FFPE vysokovýkonná príprava vzoriek: extrakcia proteínov a strihanie nukleových kyselín

FAQ
Nižšie odpovedáme na často kladené otázky, ktoré sú relevantné pre prípravu tkaniva FFPE a ultrazvuk vzoriek FFPE.

Ako sa pripravuje tkanivo FFPE?

Kroky na prípravu FFPE tkaniva: Starostlivá manipulácia a spracovanie čerstvého tkaniva sú rozhodujúce pre vytváranie vysokokvalitných vzoriek FFPE. Zabezpečenie zachovania bunkovej architektúry, nukleových kyselín a proteínov je nevyhnutné pre presnú následnú analýzu. Každý krok – od odberu až po vloženie – si vyžaduje presnosť na zachovanie integrity vzorky pre rôzne analýzy vrátane histologického vyšetrenia, imunohistochémie a molekulárnych štúdií. Tento správne vykonaný proces fixácie a vkladania zaisťuje, že konzervované tkanivo presne odráža stav in vivo, čo umožňuje spoľahlivé diagnostické a výskumné výsledky.
Prevedieme vás 6 hlavnými krokmi procesu vkladania vzoriek tkaniva FFPE.

• Odber tkanív
  Biopsie živých cicavcov a tkanivové kultúry sú životaschopnými zdrojmi na získanie čerstvého tkaniva na prípravu vzoriek FFPE.
  Je dôležité používať aseptickú techniku: Používajte sterilné nástroje a rukavice, aby ste predišli kontaminácii. V ideálnom prípade zhromažďujte tkanivá v sterilnom prostredí, ako je chirurgická súprava alebo kryt s laminárnym prúdením.
  Keďže vzorka je veľmi krehká, je nevyhnutné jej citlivé zaobchádzanie: Minimalizujte oneskorenia pri spracovaní a okamžite začnite s následným spracovaním tkaniva po excízii. To je rozhodujúce, aby sa zabránilo autolýze a degradácii. Udržujte tkanivo pri izbovej teplote; Vyhnite sa zamrznutiu, pretože môže spôsobiť tvorbu ľadových kryštálov a poškodenie tkaniva.
• Fixácia tkaniva
  Najprv sa tkanivo ošetrí fixačným roztokom: Použite 10 % neutrálneho pufrovaného formalínu (NBF), čo zodpovedá 4 % formaldehydu vo vode, pufrovanom na neutrálne pH.
  Tkanivo úplne ponorte do formalínu. Zabezpečte pomer objemu fixačného prostriedku k tkanivu aspoň 10:1. Čas fixácie sa zvyčajne pohybuje od 6 do 24 hodín v závislosti od typu a veľkosti tkaniva. Je dôležité, aby fixačný prostriedok mohol dôkladne preniknúť do tkaniva. Nadmerná fixácia však môže viesť k zosieťovaniu, ktoré komplikuje získanie antigénu, zatiaľ čo nedostatočná fixácia môže mať za následok zlú konzerváciu tkaniva.
• Orezávanie tkanív
  Po druhé, orežte tkanivo na hrúbku asi 3 - 5 mm, aby ste umožnili dostatočný prienik fixačného prostriedku. Zabezpečte správnu orientáciu tkaniva na zachytenie relevantných histologických štruktúr. To uľahčuje proces extrakcie, keď sa tkanivo neskôr použije na analýzu.
• Spracovanie fixovanej vzorky
  Teraz musí byť fixované tkanivo dehydratované: Po fixácii je potrebné tkanivo dehydratovať, aby sa zabezpečilo dôkladné preniknutie parafínovým voskom. Tkanivo nechte prejsť odstupňovanou sériou etanolu (70%, 80%, 90% a 100%), aby ste odstránili vodu.
  Čistenie xylénom: Parafínový vosk je nerozpustný vo vode, ale rozpustný v xyléne. Preto musí byť voda v tkanive nahradená xylénom. Samotný xylén je však nerozpustný vo vode, ale rozpustný v alkohole, čo si vyžaduje medzikrok, v ktorom sa voda najskôr nahradí alkoholom. Ponorte tkanivo do xylénu alebo náhrady xylénu, aby ste odstránili etanol a pripravili tkanivo na infiltráciu parafínu.
  Infiltrácia pomocou parafínu: Vložte tkanivo do roztaveného parafínového vosku, čím sa zabezpečí úplná infiltrácia. Tento krok zvyčajne zahŕňa niekoľko zmien parafínu, aby sa zabezpečila dôkladná impregnácia.
• Vloženie tkaniva
  V tomto kroku sa tkanivo vytvaruje do tkanivového bloku: Vložte tkanivo do formy s požadovanou orientáciou a nalejte naň roztavený parafín. Nechajte parafín stuhnúť ochladením pri izbovej teplote alebo na studenej platni.
• Rozdelenie a montáž
  Mikrotómia: Na krájanie vloženého tkaniva použite mikrotóm na odrezanie tenkých častí (zvyčajne 4-5 mikrometrov) z parafínového bloku. Potom sa namontuje vzorka a časti sa umiestnia na sklenené podložné sklíčka na následné farbenie a mikroskopickú analýzu.
  Nakoniec skontrolujte kvalitu histológie: Vyhodnoťte prvé rezy pod mikroskopom, aby ste zabezpečili správnu fixáciu a spracovanie. Podľa potreby upravte protokoly na základe typu tkaniva a pozorovanej kvality.

