Vysokokapacitná príprava vzoriek FFPE: extrakcia proteínov a štiepenie nukleových kyselín šmykovými silami

Často kladené otázky
Nižšie odpovedáme na často kladené otázky týkajúce sa prípravy tkanív FFPE a sonikácie vzoriek FFPE.

Ako sa pripravuje tkanivo FFPE?

Kroky prípravy tkaniva FFPE: Dôsledná manipulácia s čerstvým tkanivom a jeho spracovanie sú rozhodujúce pre získanie vysokokvalitných vzoriek FFPE. Zabezpečenie zachovania bunkovej architektúry, nukleových kyselín a proteínov je nevyhnutné pre presnú následnú analýzu. Každý krok – od odberu až po zaliatie – si vyžaduje presnosť, aby sa zachovala integrita vzorky na rôzne analýzy vrátane histologického vyšetrenia, imunohistochémie a molekulárnych štúdií. Pri správnom vykonaní tento proces fixácie a zalievania zabezpečuje, že konzervované tkanivo presne odráža stav in vivo, čo umožňuje dosiahnuť spoľahlivé diagnostické a výskumné výsledky.
Prevedieme vás 6 hlavnými krokmi procesu zalievania tkanivových vzoriek FFPE.

• Odber tkaniva
  Biopsie zo živých cicavcov aj tkanivové kultúry sú vhodnými zdrojmi čerstvého tkaniva na prípravu vzoriek FFPE.
  Je dôležité používať aseptickú techniku: Používajte sterilné nástroje a rukavice, aby ste zabránili kontaminácii. Ideálne je odoberať tkanivá v sterilnom prostredí, napríklad na operačnej sále alebo v boxe s laminárnym prúdením.
  Keďže vzorka je veľmi krehká, je nevyhnutné s ňou zaobchádzať šetrne: Minimalizujte oneskorenia pri spracovaní a ihneď po excízii začnite s následným spracovaním tkaniva. Je to rozhodujúce pre zabránenie autolýze a degradácii. Tkanivo uchovávajte pri izbovej teplote; vyhnite sa zmrazovaniu, pretože môže spôsobiť tvorbu ľadových kryštálov a poškodenie tkaniva.
• Fixácia tkaniva
  Najprv sa tkanivo ošetrí fixačným roztokom: Použite 10% neutrálne pufrovaný formalín (NBF), ktorý zodpovedá 4% roztoku formaldehydu vo vode, pufrovanému na neutrálne pH.
  Tkanivo úplne ponorte do formalínu. Zabezpečte objemový pomer fixačného roztoku k tkanivu aspoň 10:1. Čas fixácie sa zvyčajne pohybuje od 6 do 24 hodín v závislosti od typu a veľkosti tkaniva. Je dôležité, aby fixačný roztok mohol dôkladne preniknúť do tkaniva. Nadmerná fixácia však môže viesť k tvorbe priečnych väzieb, ktorá komplikuje odmaskovanie antigénov, zatiaľ čo nedostatočná fixácia môže viesť k zlému zachovaniu tkaniva.
• Prirezanie tkaniva
  V druhom kroku prirežte tkanivo na hrúbku približne 3–5 mm, aby fixačný roztok mohol dostatočne preniknúť do tkaniva. Zabezpečte správnu orientáciu tkaniva, aby sa zachytili relevantné histologické štruktúry. Uľahčí to proces extrakcie pri neskoršom použití tkaniva na analýzu.
• Spracovanie fixovanej vzorky
  Teraz je potrebné fixované tkanivo dehydratovať: Po fixácii sa musí tkanivo dehydratovať, aby sa zabezpečilo dôkladné preniknutie parafínového vosku. Na odstránenie vody postupne prenášajte tkanivo cez rad etanolových roztokov so stúpajúcou koncentráciou (70%, 80%, 90% a 100%).
  Prejasnenie xylénom: Parafínový vosk je nerozpustný vo vode, ale rozpustný v xyléne. Preto sa voda v tkanive musí nahradiť xylénom. Samotný xylén je však nerozpustný vo vode, ale rozpustný v alkohole, čo si vyžaduje medzikrok, pri ktorom sa voda najprv nahradí alkoholom. Ponorte tkanivo do xylénu alebo jeho náhrady, aby sa odstránil etanol a tkanivo sa pripravilo na infiltráciu parafínom.
  Infiltrácia parafínom: Ponorte tkanivo do roztaveného parafínového vosku a zabezpečte úplnú infiltráciu. Tento krok zvyčajne zahŕňa niekoľko výmen parafínu, aby sa zabezpečilo dôkladné presýtenie.
• Zalievanie tkaniva
  V tomto kroku sa tkanivo formuje do tkanivového bloku: Vložte tkanivo do formy v požadovanej orientácii a zalejte ho roztaveným parafínom. Nechajte parafín stuhnúť ochladením pri izbovej teplote alebo na chladiacej platni.
• Rezanie a umiestnenie rezov na podložné sklíčka
  Mikrotómia: Na rezanie zaliateho tkaniva použite mikrotóm, ktorým z parafínového bloku narežete tenké rezy (zvyčajne 4–5 mikrometrov). Potom vzorku umiestnite na podložné sklíčka tak, že na ne prenesiete rezy na následné farbenie a mikroskopickú analýzu.
  Nakoniec skontrolujte kvalitu histologického spracovania: Vyhodnoťte prvé rezy pod mikroskopom, aby ste overili správnu fixáciu a spracovanie. Podľa potreby upravte protokoly na základe typu tkaniva a pozorovanej kvality.

