Protokol ASTM E2799-22 na antimikrobiálne hodnotenie

Hielscher UIP400MTP je výkonný a účinný sonikátor pre viacdôlkové platne, navrhnutý na zjednodušenie kroku sonikácie v protokole ASTM E2799-22. Poskytovaním rovnomernej ultrazvukovej energie na celej mikrotitračnej platni UIP400MTP zabezpečuje konzistentné a spoľahlivé uvoľňovanie biofilmov z viečok s kolíkmi bez poškodenia buniek alebo narušenia integrity vzorky. Jeho vysoká priepustnosť a užívateľsky prívetivá prevádzka výrazne skracujú čas spracovania a zároveň zvyšujú reprodukovateľnosť, čo z neho robí ideálne riešenie pre laboratóriá vykonávajúce testy životaschopnosti biofilmov a testovanie antimikrobiálnej účinnosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 je štandardizovaná skúšobná metóda určená na hodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti biofilmom, so zameraním špecificky na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmy sú komplexné mikrobiálne spoločenstvá, ktoré adherujú na povrchy a vykazujú zvýšenú rezistenciu voči antimikrobiálnym ošetreniam, čo z nich robí významnú výzvu v kontexte zdravotníctva, priemyslu a životného prostredia. Táto metóda využíva stanovenie minimálnej eradikačnej koncentrácie biofilmu (MBEC) na poskytnutie spoľahlivého a reprodukovateľného rámca pre testovanie dezinfekčných prostriedkov pod realistickými podmienkami biofilmu.

Ako sonikácia prispieva k ASTM E2799?

Sonikácia hrá kritickú úlohu v protokole ASTM E2799 tým, že uľahčuje uvoľňovanie biofilmov z testovacích povrchov a zabezpečuje presné posúdenie mikrobiálnej životaschopnosti po ošetrení. Použitím kontrolovanej ultrazvukovej energie protokol dosahuje účinné a konzistentné narušenie biofilmu bez poškodenia buniek, čo umožňuje presné a reprodukovateľné výsledky. To robí z ASTM E2799 nevyhnutný nástroj na pokrok vo výskume biofilmov a vývoj účinných antimikrobiálnych stratégií.

Ako vykonať test MBEC v súlade s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 opisuje kroky na hodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti biofilmom. Pri použití sonikátora pre mikrotitračné platne Hielscher UIP400MTP môže byť protokol prispôsobený na začlenenie tejto pokročilej metódy sonikácie na uvoľňovanie biofilmov. Nižšie je uvedený opis krokov prispôsobených na použitie sonikátora pre mikrotitračné platne UIP400MTP:

1. Príprava biofilmov
   Pripravte sterilnú 96-dôlkovú mikrotitračnú platňu s odnímateľnými viečkami s kolíkmi.
   Inokulujte dôlky štandardizovanou bakteriálnou suspenziou vo vhodnom rastovom médiu.
   Umiestnite viečko s kolíkmi na platňu a uistite sa, že kolíky sú úplne ponorené v bakteriálnej suspenzii.
   Inkubujte platňu pod kontrolovanými podmienkami (napr. teplota a čas), aby došlo k tvorbe biofilmu na kolíkoch.
2. Ošetrenie antimikrobiálnymi látkami
   Po vytvorení biofilmu nahraďte médium čerstvým médiom obsahujúcim testované antimikrobiálne látky v rôznych koncentráciách.
   Opätovne pripevnite viečko s kolíkmi a inkubujte za podmienok špecifikovaných v návrhu testu.
3. Príprava na uvoľnenie biofilmu
   Po ošetrení opláchnite viečko s kolíkmi ponorením do sterilného oplachového roztoku na odstránenie zvyšných antimikrobiálnych látok a voľne adherovaných planktonických buniek.
4. Uvoľnenie biofilmu pomocou sonikátora UIP400MTP
   Pripravte čerstvú 96-dôlkovú mikrotitračnú platňu obsahujúcu regeneračné médium (napr. neutralizačný bujón).
   Uvoľnite biofilmy umiestnením viečka s kolíkmi do dôlkov platne s regeneračným médiom.
   Vložte platňu do sonikátora UIP400MTP a uistite sa, že viečko a platňa sú správne zosúladené.
   Nastavte sonikátor na amplitúdu 70 % – 80 % a sonikujte 3 – 4 minúty v cyklickom režime, aby sa zabezpečilo konzistentné uvoľnenie biofilmu bez lýzy buniek.
5. Hodnotenie životaschopnosti biofilmu
   Po sonikácii spracujte regeneračné médium obsahujúce uvoľnené bunky biofilmu pomocou štandardných mikrobiologických alebo analytických techník, ako sú:
   • Počty kolónie tvoriacich jednotiek (CFU): Vykonajte sériové riedenia a zaočkujte na agar na stanovenie počtu životaschopných buniek.
   • Merania optickej hustoty (OD): Použite spektrofotometrickú analýzu na posúdenie hustoty buniek.
   • Testy životaschopnosti založené na fluorescencii: Kvantifikujte živé a mŕtve bunky pomocou fluorescenčných farbív.
6. Analýza údajov
   Porovnajte údaje o životaschopnosti ošetrených a neošetrených biofilmov na určenie účinnosti antimikrobiálnych látok.
   Vypočítajte minimálnu eradikačnú koncentráciu biofilmu (MBEC) na základe koncentrácie potrebnej na elimináciu životaschopných buniek biofilmu.
7. Kontrola kvality
   Zabezpečte konzistentné podmienky sonikácie pravidelnou kalibráciou UIP400MTP a overením, že proces uvoľňovania biofilmu nevedie k významnej lýze alebo deštrukcii buniek.
   Zahrňte vhodné kontroly, ako sú neošetrené biofilmy a prázdne vzorky s médiom, na validáciu výsledkov.

Bunky biofilmu vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Nemecko, UIP250MTP) počas 5 min v 96-dôlkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na regeneráciu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira et al., 2016)

Integráciou UIP400MTP do pracovného toku ASTM E2799-22 je proces uvoľňovania biofilmu optimalizovaný pre konzistenciu, účinnosť a aplikácie s vysokou priepustnosťou.