Odparafínovanie a extrakcia proteínov z FFPE

Uľahčite extrakciu proteínov z tkanivových rezov fixovaných formalínom a zaliatych do parafínu (FFPE) pomocou optimalizovanej kombinácie odparafínovania, solubilizácie a sonikácie s ultrazvukovým prístrojom VialTweeter pre viacero skúmaviek. Tento protokol podporuje následné proteomické analýzy založené na hmotnostnej spektrometrii a je kompatibilný s pracovnými postupmi zahŕňajúcimi prečistenie metódou SP3 a enzymatické štiepenie.

Tento štandardný operačný postup (SOP) je určený laboratórnym pracovníkom, ktorí vykonávajú proteomickú analýzu tkanivových vzoriek FFPE pomocou vysokovýkonnej sonikácie. Je optimalizovaný na paralelné spracovanie až desiatich vzoriek FFPE pomocou sonikátora VialTweeter pre viacero skúmaviek.

Protokol: Extrakcia proteínov zo vzoriek FFPE pomocou prístroja VialTweeter

Materiály a reagencie

Reagencie

• Xylén (v kvalite na histologické účely)
• Etanol (absolútny 96%)
• Lyzačný pufor:

6 M guanidíniumchlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (tris(2-karboxyetyl)fosfín)
40 mM CAA (2-chlóracetamid)

• Inhibítor proteáz (voliteľný; napr. cOmplete™ mini EDTA-free)

Vybavenie

• Ultrazvukový prístroj VialTweeter pre viacero skúmaviek
• Mikrocentrifugačné skúmavky s objemom 1,5 mL alebo 2,0 mL s nízkou väzbovou kapacitou povrchu
• Vyhrievací blok alebo inkubátor (nastavenia 95°C a 80°C)
• Mikrocentrifúga
• Termomixér (voliteľný, ale odporúčaný)

Vstupné množstvo vzorky

• 1–2 rezy tkaniva FFPE s hrúbkou 10 µm na vzorku (t. j. na liekovku)

ALEBO

• Celkovo ~100 µg tkaniva na vzorku (t. j. na liekovku)

Poznámka: Pri mikrotómii používajte nové čepele, aby ste minimalizovali kontamináciu parafínovými zvyškami.

Postup

1. Odparafínovanie
   1. Preneste rezy FFPE do mikrocentrifugačných skúmaviek s nízkou väzbovou kapacitou povrchu.
   2. Pridajte 1 mL xylénu a krátko premiešajte na vortexovom miešadle.
   3. Inkubujte 10 minút pri izbovej teplote.
   4. Centrifugujte pri 14 000 × g počas 2 minút; supernatant zlikvidujte.
   5. Premytie xylénom zopakujte ešte raz (kroky 2–4).
   6. Premyte peletu 1 mL 96% etanolu, premiešajte na vortexovom miešadle a potom centrifugujte pri 14 000 × g počas 2 minút. Supernatant zlikvidujte.
   7. Premytie etanolom zopakujte ešte raz (celkovo 2 premytia etanolom).
   8. Peletu sušte na vzduchu 10 minút pri izbovej teplote s otvorenými viečkami, aby sa odparil zvyškový etanol.
2. Extrakcia proteínov a sonikácia
   1. Ku každej suchej pelete pridajte 200 µL lyzačného pufra.

      Poznámka: Hoci sonikátor umožňuje spracovať až 1 mL, na následné spracovanie je optimálny objem 200 µL.

   2. Premiešajte na vortexovom miešadle alebo jemným pipetovaním.
3. Prvá tepelná inkubácia
   1. Inkubujte skúmavky pri 95 °C počas 30 min za pretrepávania pri 400 rpm s použitím termomixéra alebo vyhrievacieho bloku.
   2. Nechajte vzorky 5 min chladnúť pri izbovej teplote.
4. Prvá sonikácia pomocou prístroja VialTweeter
   1. Vložte skúmavky do prístroja VialTweeter.
   2. Nastavte VialTweeter UP200St na nižšie uvedené hodnoty a vykonajte sonikáciu.
Nastavenia sonikátora
• Nastavte amplitúdu (A) na 100%
• Nastavte pulzný režim (C) na 100%
• Časovač periódy: zapnutý
• Čas zapnutia: 60s
• Čas vypnutia: 30s
• Limitná hodnota: 15 min (zodpovedá 10 cyklom)
(Poznámka k výpočtu: (60 s zapnuté + 30 s vypnuté) × 10 cyklov = 900 s = 15 min)
5. Druhá tepelná inkubácia
   Vyberte skúmavky a znova inkubujte pri 95 °C počas 15 min, pri 400 rpm.
6. Druhá sonikácia
   Zopakujte sonikáciu na prístroji VialTweeter s rovnakými nastaveniami (ako vyššie) počas ďalších 10 cyklov (celkovo 15 min).
7. Vyčírenie lyzátu
   1. Centrifugujte vzorky pri 13 000 × g počas 10 min pri 23°C (izbová teplota).
   2. Opatrne preneste supernatant do novej skúmavky Eppendorf Safe-lock s objemom 2,0 mL. Dbajte na to, aby ste nenarušili peletu.
8. Následné spracovanie
   Lyzát je teraz pripravený na prečistenie metódou SP3 a enzymatické štiepenie.

Poznámky a osvedčené postupy

1. Riziko prehriatia počas sonikácie sa zmierňuje naprogramovaným striedaním cyklov zapnutia a vypnutia.
2. Po sonikácii sa vyhnite miešaniu na vortexovom miešadle, aby ste zabránili agregácii proteínov.

Likvidácia odpadu a bezpečnosť

Nasledujúca tabuľka poskytuje predstavu o približnej kapacite spracovania našich laboratórnych ultrazvukových prístrojov: