Protokol MBEC Assay Protocol využívajúci 96-jamkový zvukový UIP400MTP

Test MBEC sa používa na stanovenie koncentrácie antimikrobiálnych látok potrebných na odstránenie biofilmov vytvorených na viečkach kolíkov. Na posúdenie životaschopnosti biofilmu sa biofilmy musia najskôr oddeliť od kolíkových viečok 96-jamkovej platne. Sonikácia je najspoľahlivejšou a najúčinnejšou metódou pre toto oddelenie. Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP je špeciálne navrhnutý na spracovanie testovacích dosiek s maximálnou účinnosťou a pohodlím, zefektívňujúc a urýchľujúc vysokovýkonné testy MBEC.

Sonikácia na oddelenie biofilmu

Sonikácia je kľúčovým krokom v testoch minimálnej koncentrácie eradikacie biofilmu (MBEC), ktorý umožňuje efektívne vytlačenie buniek biofilmu z ich povrchového pripojenia. Biofilmy sú vo svojej podstate štruktúrované spoločenstvá mikroorganizmov uzavreté v extracelulárnej matrici, čo ich robí výrazne odolnejšími voči antimikrobiálnym látkam v porovnaní s planktónovými bunkami. Počas testov MBEC sonikácia využíva ultrazvukové vlny na generovanie riadenej kavitácie, narúša matricu biofilmu a uvoľňuje vložené bunky do suspenzie. Tento krok zaisťuje, že bunky biofilmu sú rovnomerne rozptýlené v regeneračnom médiu, čo uľahčuje presné hodnotenie životaschopnosti pomocou pokovovania, riedenia alebo spektrofotometrických metód. Bez správneho oddelenia biofilmu by zvyškové zložky matrice mohli chrániť bunky, čo by viedlo k podhodnoteniu antimikrobiálnej účinnosti. Preto je sonikácia nevyhnutná na získanie spoľahlivých a reprodukovateľných hodnôt MBEC, ktoré odrážajú skutočný eradikačný potenciál testovaných látok. Viacjamkový doštičkový sonikátor UIP400MTP umožňuje jednoduchú vysokovýkonnú prípravu vzoriek v testovacích platniach.

Protokol o stanovení minimálnej koncentrácie eradikacie biofilmu (MBEC)

Krok 1: Tvorba biofilmu

1. Pripravte bakteriálnu suspenziu:
   Pestujte baktérie vo vhodných médiách, aby ste zaznamenali rast fázy.
   Bakteriálna kultúra sa zriedi na definovanú optickú hustotu (napr. OD600 ~ 0,1).
2. Naočkujte 96-jamkovú platňu:
   Pridajte bakteriálnu suspenziu (napr. 150–200 μl) do každej jamky štandardnej 96-jamkovej mikrotitračnej platničky.
3. Nasaďte veko kolíka:
   Umiestnite veko kolíka na naočkovanú platňu, aby sa na povrchoch kolíkov vytvoril biofilm.
4. Inkubujte tanier:
   Inkubujte zariadenie pri vhodnej teplote (napr. 37 °C) po dobu 24 – 48 hodín bez pretrepávania, aby ste podporili rast biofilmu.

Krok 2: Liečba antimikrobiálnymi látkami

• Pripravte antimikrobiálne roztoky:
  Pripravte si celý rad antimikrobiálnych koncentrácií v čerstvom médiu.
  Vystavte biofilmy antimikrobiálnym látkam:
  Odstráňte veko kolíka z bakteriálnej kultúry a opláchnite ho v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS, aby ste odstránili planktónové bunky.
  Umiestnite veko kolíka do novej 96-jamkovej platne obsahujúcej antimikrobiálne roztoky.
• Inkubujte tanier:
  Inkubujte na definované obdobie (napr. 24 hodín), aby sa umožnila expozícia antimikrobiálnym látkam.

