráciu, ktorá úplne inhibuje viditeľný mikrobiálny rast v regeneračnom médiu.

Minimálna inhibičná koncentrácia MIC: Príklad mikrotitračnej platne a interpretácia výsledkov mikroriedenia.
(Štúdia a obrázok: ©Jaskiewicz et al. 2019)

Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu sonikátory Hielscher.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Prečítajte si, ako sa UIP400MTP používa na oddelenie biofilmu v protokole ASTM E2799 – Testovanie účinnosti dezinfekčného prostriedku proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocou testu MBEC.