 
Tkanivá FFPE možno použiť na obnovu RNA, DNA a proteínov, ako aj na objavenie príznakov rakoviny alebo iného ochorenia. Môžu sa skladovať roky a sú nevyhnutnou súčasťou toho, ako výskumníci a lekári využívajú vzorky tkanív na diagnostiku a výskum.

Aké sú bežné problémy a výzvy s tkanivom FFPE?

Vzorky tkaniva fixované formalínom a parafínom (FFPE) sú široko používané vo výskume a diagnostike, ale predstavujú niekoľko výziev a bežných problémov:

• Degradácia biomolekúl: Dlhodobá fixácia môže viesť k degradácii DNA, RNA a proteínov, čo sťažuje extrakciu vysokokvalitných nukleových kyselín alebo proteínov pre následné aplikácie. Správna fixácia (vyhýbanie sa nedostatočnej a nadmernej fixácii) je nevyhnutná pre konzerváciu tkanív.

Zosieťovanie: Fixácia formalínu spôsobuje zosieťovanie proteínov a nukleových kyselín, čo môže brániť molekulárnej analýze a ovplyvňovať presnosť imunohistochémie a iných testov.

• Maskovanie antigénu: Proces fixácie môže maskovať antigénne miesta, čím sa znižuje účinnosť väzby protilátok v imunohistochémii a iných imunologických testoch. To si často vyžaduje získanie antigénu, postup, prostredníctvom ktorého sa maskovanie epitopu zvráti a obnoví sa väzba epitop-protilátka. Úplná antigenita však nemusí byť vždy obnovená.
• Variabilná kvalita fixácie: Rozdiely v časoch a podmienkach fixácie môžu viesť k nekonzistentnej kvalite vzorky, čo ovplyvňuje reprodukovateľnosť a porovnateľnosť výsledkov. Používajte spoľahlivé fixačné protokoly a vyhnite sa nedostatočnej a nadmernej fixácii.
• Poškodenie a fragmentácia DNA: Formalínová fixácia vzoriek FFPE môže spôsobiť rôzne typy poškodenia DNA, vrátane deaminácie cytozínu (mutácie C až T), oxidačného poškodenia (napr. 8-oxo-guanín vedúci k mutáciám G až T), ako aj fyzické narušenia, ako sú škrabance, medzery a abazické miesta, ktoré bránia aktivite DNA polymerázy. Proces fixácie formalínu môže spôsobiť fragmentáciu DNA, čo komplikuje genetické a genómové analýzy, ako je PCR a sekvenovanie.
• Kvalita RNA: RNA extrahovaná z tkanív FFPE je často fragmentovaná a chemicky modifikovaná, čo sťažuje vykonávanie vysokokvalitných transkriptomických analýz.
• Modifikácie bielkovín: Formalín môže vyvolať chemické modifikácie v proteínoch, ovplyvniť ich štruktúru a funkciu, čo môže interferovať s proteomickými analýzami.
• Artefakty spracovania vzoriek: Počas procesu vkladania a rezania môže mechanické namáhanie a teplo spôsobiť artefakty a ďalšie poškodenie tkaniva.
• Variabilita medzi šaržami: Rozdiely v protokoloch fixácie a vkladania medzi rôznymi šaržami môžu viesť k významnej variabilite výsledkov, čo komplikuje porovnanie medzi štúdiami.
• Problémy s úložiskom: Dlhodobé skladovanie blokov FFPE môže viesť k ďalšej degradácii a strate integrity nukleových kyselín v priebehu času, čo má vplyv na životaschopnosť archívnych vzoriek pre retrospektívne štúdie.

