Protokol ASTM E2799-22 pre antimikrobiálne hodnotenie

Hielscher UIP400MTP je výkonný a efektívny viacjamkový doštičkový sonikátor navrhnutý tak, aby zefektívnil krok sonikácie v protokole ASTM E2799-22. Dodávaním rovnomernej ultrazvukovej energie cez celú mikrotitračnú platňu UIP400MTP zaisťuje konzistentné a spoľahlivé oddelenie biofilmov od kolíkových viečok bez poškodenia buniek alebo ohrozenia integrity vzorky. Jeho vysoká priepustnosť a užívateľsky prívetivá prevádzka výrazne skracujú čas spracovania a zároveň zlepšujú reprodukovateľnosť, čo z neho robí ideálne riešenie pre laboratóriá vykonávajúce testy životaschopnosti biofilmu a testovanie antimikrobiálnej účinnosti.

ASTM E2799

ASTM E2799 je štandardizovaná testovacia metóda určená na vyhodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti biofilmom, konkrétne so zameraním na Pseudomonas aeruginosa. Biofilmy sú komplexné mikrobiálne spoločenstvá, ktoré priľnú k povrchom a vykazujú zvýšenú odolnosť voči antimikrobiálnej liečbe, čo z nich robí významnú výzvu v kontexte zdravotnej, priemyselnej a environmentálnej starostlivosti. Táto metóda využíva test minimálnej koncentrácie eradikacie biofilmu (MBEC) na poskytnutie spoľahlivého a reprodukovateľného rámca na testovanie dezinfekčných prostriedkov v realistických podmienkach biofilmu.

Ako sonikácia prispieva k ASTM E2799?

Sonikacia hrá rozhodujúcu úlohu v protokole ASTM E2799 tým, že uľahčuje oddelenie biofilmov od testovacích povrchov, čím sa zabezpečuje presné posúdenie mikrobiálnej životaschopnosti po ošetrení. Použitím riadenej ultrazvukovej energie protokol dosahuje efektívne a konzistentné narušenie biofilmu bez poškodenia buniek, čo umožňuje presné a reprodukovateľné výsledky. Vďaka tomu je ASTM E2799 základným nástrojom na pokrok vo výskume biofilmu a vývoj účinných antimikrobiálnych stratégií.

Ako spustiť test MBEC v súlade s ASTM E2799-22

Protokol ASTM E2799-22 načrtáva kroky na hodnotenie účinnosti antimikrobiálnych látok proti biofilmom. Pri použití ultrazvukového prístroja Hielscher UIP400MTP mikrotitračnej doštičky je možné protokol prispôsobiť tak, aby zahŕňal túto pokročilú metódu sonikácie na oddelenie biofilmu. Nižšie je uvedený popis krokov prispôsobených na použitie ultrazvukového UIP400MTP mikrodoštičiek:

1. Príprava biofilmov
   Pripravte si sterilnú 96-jamkovú mikrotitračnú platňu s odnímateľnými viečkami.
   Jamky naočkujte štandardizovanou bakteriálnou suspenziou vo vhodnom rastovom médiu.
   Umiestnite veko kolíka na platňu a uistite sa, že kolíky sú úplne ponorené do bakteriálnej suspenzie.
   Platňu inkubujte za kontrolovaných podmienok (napr. teplota a čas), aby sa na kolíkoch vytvoril biofilm.
2. Liečba antimikrobiálnymi látkami
   Po vytvorení biofilmu nahraďte médium čerstvým médiom obsahujúcim testované antimikrobiálne látky v rôznych koncentráciách.
   Znova nasaďte veko kolíka a inkubujte za podmienok špecifikovaných v návrhu testu.
3. Príprava na oddelenie biofilmu
   Po ošetrení opláchnite veko kolíka ponorením do sterilného oplachovacieho roztoku, aby ste odstránili zvyšky antimikrobiálnych látok a voľne prilepené planktónové bunky.
4. Oddelenie biofilmu pomocou UIP400MTP Sonikátora
   Pripravte si čerstvú 96-jamkovú mikrotitračnú platňu obsahujúcu regeneračné médium (napr. neutralizačný vývar).
   Odpojte biofilmy umiestnením veka kolíka do jamiek na doštičke regeneračného média.
   Vložte dosku do UIP400MTP sonikátora a uistite sa, že veko a tanier sú správne zarovnané.
   Nastavte sonikátor na 70%-80% amplitúdu a sonikujte na 3-4 minúty v režime cyklu, aby ste zabezpečili konzistentné oddelenie biofilmu bez lýzy buniek.
5. Hodnotenie životaschopnosti biofilmu
   Po sonikácii spracujte regeneračné médium obsahujúce oddelené biofilmové bunky pomocou štandardných mikrobiologických alebo analytických techník, ako napríklad:
   • Počet jednotiek tvoriacich kolónie (CFU): Vykonajte sériové riedenia a platničku na agar na výpočet životaschopných buniek.
   • Merania optickej hustoty (OD): Na posúdenie hustoty buniek použite spektrofotometrickú analýzu.
   • Testy životaschopnosti založené na fluorescencii: Kvantifikujte živé a mŕtve bunky pomocou fluorescenčných farbív.
6. analýza údajov
   Porovnajte údaje o životaschopnosti ošetrených a neošetrených biofilmov, aby ste určili účinnosť antimikrobiálnych látok.
   Vypočítajte minimálnu koncentráciu eradikačného biofilmu (MBEC) na základe koncentrácie potrebnej na odstránenie životaschopných biofilmových buniek.
7. Kontrola kvality
   Zabezpečte konzistentné podmienky sonikácie pravidelnou kalibráciou UIP400MTP a overením, či proces odlúčenia biofilmu nevedie k významnej lýze alebo deštrukcii buniek.
   Na overenie výsledkov zahrňte vhodné kontroly, ako sú neošetrené biofilmy a slepé vzorky obsahujúce iba médiá.

Biofilmové bunky vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology, Teltow, Nemecko, UIP250MTP) na 5 minút v 96-jamkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na obnovu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira a kol., 2016)

Integráciou UIP400MTP do pracovného postupu ASTM E2799-22 je proces oddeľovania biofilmu optimalizovaný pre konzistenciu, účinnosť a vysokovýkonné aplikácie.