 
Tkanivá FFPE možno použiť na získanie RNA, DNA a proteínov, ako aj na odhalenie príznakov rakoviny alebo iného ochorenia. Možno ich skladovať celé roky a sú nevyhnutnou súčasťou využívania tkanivových vzoriek vedcami a lekármi na diagnostiku a výskum.

Aké sú bežné problémy a výzvy pri práci s tkanivom FFPE?

Vzorky tkanív fixovaných formalínom a zaliatych do parafínu (FFPE) sa vo veľkej miere používajú vo výskume a diagnostike, no prinášajú viaceré výzvy a bežné problémy:

• Degradácia biomolekúl: Dlhodobá fixácia môže viesť k degradácii DNA, RNA a proteínov, čo sťažuje extrakciu vysokokvalitných nukleových kyselín alebo proteínov na následné aplikácie. Správna fixácia (bez nedostatočnej alebo nadmernej fixácie) je nevyhnutná na zachovanie tkaniva.

Zosieťovanie: Fixácia formalínom spôsobuje zosieťovanie proteínov a nukleových kyselín, čo môže sťažovať molekulárnu analýzu a ovplyvňovať presnosť imunohistochémie a ďalších analýz.

• Maskovanie antigénov: Proces fixácie môže maskovať antigénne miesta, čím sa znižuje účinnosť väzby protilátok v imunohistochémii a ďalších imunologických analýzach. To si často vyžaduje odmaskovanie antigénov, postup, ktorým sa zvráti maskovanie epitopu a obnoví sa väzba medzi epitopom a protilátkou. Úplná antigénnosť sa však nemusí vždy obnoviť.
• Premenlivá kvalita fixácie: Rozdiely v čase a podmienkach fixácie môžu viesť k nejednotnej kvalite vzoriek, čo ovplyvňuje reprodukovateľnosť a porovnateľnosť výsledkov. Používajte spoľahlivé fixačné protokoly a vyhýbajte sa nedostatočnej aj nadmernej fixácii.
• Poškodenie a fragmentácia DNA: Fixácia vzoriek FFPE formalínom môže spôsobiť rôzne typy poškodenia DNA vrátane deaminácie cytozínu (mutácie C na T), oxidačného poškodenia (napr. 8-oxo-guanín vedúci k mutáciám G na T), ako aj fyzických narušení, ako sú jednovláknové zlomy, medzery a abázické miesta, ktoré bránia aktivite DNA polymerázy. Proces fixácie formalínom môže spôsobiť fragmentáciu DNA, čo komplikuje genetické a genomické analýzy, ako sú PCR a sekvenovanie.
• Kvalita RNA: RNA extrahovaná z tkanív FFPE je často fragmentovaná a chemicky modifikovaná, čo sťažuje vykonávanie vysokokvalitných transkriptomických analýz.
• Modifikácie proteínov: Formalín môže vyvolať chemické modifikácie proteínov, ktoré ovplyvňujú ich štruktúru a funkciu, čo môže narúšať proteomické analýzy.
• Artefakty pri spracovaní vzoriek: Počas zalievania a krájania na rezy môžu mechanické namáhanie a teplo vytvárať artefakty a spôsobiť ďalšie poškodenie tkaniva.
• Variabilita medzi šaržami: Rozdiely vo fixačných a zalievacích protokoloch medzi jednotlivými šaržami môžu viesť k výraznej variabilite výsledkov, čo komplikuje porovnávanie medzi štúdiami.
• Problémy so skladovaním: Dlhodobé skladovanie blokov FFPE môže časom viesť k ďalšej degradácii a strate integrity nukleových kyselín, čo ovplyvňuje použiteľnosť archívnych vzoriek na retrospektívne štúdie.

