Protokol na kultiváciu a oddeľovanie biofilmu Staphylococcus

Štandardizované metódy sú nevyhnutné pre spoľahlivé výsledky výskumu. Tu nájdete protokol na kultiváciu a oddeľovanie stafylokokových biofilmov. Tento protokol sa zameriava na zjednodušenú prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou pomocou ultrazvukového sonifikátora pre viacdôlkové platne UIP400MTP pre efektívne oddeľovanie biofilmov s vysokou priepustnosťou v 96-dôlkových platniach. Protokol obsahuje aj kľúčové kroky pre kultiváciu, umývanie a vizualizáciu biofilmu so zameraním na minimalizáciu variability a zabezpečenie reprodukovateľnosti.

Výskum biofilmov Staphylococcus a antibiotík

Biofilmy Staphylococcus hrajú kritickú úlohu pri perzistentných infekciách vďaka svojej rezistencii voči antibiotikám a imunitným odpovediam. Tvorba biofilmu poskytuje baktériám ochranné prostredie, čo sťažuje liečbu infekcií. Výskum biofilmov sa často zameriava na pochopenie ich tvorby, správania a citlivosti voči antimikrobiálnym látkam, pričom sa kladie dôraz na metódy s vysokou priepustnosťou na zjednodušenie experimentálnych pracovných postupov.
Ultrazvukový sonifikátor pre viacdôlkové platne UIP400MTP ponúka významnú výhodu vo výskume biofilmov tým, že umožňuje rýchle a efektívne oddeľovanie biofilmov z 96-dôlkových platní. Toto zariadenie dodáva rovnomernú ultrazvukovú energiu do všetkých dôlok, čím zabezpečuje konzistentné výsledky pri minimalizácii variability.

Protokol na kultiváciu a oddeľovanie biofilmu Staphylococcus

Nižšie vás prevedieme procesom kultivácie a oddeľovania biofilmu Staphylococcus pomocou inštrukcií krok za krokom. Ako príklad analytického kroku vám ukážeme, ako spektrofotometricky kvantifikovať kultivovanú biomasu pomocou farbenia kryštálovou violetou.

Kultivácia biofilmu Staphylococcus

Požadovaný materiál:

• Sterilné 96-dôlkové mikrotitračné platne z polystyrénu s plochým dnom, určené na kultiváciu tkanív, s viečkami
• Tryptická sójová bujón (TSB) s 0,25 % glukózy
• Biologická bezpečnostná skriňa

Postup:

1. Pripravte sterilné pracovné prostredie v biologickej bezpečnostnej skrini, aby sa minimalizovala kontaminácia.
2. Pridajte TSB obsahujúci 0,25 % glukózy do dôlok mikrotitračnej platne. TSB bez glukózy vo všeobecnosti nepodporuje tvorbu biofilmu a mal by sa používať iba ako kontrola, ak je to potrebné.
3. Inokulujte dôlky baktériálnymi kmeňmi pripravenými podľa popisu nižšie:
4. Pripravte bakteriálne suspenzie a uistite sa, že neexistujú žiadne predchádzajúce bunkové zhluky, a to homogenizáciou suspenzií pomocou sonifikácie alebo rozbitím zhlukov ihlou s priemerom 23 G a krátkym vírením.
5. Uzavrite platňu jej viečkom a inkubujte za podmienok optimálnych pre tvorbu biofilmu (napr. 37 °C po dobu 24 hodín).
6. Vykonajte experiment v trojitom opakování pre každý bakteriálny kmeň (tri dôlky na kmeň), aby sa zabezpečila spoľahlivosť.
7. Vyhraďte šesť dôlok na platňu pre negatívne kontroly. Na jednu 96-dôlkovú platňu možno otestovať až 30 kmeňov.

Vizualizácia a umývanie biofilmu

1. Po inkubácii opatrne odstráňte médium, aby nedošlo k narušeniu biofilmu.
2. Umyte každú dôlku štyrikrát fyziologickým roztokom, aby sa odstránili planktonické baktérie.
3. Skontrolujte dno dôlok, či sa na ňom nenachádzajú biele škvrny, ktoré naznačujú prítomnosť biofilmu.

