Protokol testu MBEC s použitím sonikátora pre 96- jamkové platne UIP400MTP

Test MBEC sa používa na určenie koncentrácie antimikrobiálnych látok potrebných na elimináciu biofilmov vytvorených na viečkach s kolíkmi. Na posúdenie životaschopnosti biofilmu musia byť biofilmy najprv oddelené od viečok s kolíkmi 96-jamkovej platne. Sonikácia je najspoľahlivejšia a najefektívnejšia metóda pre toto oddelenie. Sonikátor pre viacjamkové platne UIP400MTP je špeciálne navrhnutý na spracovanie testovacích platní s maximálnou efektivitou a pohodlím, čím zjednodušuje a urýchľuje testy MBEC s vysokou priepustnosťou.

Sonikácia na oddelenie biofilmu

Sonikácia je kľúčovým krokom v testoch minimálnej eradikačnej koncentrácie biofilmu (MBEC), ktorá umožňuje účinné uvoľnenie buniek biofilmu z ich povrchového ukotvenia. Biofilmy sú prirodzene štruktúrované komunity mikroorganizmov obalené v extracelulárnej matrici, čo ich robí výrazne odolnejšími voči antimikrobiálnym látkam v porovnaní s planktonickými bunkami. Počas testov MBEC sonikácia využíva ultrazvukové vlny na generovanie kontrolovanej kavitácie, ktorá narúša matricu biofilmu a uvoľňuje zabudované bunky do suspenzie. Tento krok zabezpečuje, že bunky biofilmu sú rovnomerne rozptýlené v regeneračnom médiu, čo uľahčuje presné posúdenie životaschopnosti prostredníctvom platňových metód, riedenia alebo spektrofotometrických metód. Bez správneho oddelenia biofilmu by zvyšné zložky matrice mohli chrániť bunky, čo by viedlo k podceneniu antimikrobiálnej účinnosti. Preto je sonikácia nevyhnutná na získanie spoľahlivých a reprodukovateľných hodnôt MBEC, ktoré odrážajú skutočný eradikačný potenciál testovaných látok. Sonikátor pre viacjamkové platne UIP400MTP umožňuje jednoduchú prípravu vzoriek s vysokou priepustnosťou v testovacích platniach.

Protokol testu minimálnej eradikačnej koncentrácie biofilmu (MBEC)

Krok 1: Tvorba biofilmu

1. Pripravte bakteriálnu suspenziu:
   Pestujte baktérie v vhodných médiách do logaritmickej fázy rastu.
   Zrieďte bakteriálnu kultúru na definovanú optickú hustotu (napr. OD600 ~0,1).
2. Inokulujte 96-jamkovú platňu:
   Pridajte bakteriálnu suspenziu (napr. 150–200 µL) do každej jamky štandardnej 96-jamkovej mikrotitračnej platne.
3. Nasaďte viečko s kolíkmi:
   Umiestnite viečko s kolíkmi na inokulovanú platňu, aby sa umožnila tvorba biofilmu na povrchoch kolíkov.
4. Inkubujte platňu:
   Inkubujte nastavenie pri vhodnej teplote (napr. 37°C) po dobu 24–48 hodín bez miešania, aby sa podporil rast biofilmu.

Krok 2: Ošetrenie antimikrobiálnymi látkami

• Pripravte antimikrobiálne roztoky:
  Pripravte rozsah antimikrobiálnych koncentrácií v čerstvom médiu.
  Exponujte biofilmy antimikrobiálnym látkam:
  Odstráňte viečko s kolíkmi z bakteriálnej kultúry a opláchnite ho v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS na odstránenie planktonických buniek.
  Umiestnite viečko s kolíkmi do novej 96-jamkovej platne obsahujúcej antimikrobiálne roztoky.
• Inkubujte platňu:
  Inkubujte po definovanú dobu (napr. 24 hodín), aby sa umožnila antimikrobiálna expozícia.

Krok 3: Sonikácia so sonikátorom pre 96-jamkové platne UIP400MTP

Krok sonikácie je kritický pre oddelenie biofilmov od viečok s kolíkmi na posúdenie životaschopnosti. Postupujte podľa týchto krokov pre sonikátor UIP400MTP:

1. Pripravte nastavenie:
   Naplňte čerstvú 96-jamkovú platňu regeneračným médiom (napr. neutralizačným bujónom alebo čerstvým rastovým médiom) v každej jamke.
2. Preneste viečko s kolíkmi:
   Odstráňte viečko s kolíkmi z platne na antimikrobiálne ošetrenie.
   Opláchnite viečko s kolíkmi v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS na odstránenie zvyšných antimikrobiálnych látok.
3. Umiestnite platňu a sonikátor:
   Nasaďte viečko s kolíkmi na platňu s regeneračným médiom.
   Umiestnite platňu s regeneračným médiom na platformu sonikátora UIP400MTP a uistite sa, že je platňa vycentrovaná a stabilná.
4. Nastavte parametre sonikácie:
   Nastavte parametre sonikácie na UIP400MTP (nastavenia môžu byť upravené podľa biofilmu):
   Amplitúda: 70–100 %.
   Čas sonikácie: 1–3 minúty (upravte podľa robustnosti biofilmu) v cyklickom režime.
5. Sonikujte:
   Spustite proces sonikácie. Ultrazvukové vibrácie uvoľnia biofilmy z povrchov kolíkov do regeneračného média.
6. Monitorujte proces:
   Použite odpojiteľný teplotný senzor na monitorovanie teploty vzorky v jamkách. UIP400MTP môže byť pripojený k laboratórnemu chladiču na chladenie.
7. Manipulácia po sonikácii:
   Okamžite preneste regeneračné médium (teraz obsahujúce oddelené biofilmy) do čerstvej sterilnej platne na následnú analýzu.

(A) Platňa obsahujúca TSB s 2 % glukózy použitá na tvorbu biofilmu, regeneráciu buniek a
určenie MIC a MBCB; (B) Viečko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov. určenie MIC a MBCB; (B) Viečko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov.
Bunky biofilmu vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology) po dobu 5 minút v 96-jamkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na regeneráciu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira et al., 2016)

Krok 4: Posúdenie životaschopnosti

Naneste a pestujte oddelené biofilmy:

1. Vykonajte sériové riedenia regeneračného média a naneste ich na agar na enumeráciu kolónie-tvoriacich jednotiek (CFU).
   Alternatívne použite kolorimetrický alebo fluorescenčný test životaschopnosti.
2. Zaznamenajte výsledky:
   Určite MBEC ako najnižšiu koncentráciu antimikrobiálnej látky, ktorá eradikovala detegovateľnú životaschopnosť biofilmu.

Návrh, výroba a poradenstvo – Kvalita Made in Germany

Hielscher ultrazvukové zariadenia sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá prevádzka umožňujú hladkú integráciu našich ultrazvukových zariadení do priemyselných zariadení. Hielscher sonikátory si ľahko poradia s drsnými podmienkami a náročnými prostrediami.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikátom ISO a osobitný dôraz kladie na vysokovýkonné ultrazvukové zariadenia s najmodernejšou technológiou a používateľskou prívetivosťou. Samozrejme, Hielscher ultrazvukové zariadenia sú v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Prečítajte si tu, ako sa UIP400MTP používa na oddelenie biofilmu ako krok prípravy vzorky počas protokolu ASTM E2799 na testovanie účinnosti dezinfekčných prostriedkov proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocou testu MBEC.