Používanie optimalizovaných protokolov, šetrné zaobchádzanie so vzorkami a uplatňovanie pokročilých techník pomáhajú zlepšiť kvalitu a spoľahlivosť údajov získaných z tkanív FFPE.

Aký je rozdiel medzi tkanivom FFPE a zmrazeným tkanivom?

Tkanivo FFPE (fixované formalínom a zaliate do parafínu) sa konzervuje fixáciou formalínom a následne sa zalieva do parafínu, čo umožňuje dlhodobé skladovanie pri izbovej teplote pri zachovaní morfológie tkaniva. Naproti tomu sa zmrazené tkanivo rýchlo konzervuje zmrazením, ktoré lepšie zachováva integritu nukleových kyselín a proteínov, ale vyžaduje skladovanie pri veľmi nízkych teplotách.

Aké chemikálie sa používajú pri zalievaní tkanív FFPE?

Chemikálie používané pri zalievaní do parafínu v rámci prípravy FFPE vzoriek zvyčajne zahŕňajú formalín na fixáciu a parafínový vosk na zaliatie. Pri príprave FFPE vzoriek sa tkanivá zvyčajne fixujú buď 10% (v/v) neutrálne pufrovaným formalínom (FA), alebo čerstvo pripraveným 4% (w/v) roztokom formaldehydu (PFA) pripraveným z paraformaldehydového prášku. Formalín, ktorý je roztokom formaldehydu vo vode, sa pufruje na neutrálne pH, aby sa zachovala morfológia tkaniva a zabránilo nadmernému zosieťovaniu. Roztok na báze paraformaldehydu tiež poskytuje účinnú fixáciu zosieťovaním proteínov, čím stabilizuje štruktúru tkaniva na následné zaliatie do parafínového vosku. Tieto chemikálie sú nevyhnutné na zachovanie integrity a morfológie tkaniva počas fixácie a zalievania.

Ako sa odstraňuje parafín z FFPE vzoriek?

Na odstránenie parafínu z FFPE vzoriek sa tkanivové rezy zvyčajne podrobujú sérii premývaní xylénom, po ktorých nasleduje rehydratácia v rade alkoholov s postupne klesajúcou koncentráciou a napokon vo vode. Keďže xylén je vysoko toxický a predstavuje zdravotné riziká, ako sú dýchacie ťažkosti, podráždenie pokožky a možné dlhodobé účinky pri opakovanej expozícii, ultrazvukové odstraňovanie parafínu sa v mnohých laboratóriách stáva sľubnou alternatívou. Táto metóda využíva intenzívne ultrazvukové vlny na účinné a bezpečné odstránenie parafínu bez potreby toxických rozpúšťadiel, ako je xylén, čím znižuje riziko pre laboratórny personál a vytvára bezpečnejšie pracovné prostredie.

Ako dlho mám fixovať tkanivá, aby som dosiahol dobrú kvalitu FFPE vzoriek?

Všeobecné odporúčania týkajúce sa dĺžky fixácie zvyčajne odporúčajú fixovať vzorky tkaniva vo formalíne 24 až 48 hodín. Tento čas vo všeobecnosti postačuje na zachovanie morfológie tkaniva a bunkových štruktúr pri súčasnej minimalizácii nadmernej fixácie, ktorá môže viesť k nadmernému zosieťovaniu a degradácii nukleových kyselín a proteínov. Optimálny čas fixácie sa však môže líšiť v závislosti od veľkosti a typu tkaniva, pričom menšie alebo citlivejšie vzorky vyžadujú kratší čas fixácie. Je zásadné zabezpečiť dostatočnú fixáciu na zabránenie autolýze a degradácii tkaniva a zároveň sa vyhnúť predĺženej fixácii, ktorá by mohla skomplikovať následné molekulárne analýzy.