Používanie optimalizovaných protokolov, starostlivé zaobchádzanie so vzorkami a používanie pokročilých techník pomáha zlepšovať kvalitu a spoľahlivosť údajov získaných z tkanív FFPE.

Aký je rozdiel medzi FFPE a zmrazeným tkanivom?

Tkanivo FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) sa konzervuje pomocou formalínu na fixáciu tkaniva a potom sa vloží do parafínového vosku, čo umožňuje dlhodobé skladovanie pri izbovej teplote pri zachovaní morfológie tkaniva. Naproti tomu zmrazené tkanivo sa rýchlo konzervuje zmrazením, ktoré lepšie udržuje integritu nukleových kyselín a bielkovín, ale vyžaduje skladovanie pri veľmi nízkych teplotách.

Aké chemikálie sa používajú na zapúšťanie FFPE?

Chemikálie používané na zapustenie FFPE zvyčajne zahŕňajú formalín na fixáciu a parafínový vosk na zapúšťanie. Na zapúšťanie FFPE sa tkanivá zvyčajne fixujú buď pomocou 10% (v/v) neutrálneho pufrovaného formalínu (FA) alebo čerstvo pripraveného 4% (w/v) roztoku formaldehydu (PFA) vyrobeného z paraformaldehydového prášku. Formalín, čo je roztok formaldehydu vo vode, sa pufruje na neutrálne pH, aby sa zachovala morfológia tkaniva a zabránilo sa nadmernému zosieťovaniu. Roztok na báze paraformaldehydu tiež poskytuje účinnú fixáciu zosieťovaním proteínov, čím stabilizuje štruktúru tkaniva pre následné vloženie do parafínového vosku. Tieto chemikálie sú nevyhnutné na udržanie integrity a morfológie tkaniva počas procesu fixácie a vkladania.

Ako sa parafín odstraňuje zo vzoriek FFPE?

Na odstránenie parafínu zo vzoriek FFPE sa tkanivové časti zvyčajne podrobia sérii xylénových výplachov, po ktorých nasleduje rehydratácia cez odstupňovanú sériu alkoholov a nakoniec vodu. Keďže xylén je vysoko toxický a predstavuje zdravotné riziká, ako sú dýchacie problémy, podráždenie pokožky a potenciálne dlhodobé účinky pri opakovanej expozícii, ultrazvukové odstránenie parafínu sa v mnohých laboratóriách javí ako sľubná alternatíva. Táto metóda využíva intenzívne ultrazvukové vlny na efektívne a bezpečné odstránenie parafínu bez potreby toxických rozpúšťadiel, ako je xylén, čím sa znižuje riziko pre laboratórny personál a vytvára sa bezpečnejšie pracovné prostredie.

Ako dlho by som mal fixovať vreckovky pre dobrú kvalitu FFPE vzorky?

Všeobecné odporúčania pre trvanie fixácie zvyčajne odporúčajú fixáciu vzoriek tkaniva vo formalíne na 24 až 48 hodín. Toto trvanie je vo všeobecnosti dostatočné na zachovanie morfológie tkaniva a bunkových štruktúr pri minimalizácii nadmernej fixácie, čo môže viesť k nadmernému zosieťovaniu a degradácii nukleových kyselín a proteínov. Optimálny čas fixácie sa však môže líšiť v závislosti od veľkosti a typu tkaniva, pričom menšie alebo jemnejšie vzorky vyžadujú kratší čas fixácie. Je dôležité vyvážiť adekvátnu fixáciu, aby sa zabránilo autolýze a degradácii tkanív a zároveň sa vyhnúť dlhodobej fixácii, ktorá by mohla skomplikovať následné molekulárne analýzy.