Oddeľovanie biofilmu pomocou ultrazvukového sonifikátora pre viacdôlkové platne UIP400MTP

Nastavenie zariadenia a parametre:

• Ultrazvukový sonifikátor pre viacdôlkové platne UIP400MTP
• Prevádzkové nastavenia: 60 % amplitúda, cyklický režim so 60 sekundami ZAPNUTÉ / 30 sekundami VYPNUTÉ

Postup:

1. Umiestnite umytú mikrotitračnú platňu na platformu UIP400MTP.
2. Sonifikujte vzorky pri odporúčaných nastaveniach (60 % amplitúda, 60 sekúnd ZAPNUTÉ, 30 sekúnd VYPNUTÉ). Nastavenia upravte podľa bakteriálneho kmeňa.
3. Spustite proces sonifikácie na oddeľovanie biofilmu. Ultrazvukové vlny narušujú matricu biofilmu a uvoľňujú adherentné baktérie.
4. UIP400MTP zabezpečuje rovnomerné vystavenie všetkých dôlok pre konzistentné výsledky oddeľovania.

Analytický krok: Kvantifikácia biomasy oddeľovaného biofilmu Staphylococcus pomocou kryštálovej violety (CV)

Požadovaný materiál:

• 0,1 % roztok kryštálovej violety (CV)
• 95% etanol alebo 30% kyselina octová (na solubilizáciu)
• Mikrotitračný čítačka schopná čítať pri 570 nm
• Sterilné mikrotitračné platne na farbenie

Postupy:

1. Príprava farbiacej platne: Preneste 100 µL suspenzie odtrhnutého biofilmu z každej jamky sonikovanej platne do zodpovedajúcich jamiek čistej, sterilnej 96-jamkovej mikrotitračnej platne. Tým sa zabezpečí jasné a uniformné prostredie na farbenie.
2. Farbenie odtrhnutého biofilmu: Pridajte 150 µL 0,1% roztoku kryštálovej fialovej do každej jamky obsahujúcej suspenziu odtrhnutého biofilmu. Jemne pipetujte, aby sa zabezpečilo rovnomerné premiešanie suspenzie biofilmu a kryštálovej fialovej.
3. Inkubácia: Nechajte platňu inkubovať pri izbovej teplote 15 minút, aby kryštálová fialová účinne zafarbila biomasu.
4. Premývanie: Po inkubácii opatrne odstráňte roztok kryštálovej fialovej z jamiek bez toho, aby ste narušili biomasu. Každú jamku trikrát premyte sterilným fyziologickým roztokom na odstránenie nezviazanej farby.
5. Sušenie: Nechajte platňu sušiť na vzduchu pri izbovej teplote alebo pod sterilným prúdom vzduchu. Vyhnite sa zahrievaniu, pretože to môže zmeniť výsledky.
6. Solubilizácia: Pridajte 200 µL 95% etanolu (alebo 30% kyseliny octovej, v závislosti od štandardných laboratórnych postupov) do každej jamky na solubilizáciu viazanej kryštálovej fialovej. Jemne premiešajte pipetovaním alebo otrasením platne po dobu 10 minút pri izbovej teplote.
7. Meranie: Zmerajte optickú hustotu (OD) solubilizovaného roztoku kryštálovej fialovej pri 570 nm pomocou mikrotitračnej čítačky.
8. Analýza dát: Od hodnoty priemernej OD570 negatívnych kontrol (jamky s TSB, ale bez bakteriálnej inokulácie) odčítajte hodnoty experimentálnych jamiek, aby sa zohľadnilo pozadie farbenia. Zaznamenajte a analyzujte údaje.

Poznámka: Experiment vykonajte v trojitom opakovaní pre každú podmienku, aby sa zabezpečila reprodukovateľnosť. Zabezpečte správnu manipuláciu s kryštálovou fialovou a etanolom v súlade s bezpečnostnými predpismi a predpismi o likvidácii.
 

Kľúčové výhody UIP400MTP na prvý pohľad:

• Spracovanie s vysokou priepustnosťou: Špeciálne navrhnuté pre viacjamkové platne, čo umožňuje spracovať viacero vzoriek súčasne.
• Uniformné ultrazvukové rozloženie: Zabezpečuje rovnakú ultrazvukovú intenzitu vo všetkých jamkách, čím poskytuje konzistentné výsledky pre všetky vzorky.
• Použitie akejkoľvek štandardnej platne: UIP400MTP môže spracovať akékoľvek štandardné viacjamkové platne, Petriho misky a stojany na skúmavky. Nie sú potrebné drahé proprietárne platne!
• Používateľsky prívetivé rozhranie: Jednoduché nastavenie a ovládanie, čo z neho robí vynikajúci nástroj na zvýšenie produktivity laboratória. Programovateľné nastavenia a automatizácia uľahčujú štandardizáciu procesu!