Protokol využívajúci sonikátory Hielscher na spracovanie viacerých vzoriek pri analýze biofilmov a proteomickej analýze

Používanie sonikátorov na spracovanie viacerých vzoriek, ako sú sonikátor VialTweeter na viacero skúmaviek a sonikátor UIP400MTP na mikrotitračné platničky, zefektívňuje laboratórne pracovné postupy pri aplikáciách s vysokou priepustnosťou vzoriek. Obe zariadenia umožňujú presné a rovnomerné ultrazvukové spracovanie viacerých vzoriek, čím minimalizujú variabilitu a zvyšujú reprodukovateľnosť. Je to obzvlášť výhodné pri experimentoch vyžadujúcich konzistentnú lýzu vzoriek, uvoľňovanie biofilmu, extrakciu proteínov alebo proteolytické štiepenie, pri ktorých sú manuálne metódy alebo metódy spracovania jednotlivých vzoriek menej efektívne a náchylné na nekonzistentné výsledky.

Zefektívnite pracovné postupy pomocou sonikátorov na spracovanie viacerých vzoriek

Napríklad UIP400MTP umožňuje súčasné ultrazvukové ošetrenie jamiek mikrotitračných platničiek, čím zabezpečuje rovnomerné uvoľňovanie biofilmov alebo bunkového materiálu. VialTweeter zas ponúka presnú lýzu a homogenizáciu viacerých vzoriek v skúmavkách bez krížovej kontaminácie. Tieto sonikátory výrazne skracujú časy spracovania, zlepšujú reprodukovateľnosť experimentov a zachovávajú vysokú integritu vzoriek, vďaka čomu sú nepostrádateľnými nástrojmi vo výskume mikrobiológie, proteomiky a molekulárnej biológie.
Nižšie je uvedený podrobný protokol ilustrujúci použitie modelov sonikátorov Hielscher na spracovanie viacerých vzoriek, sonikátora VialTweeter na viacero skúmaviek a sonikátora UIP400MTP na mikrotitračné platničky, v štúdii zahŕňajúcej tvorbu biofilmu E. coli a následnú proteomickú analýzu.

Protokol: Tvorba a uvoľňovanie biofilmu a proteomická analýza pomocou sonikátorov Hielscher na spracovanie viacerých vzoriek

1. Príprava bakteriálnej kultúry

• Kultivujte baktérie E. coli (kmeň W3110) pri 30°C, čo je teplota priaznivá pre tvorbu biofilmu E. coli, v médiu s tryptónovým bujónom (TB) obsahujúcom:
  – 10 g/L tryptónu
  – 5 g/L NaCl
• Podľa potreby pridajte antibiotiká na zabezpečenie zachovania plazmidov.
• Na mikroskopiu a štúdie aktivity promótorov použite kmeň E. coli W3110 s genómovým reportérom zosilneného GFP (eGFP) pod kontrolou promótora rplL.
• Na meranie aktivity promótorov použite reportérové plazmidy GFP pre rôzne promótory (napr., csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ).

2. Kultivácia a uvoľňovanie biofilmu

• Do každej jamky 12-jamkovej platničky naočkujte 1,5 mL zriedenej bakteriálnej kultúry (12-jamkové platničky CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubujte, aby sa umožnila tvorba biofilmu.
• Opatrne odstráňte planktónovú (neadherentnú) kultúru.

– Premyte každú jamku 500 µL PBS.
– Uvoľnite prichytené bunky sonikáciou 12-jamkovej platničky v sonikátore UIP400MTP na mikrotitračné platničky. UIP400MTP zabezpečuje rovnomerné uvoľňovanie dodávaním konzistentnej ultrazvukovej energie do všetkých jamiek.
– Nastavenia sonikácie: amplitúda 60%, cyklický režim: 60 sec ZAP. / 30 sec VYP.

3. Zber a lýza buniek

• Centrifugujte uvoľnené bunky biofilmu pri 4 500 g počas 5 minút.
• Premyte bunkový sediment PBS.
• Resuspendujte bunky v 100 µL 2% lauroylsarkozinátu sodného (SLS) a inkubujte pri 95°C počas 15 minút.
• Sonikujte pomocou sonikátora VialTweeter na viacero skúmaviek, aby sa zabezpečila úplná lýza buniek.
  – Nastavenia sonikácie: amplitúda 100%, 50 s ZAP. / 10 s VYP. pri celkovom čase prevádzky 10 min; vzorky udržiavajte na ľade.

4. Redukcia a alkylácia

• Pridajte 5 mM tris(2-karboxyetyl)fosfínu (TCEP) na redukciu disulfidových väzieb a inkubujte pri 95°C počas 15 minút.
• Alkylujte proteíny 10 mM jódacetamidom počas 30 minút pri 25°C.

5. Kvantifikácia a štiepenie proteínov

• Centrifugujte lyzáty na odstránenie bunkových zvyškov.
• Kvantifikujte celkový obsah proteínov pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Štiepte 50 µg celkových proteínov pomocou 1 µg trypsínu v roztoku obsahujúcom 2% SLS a 100 mM hydrogénuhličitanu amónneho.
• Inkubujte štiepnu reakčnú zmes cez noc pri 30°C.

6. Purifikácia peptidov

• Vyzrážajte SLS pridaním 1,5% kyseliny trifluóroctovej (TFA), potom centrifugujte.
• Purifikujte peptidy pomocou mikrocentrifugačných kolón C18.
• Vysušte purifikované peptidy a resuspendujte ich v 0.1% TFA.

7. Kvapalinová chromatografia s hmotnostnou spektrometriou (LC-MS/MS)

• Analyzujte peptidy na hmotnostnom spektrometri Q-Exactive Plus prepojenom so systémom Ultimate 3000 RSLC nano.
• Separujte peptidy pomocou HPLC kolóny s reverznou fázou (75 µm × 42 cm) naplnenej živicou C18 (2,4 µm).
• Použite gradient rozpúšťadla B (acetonitril s 0,15% kyseliny mravčej) od 2% do 35% počas 140 minút.
• Získavajte údaje pomocou MS skenov s vysokým rozlíšením, po ktorých nasledujú tandemové MS/MS skeny 10 iónov s najvyššou intenzitou.

8. Analýza údajov

• Spracujte nespracované údaje LC-MS pomocou softvéru Progenesis.
• Exportujte súbory .mgf a analyzujte ich pomocou MASCOT.
• Vykonajte kvantifikáciu peptidov pomocou SafeQuant na kontrolu kvality a korekciu falošných objavov.
• Vykonajte všetky experimenty v dvoch alebo troch opakovaniach na zabezpečenie reprodukovateľnosti.

Sonikátory na spracovanie viacerých vzoriek na prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou

Modely sonikátorov VialTweeter a UIP400MTP na spracovanie viacerých vzoriek výrazne zvyšujú presnosť a efektívnosť experimentálnych pracovných postupov, najmä vo výskume biofilmov a v proteomike. Ich schopnosť rovnomerne spracovať viacero vzoriek zabezpečuje vysokú priepustnosť vzoriek bez zníženia kvality údajov. Tieto výhody v kombinácii so zefektívnenými pracovnými postupmi opísanými vyššie robia zo sonikátorov Hielscher na spracovanie viacerých vzoriek nevyhnutné nástroje moderného biologického výskumu.

Návrh, výroba a poradenstvo – kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojimi najvyššími štandardmi kvality a konštrukcie. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných prevádzok. Ultrazvukové prístroje Hielscher ľahko zvládajú drsné podmienky a náročné prostredia.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť certifikovaná podľa ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a používateľsky prívetivou obsluhou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.