Protokol využívajúci Hielscher Multi-Sample Sonicators v biofilme a proteomickej analýze

Použitie sonikátorov s viacerými vzorkami, ako je VialTweeter Multi-Tube Sonicator a UIP400MTP Microplate Sonicator, zefektívňuje laboratórne pracovné postupy pre vysokovýkonné aplikácie. Obe zariadenia umožňujú presné a rovnomerné ultrazvukové spracovanie viacerých vzoriek, čím sa minimalizuje variabilita a zvyšuje reprodukovateľnosť. To je obzvlášť výhodné pri experimentoch vyžadujúcich konzistentnú lýzu vzorky, oddelenie biofilmu, extrakciu proteínov alebo proteolytickú digesciu, kde sú manuálne metódy alebo metódy s jednou vzorkou menej účinné a náchylné na nekonzistenciu.

Zjednodušte pracovné postupy pomocou ultrazvukových zariadení s viacerými vzorkami

UIP400MTP napríklad umožňuje súčasné ultrazvukové ošetrenie jamiek mikrodoštičiek, čím sa zabezpečí rovnomerné oddelenie biofilmov alebo bunkového materiálu. Medzitým VialTweeter ponúka presnú lýzu a homogenizáciu viacerých vzoriek skúmaviek bez krížovej kontaminácie. Tieto sonikátory výrazne skracujú čas spracovania, zlepšujú experimentálnu reprodukovateľnosť a udržiavajú vysokú integritu vzorky, čo z nich robí nepostrádateľné nástroje vo výskume mikrobiológie, proteomiky a molekulárnej biológie.
Nižšie je uvedený podrobný protokol ilustrujúci použitie Hielscherových modelov sonikátorov s viacerými vzorkami, VialTweeter Multi-Tube Sonicator a Microplate Sonicator UIP400MTP v štúdii zahŕňajúcej tvorbu biofilmu E. coli a následnú proteomickú analýzu.

Protokol: Tvorba biofilmu, oddelenie a proteomická analýza pomocou Hielscherových sonikátorov s viacerými vzorkami

1. Príprava bakteriálnej kultúry

• Kultúra baktérií E. coli (kmeň W3110) pri teplote 30 °C, čo je teplota priaznivá pre tvorbu biofilmu E. coli, v médiu tryptónového vývaru (TBC) obsahujúcom:
  – 10 g/l tryptónu
  – 5 g/l NaCl
• Podľa potreby doplňte antibiotiká, aby ste zabezpečili retenciu plazmidov.
• Na mikroskopické štúdie a štúdie aktivity promótora použite kmeň W3110 E. coli s reportérom GFP (eGFP) vylepšeným genómom pod kontrolou promótora rplL.
• Využite GFP reportérové plazmidy pre rôzne promótory (napr. csgA, csgD, fliA, fliC, flhD ) na meranie činností propagátorov.

2. Kultivácia a oddelenie biofilmu

• Nasejte 1,5 ml zriedenej bakteriálnej kultúry na jamku do 12-jamkovej platne (12-jamkové platne CellStar, Greiner Bio-One).
• Inkubujte, aby sa umožnila tvorba biofilmu.
• Planktónovú (neadherentnú) kultúru opatrne odstráňte.

– Každú jamku umyte 500 μl PBS.
– Odpojte pripojené bunky sonikáciou 12-jamkovej platničky v UIP400MTP mikrodoštičkovom sonikátore. UIP400MTP zaisťuje rovnomerné oddelenie tým, že dodáva konzistentnú ultrazvukovú energiu vo všetkých jamkách.
– Nastavenia sonikácie: 60 % amplitúda, režim cyklu: 60 sekúnd zapnuté / 30 sekúnd vypnuté.

3. Zber buniek a lýza

• Odstredte oddelené biofilmové bunky pri 4 500 g počas 5 minút.
• Granulované bunky umyte PBS.
• Resuspendujte bunky v 100 μl 2% lauroylsarkosinátu sodného (SLS) a inkubujte pri 95 °C 15 minút.
• Sonikujte pomocou VialTweeter Multi-Tube Sonicator, aby ste zabezpečili úplnú lýzu buniek.
  – Nastavenia sonikácie: 100 % amplitúda, 50 s ON / 10 s OFF počas celkovej doby prevádzky 10 minút; Vzorky uchovávajte na ľade.

4. Redukcia a alkylácia

• Pridajte 5 mM Tris(2-karboxyetyl)fosfínu (TCEP) na zníženie disulfidových väzieb a inkubujte pri 95 °C 15 minút.
• Alkylátové proteíny s 10 mM jodoacetamidom po dobu 30 minút pri 25 °C.

5. Kvantifikácia a trávenie bielkovín

• Odstredivujte lyzáty, aby ste odstránili nečistoty.
• Kvantifikujte celkový obsah bielkovín pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay Kit.
• Roztrávte 50 μg celkového proteínu s 1 μg trypsínu v roztoku obsahujúcom 2 % SLS a 100 mM hydrogenuhličitanu amónneho.
• Reakciu trávenia inkubujte cez noc pri 30 °C.

6. Čistenie peptidov

• Vyzrážajte SLS pridaním 1,5 % kyseliny trifluóroctovej (TFA) a potom odstredte.
• Purifikujte peptidy pomocou mikrospinových stĺpon C18.
• Vysušte čistené peptidy a resuspendujte v 0,1% TFA.

7. Kvapalinová chromatografia-hmotnostná spektrometria (LC-MS/MS)

• Analyzujte peptidy na hmotnostnom spektrometri Q-Exactive Plus spojenom s nanosystémom Ultimate 3000 RSLC.
• Oddeľte peptidy pomocou HPLC kolóny s reverznou fázou (75 μm × 42 cm) naplnenej živicou C18 (2,4 μm).
• Aplikujte gradient od 2 % do 35 % rozpúšťadla B (acetonitril s 0,15 % kyseliny mravčej) počas 140 minút.
• Získajte údaje pomocou MS skenov s vysokým rozlíšením, po ktorých nasleduje tandemové MS/MS skenovanie 10 najintenzívnejších iónov.

8. Analýza údajov

• Spracujte nespracované údaje LC-MS pomocou softvéru Progenesis.
• Exportujte súbory .mgf a analyzujte ich pomocou MASCOT.
• Vykonajte kvantifikáciu peptidov pomocou SafeQuant na kontrolu kvality a úpravu falošného objavu.
• Všetky experimenty vykonávajte v duplikátoch alebo trojiciach, aby ste zabezpečili reprodukovateľnosť.

Viacvzorkové sonikátory na vysokovýkonnú prípravu vzoriek

Modely sonikátorov s viacerými vzorkami VialTweeter a UIP400MTP výrazne zvyšujú presnosť a efektivitu experimentálnych pracovných postupov, najmä vo výskume biofilmu a proteomike. Ich schopnosť rovnomerne spracovať viacero vzoriek zaisťuje vysokú kapacitu bez zníženia kvality údajov. Tieto výhody v kombinácii s vyššie uvedenými zjednodušenými pracovnými postupmi robia z Hielscher viacvzorkové sonikátory základný nástroj pre moderný biologický výskum.

Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu ultrazvukové prístroje Hielscher.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.