Krok 3: Sonikácia pomocou 96-jamkového sonikátora UIP400MTP

Krok sonikácie je rozhodujúci pre oddelenie biofilmov z viečok kolíkov na posúdenie životaschopnosti. Pre UIP400MTP sonikátor postupujte podľa týchto krokov:

1. Pripravte nastavenie:
   Do každej jamky naplňte čerstvú 96-jamkovú platňu regeneračným médiom (napr. neutralizačným vývarom alebo čerstvým rastovým médiom).
2. Preneste veko kolíka:
   Odstráňte veko kolíka z antimikrobiálnej ošetrovacej dosky.
   Opláchnite veko kolíka v sterilnom fyziologickom roztoku alebo PBS, aby ste odstránili zvyšky antimikrobiálnych látok.
3. Umiestnite platňu a sonikátor:
   Pripevnite veko kolíka k doske regeneračného média.
   Umiestnite dosku regeneračného média na platformu UIP400MTP sonikátora a uistite sa, že je platňa vycentrovaná a stabilná.
4. Upravte parametre sonikácie:
   Nastavte parametre sonikácie na UIP400MTP (Nastavenia je možné upraviť podľa biofilmu):
   Amplitúda: 70–100%.
   Čas sonikácie: 1–3 minúty (upravte na základe robustnosti biofilmu) v režime cyklu.
5. Sonikujte:
   Spustite proces sonikácie. Ultrazvukové vibrácie uvoľnia biofilmy z povrchov kolíkov do regeneračného média.
6. Sledujte proces:
   Pomocou zásuvného snímača teploty monitorujte teplotu vzorky v jamkách. UIP400MTP je možné pripojiť k laboratórnemu chladiču na chladenie.
7. Manipulácia po sonikácii:
   Regeneračné médium (teraz obsahujúce oddelené biofilmy) sa okamžite prenesie do čerstvej sterilnej platne na následnú analýzu.

(A) Doštička obsahujúca TSB s 2 % glukózy používaná na tvorbu biofilmu, obnovu buniek a
stanovenie MIC a MBCB; (B) Veko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov. stanovenie MIC a MBCB; (B) Veko s kolíkmi na tvorbu stafylokokových biofilmov.
Biofilmové bunky vytvorené na kolíkoch boli uvoľnené sonikáciou (Hielscher Ultrasound Technology) na 5 minút v 96-jamkových platniach obsahujúcich čerstvé kultivačné médium na obnovu buniek.
(Obrázok a štúdia: ©de Oliveira a kol., 2016)

Krok 4: Posúdenie životaschopnosti

Biofilmy oddelené od platní a kultúry:

1. Vykonajte sériové riedenia regeneračného média a platne na agar, aby ste vymenovali jednotky tvoriace kolónie (CFU).
   Prípadne použite kolorimetrický alebo fluorescenčný test životaschopnosti.
2. Rekordné výsledky:
   Určte MBEC ako najnižšiu koncentráciu antimikrobiálnej látky, ktorá odstránila zistiteľnú životaschopnosť biofilmu.

Dizajn, výroba a poradenstvo – Kvalita vyrobená v Nemecku

Ultrazvukové prístroje Hielscher sú známe svojou najvyššou kvalitou a dizajnovými štandardmi. Robustnosť a jednoduchá obsluha umožňujú bezproblémovú integráciu našich ultrazvukových prístrojov do priemyselných zariadení. Drsné podmienky a náročné prostredie ľahko zvládnu sonikátory Hielscher.

Hielscher Ultrasonics je spoločnosť s certifikáciou ISO a kladie osobitný dôraz na vysokovýkonné ultrazvukové prístroje s najmodernejšou technológiou a užívateľskou prívetivosťou. Ultrazvukové prístroje Hielscher sú samozrejme v súlade s CE a spĺňajú požiadavky UL, CSA a RoHs.

Prečítajte si, ako sa UIP400MTP používa na oddelenie biofilmu ako krok prípravy vzorky počas protokolu ASTM E2799 na testovanie účinnosti dezinfekčného prostriedku proti biofilmu Pseudomonas aeruginosa pomocou testu MBEC.