Deparafinizácia a extrakcia bielkovín z FFPE

Uľahčite extrakciu proteínov z tkanivových rezov tkaniva fixovaných formalínom (FFPE) pomocou optimalizovanej kombinácie deparafinizácie, solubilizácie a sonikácie pomocou ultrazvuku VialTweeter s viacerými trubicami. Tento protokol podporuje proteomiku založenú na následnej hmotnostnej spektrometrii a je kompatibilný s postupmi čistenia SP3 a enzymatického rozkladu.

Tento SOP je určený pre laboratórny personál zapojený do proteomickej analýzy vzoriek tkanív FFPE pomocou vysokovýkonnej sonikácie. Je optimalizovaný až pre desať vzoriek FFPE spracovaných paralelne pomocou VialTweeter Multi-Tube Sonicator.

Protokol: Extrakcia proteínov zo vzoriek FFPE pomocou VialTweeter

Materiály a činidlá

Reagenty

• Xylén (histologický stupeň)
• Etanol (absolútne 96 %)
• Lyzový pufer:

6 M guanidín hydrochlorid
50 mM Tris-HCl, pH 8,5
10 mM TCEP (Tris(2-karboxyetyl)fosfín)
40 mM CAA (2-chlóracetamid)

• Inhibítor proteázy (voliteľné; napr. cOmplete™ mini EDTA-free)

Zariadenie

• Viacrúrkový ultrazvuk VialTweeter
• 1,5 ml alebo 2,0 ml nízkoväzbové mikroodstredivkové skúmavky
• Tepelný blok alebo inkubátor (nastavenie 95 °C a 80 °C)
• Mikrocentrifúga
• Termomixér (voliteľné, ale odporúčané)

Sample vstup

• 1–2 rezy 10 μm hrubého FFPE tkaniva na vzorku (t. j. na injekčnú liekovku)

alebo

• Celkovo ~100 μg tkaniva na vzorku (t. j. na injekčnú liekovku)

Poznámka: Na mikrotómiu používajte nové čepele, aby ste minimalizovali kontamináciu parafínovým zvyškom.

Procedúra

1. deparafinizácia
   1. Preneste FFPE sekcie do nízkoväzbových mikroodstredivkových skúmaviek.
   2. Pridajte 1 ml xylénu, krátko vír.
   3. Inkubujte 10 minút pri izbovej teplote.
   4. Odstredte pri 14 000 × g 2 minúty; zlikvidujte supernatant.
   5. Opakujte xylénové umývanie ešte raz (kroky 2–4).
   6. Umyte pelety s 1 ml 96% etanolu, vír a potom odstredte pri 14 000 × g 2 minúty. Supernatant zlikvidovať.
   7. Ešte raz zopakujte premývanie etanolom (spolu 2 umývania etanolom).
   8. Pelety sušte na vzduchu 10 minút pri izbovej teplote s otvorenými viečkami, aby sa odparil zvyškový etanol.
2. Extrakcia bielkovín a sonikácia
   1. Pridajte 200 μl lyzačného pufra do každej suchej pelety.
      Poznámka: Aj keď sonikátor pojme až 1 ml, 200 μl je optimálne pre následné spracovanie.

   2. Miešajte vírivým alebo jemným pipetovaním.
3. Prvá tepelná inkubácia
   1. Skúmavky inkubujte pri teplote 95 °C 30 minút s miešaním pri 400 ot./min pomocou termomixéra alebo tepelného bloku.
   2. Vzorky nechajte 5 minút vychladnúť pri izbovej teplote.
4. Prvá sonikácia pomocou VialTweeter
   1. Vložte skúmavky do VialTweeter.
   2. Nastavte VialTweeter UP200St na nižšie uvedené hodnoty a sonikujte.
Nastavenia Sonikátora
• Nastavte amplitúdu (A) na 100 %
• Nastavte režim pulzácie (C) na 100 %
• Dobové hodiny: Zapnuté
• Načas: 60 s
• Čas vypnutia: 30 s
• Limitná hodnota: 15 min (zodpovedá 10 cyklom)
(Poznámka k výpočtu: (60 s zapnuté + 30 s vypnuté) × 10 cyklov = 900 s = 15 min)
5. Druhá tepelná inkubácia
   Vyberte skúmavky a znova inkubujte pri 95 °C 15 minút, 400 ot./min.
6. Druhá sonikácia
   Zopakujte sonikaciu na VialTweeter s použitím rovnakých nastavení (ako vyššie) počas ďalších 10 cyklov (celkovo 15 minút).
7. Objasnenie lyzátu
   1. Vzorky odstreďujte pri 13 000 × g počas 10 minút pri 23 °C (izbová teplota).
   2. Opatrne zozbierajte supernatant do novej 2,0 ml skúmavky Safe-lock Eppendorf. Zabráňte narušeniu peliet.
8. Následné spracovanie
   Lyzát je teraz pripravený na čistenie SP3 a enzymatické trávenie.

Poznámky a osvedčené postupy

1. Riziko prehriatia počas sonikácie je zmiernené naprogramovaným cyklovaním ON/OFF.
2. Vyhnite sa víreniu po sonikácii, aby ste zabránili agregácii bielkovín.

Likvidácia odpadu a bezpečnosť

Nasledujúca tabuľka vám poskytuje približnú kapacitu spracovania našich ultrazvukových prístrojov veľkosti laboratória: