Protokol o kultivácii a oddelení biofilmu stafylokoka

Štandardizované metódy sú nevyhnutné pre spoľahlivé výsledky výskumu. Tu nájdete protokol o kultivácii a oddelení stafylokokových biofilmov. Tento protokol sa zameriava na efektívnu vysokovýkonnú prípravu vzoriek pomocou UIP400MTP viacjamkového doštičkového sonikátora pre efektívne a vysokovýkonné oddelenie biofilmu v 96-jamkových platniach. Protokol obsahuje aj kľúčové kroky pre kultiváciu, pranie a vizualizáciu biofilmu so zameraním na minimalizáciu variability a zabezpečenie reprodukovateľnosti.

Výskum biofilmu a antibiotík stafylokokov

Biofilmy stafylokokov zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri pretrvávajúcich infekciách vďaka svojej odolnosti voči antibiotikám a imunitným reakciám. Tvorba biofilmu poskytuje baktériám ochranné prostredie, čo sťažuje liečbu infekcií. Výskum biofilmov sa často zameriava na pochopenie ich tvorby, správania a náchylnosti na antimikrobiálne látky s dôrazom na vysokovýkonné metódy na zefektívnenie experimentálnych pracovných postupov.
Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP ponúka významnú výhodu vo výskume biofilmu tým, že umožňuje rýchle a efektívne oddelenie biofilmov od 96-jamkových platní. Toto zariadenie poskytuje rovnomernú ultrazvukovú energiu všetkým jamkám, čím zaisťuje konzistentné výsledky a zároveň minimalizuje variabilitu.

Protokol o kultivácii a oddelení biofilmu stafylokokov

Nižšie vás podrobne prevedieme procesom kultivácie a oddeľovania biofilmu stafylokoka. Ako príklad analytického kroku vám ukážeme, ako kvantifikovať spektrofotometricky kultivovanú biomasu farbením kryštálovou fialovou.

Pestovanie biofilmu stafylokoka

Potrebné materiály:

• Sterilné mikrotitračné platne s plochým dnom s 96-jamkovým polystyrénom ošetrené tkanivovými kultúrami s viečkami
• Tryptický sójový vývar (TSB) s 0,25 % glukózy
• Biologická bezpečnostná skriňa

Kroky:

1. Pripravte sterilné pracovné prostredie v biologickej bezpečnostnej skrini, aby ste minimalizovali kontamináciu.
2. Pridajte TSB obsahujúci 0,25 % glukózy do jamiek mikrotitra. TSB bez glukózy vo všeobecnosti nepodporuje tvorbu biofilmu a má sa používať len ako kontrola, ak je to potrebné.
3. Naočkujte jamky bakteriálnymi kmeňmi pripravenými tak, ako je opísané nižšie:
4. Pripravte bakteriálne suspenzie a zabezpečte, aby neexistovali žiadne už existujúce bunkové zhluky homogenizáciou suspenzií pomocou sonikácie alebo rozbitím zhlukov ihlou s priemerom 23 a krátkym vírením.
5. Dosku uzavrite vekom a inkubujte za podmienok optimálnych pre tvorbu biofilmu (napr. 37 °C po dobu 24 hodín).
6. Vykonajte experiment v troch vyhotoveniach pre každý bakteriálny kmeň (tri jamky na kmeň), aby ste zaistili spoľahlivosť.
7. Pridelte šesť jamiek na platňu pre negatívne kontroly. Na 96-jamkovú platňu je možné testovať až 30 kmeňov.

Vizualizácia a umývanie biofilmu

1. Po inkubácii médium opatrne zlikvidujte, aby nedošlo k narušeniu biofilmu.
2. Každú jamku štyrikrát umyte fyziologickým roztokom, aby ste odstránili planktónové baktérie.
3. Skontrolujte dno jamiek, či neobsahujú biele škvrny naznačujúce prítomnosť biofilmu.

Oddelenie biofilmu pomocou viacjamkového doštičkového sonikátora UIP400MTP

Nastavenie a parametre zariadenia:

• UIP400MTP viacjamkový doštičkový sonikátor
• Prevádzkové nastavenia: 60% amplitúda, cyklický režim so 60 sekundami zapnuté / 30 sekúnd vypnuté

Kroky:

1. Umiestnite umytú mikrotitračnú platňu na UIP400MTP plošinu.
2. Sonikujte samples pri odporúčaných nastaveniach (60 % amplitúda, 60 sekúnd zapnuté, 30 sekúnd vypnuté). Upravte nastavenia na kmeň baktérií.
3. Spustite proces sonikácie na oddelenie biofilmu. Ultrazvukové vlny narúšajú matricu biofilmu a uvoľňujú priľnavé baktérie.
4. UIP400MTP zaisťuje rovnomernú expozíciu vo všetkých jamkách pre konzistentné výsledky oddelenia.

Analytický krok: Kvantifikácia biomasy biofilmu oddeleného stafylokoka pomocou kryštálovej fialovej (CV)

Potrebné materiály:

• 0.1% roztok kryštálovej fialovej (CV)
• 95 % etanolu alebo 30 % kyseliny octovej (na rozpustenie)
• Čítačka mikroplatničiek schopná čítať pri 570 nm
• Sterilné mikrotitračné platne na farbenie

Kroky:

1. Príprava farbiacej platničky: Preneste 100 μl oddelenej suspenzie biofilmu z každej jamky sonikovanej platne do zodpovedajúcich jamiek čistej, sterilnej 96-jamkovej mikrotitračnej platne. To zaisťuje jasné a rovnomerné prostredie na farbenie.
2. Farbenie oddeleného biofilmu: Pridajte 150 μl 0,1% roztoku kryštálovej fialovej do každej jamky obsahujúcej oddelenú suspenziu biofilmu. Jemne pipetujte, aby ste zaistili rovnomerné zmiešanie suspenzie biofilmu a krištáľovej fialovej.
3. Inkubácia: Nechajte platňu inkubovať pri izbovej teplote po dobu 15 minút, aby kryštálová fialová mohla účinne zafarbiť biomasu.
4. Umývanie: Po inkubácii opatrne zlikvidujte roztok kryštálovej fialovej zo jamiek bez narušenia biomasy. Každú jamku trikrát umyte sterilným fyziologickým roztokom, aby ste odstránili neviazané škvrny.
5. Sušenie: Nechajte platňu vyschnúť na vzduchu pri izbovej teplote alebo pod sterilným krytom na prúdenie vzduchu. Vyhnite sa zahrievaniu, pretože to môže zmeniť výsledky.
6. Solubilizácia: Pridajte 200 μl 95% etanolu (alebo 30% kyseliny octovej, v závislosti od štandardných laboratórnych postupov) do každej jamky, aby sa rozpustila viazaná kryštálová fialová. Jemne premiešajte pipetovaním alebo pretrepávaním platne 10 minút pri izbovej teplote.
7. Meranie: Zmerajte optickú hustotu (OD) rozpusteného roztoku kryštálovej fialovej pri 570 nm pomocou čítačky mikroplatní.
8. Analýza údajov: Odpočítajte priemernú hodnotu OD570 negatívnych kontrol (jamky s TSB, ale bez bakteriálneho inokula) z experimentálnych jamiek, aby ste zohľadnili farbenie pozadia. Zaznamenajte a analyzujte údaje.

Poznámka: Vykonajte experiment v troch vyhotoveniach pre každú podmienku, aby ste zaistili reprodukovateľnosť. Zabezpečte správne zaobchádzanie s kryštálovou fialovou a etanolom, dodržiavajte bezpečnostné protokoly a protokoly o likvidácii.
 

Prehľad kľúčových výhod UIP400MTP:

• Vysokovýkonné spracovanie: Navrhnuté špeciálne pre viacjamkové platne, čo vám umožňuje spracovať viacero vzoriek súčasne.
• Rovnomerné rozloženie ultrazvuku: Zaisťuje rovnakú intenzitu ultrazvuku v jamkách a poskytuje konzistentné výsledky vo všetkých vzorkách.
• Použite akúkoľvek štandardnú platňu: UIP400MTP si poradí s akýmikoľvek štandardnými viacjamkovými tanierami, Petriho miskami a stojanmi na rúrky. Nie sú potrebné žiadne drahé proprietárne platne!
• Užívateľsky prívetivé rozhranie: Jednoduché nastavenie a ovládanie, čo z neho robí vynikajúci nástroj na zvýšenie produktivity laboratória. Programovateľné nastavenia a automatizácia uľahčujú štandardizáciu procesov!