Preparação ultrassónica de liposomas

Os liposomas produzidos por ultrassons apresentam uma eficiência de incorporação muito elevada, uma elevada capacidade de carga e um tamanho esférico uniformemente pequeno. Assim, os liposomas produzidos por ultrassons oferecem uma excelente biodisponibilidade. A Hielscher Ultrasonics disponibiliza sonicadores ultrassónicos para a produção fiável de liposomas de grau farmacêutico em modo descontínuo e contínuo.

Vantagens da produção ultrassónica de liposomas

O encapsulamento ultrassónico em liposomas é uma técnica utilizada para encapsular fármacos ou outros agentes terapêuticos no interior de liposomas através de energia ultrassónica. Em comparação com outros métodos de encapsulamento em liposomas, o encapsulamento ultrassónico apresenta várias vantagens que o tornam a técnica de produção superior.

• Elevada carga, elevada eficiência de incorporação: A produção ultrassónica de liposomas é amplamente reconhecida por produzir liposomas com uma elevada carga de ingredientes ativos, por exemplo, vitamina C, moléculas de fármacos, etc. Simultaneamente, o método de sonicação apresenta uma elevada eficiência de incorporação. Isto significa que uma elevada percentagem da substância ativa é encapsulada por ultrassons. Em conclusão, isto torna o tratamento por ultrassons um método altamente eficiente para a produção de liposomas.
• Liposomas uniformemente pequenos: Uma vantagem do encapsulamento ultrassónico em liposomas é a sua capacidade de produzir liposomas altamente uniformes com uma distribuição estreita de tamanhos. A energia ultrassónica pode ser utilizada para fragmentar liposomas maiores ou agregados lipídicos em liposomas mais pequenos e mais uniformes. Isto conduz a uma maior consistência no tamanho e na forma dos liposomas, o que pode ser importante em aplicações de administração de fármacos nas quais o tamanho das partículas pode afetar a sua farmacocinética e eficácia.
• Aplicável a quaisquer moléculas: Outra vantagem do encapsulamento ultrassónico em liposomas é a sua capacidade de encapsular uma vasta gama de fármacos e outros agentes terapêuticos. A técnica pode ser utilizada para encapsular tanto fármacos hidrofílicos como hidrofóbicos, o que pode ser difícil de conseguir com outros métodos. Além disso, a energia ultrassónica pode ser utilizada para encapsular macromoléculas e nanopartículas, que podem ser demasiado grandes para serem encapsuladas por outros métodos.
• Rápido e fiável: O encapsulamento ultrassónico em liposomas é também um processo relativamente simples e rápido. Não requer a utilização de produtos químicos agressivos nem de temperaturas elevadas, que podem ser prejudiciais aos agentes terapêuticos que estão a ser encapsulados.
• Aumento de escala: Além disso, a técnica pode ser facilmente ampliada para produção em larga escala, tornando-a uma opção economicamente vantajosa para aplicações de administração de fármacos.

Em resumo, o encapsulamento ultrassónico em liposomas é uma técnica superior de encapsulamento em liposomas devido à sua capacidade de produzir liposomas uniformes com uma distribuição estreita de tamanhos, de encapsular uma vasta gama de agentes terapêuticos e à sua simplicidade e possibilidade de aumento de escala.

Após a formação de uma película lipídica e a sua subsequente reidratação, utiliza-se a sonicação para promover a incorporação de ingredientes ativos no liposoma. Além disso, a sonicação permite obter o tamanho de liposoma desejado.

Preparação ultrassónica de liposomas para produtos farmacêuticos e cosméticos

Os liposomas (vesículas de base lipídica), os transferosomas (liposomas ultradeformáveis), os etosomas (vesículas ultradeformáveis com elevado teor de álcool) e os niosomas (vesículas sintéticas) são vesículas microscópicas que podem ser preparadas artificialmente como veículos globulares nos quais se podem encapsular moléculas ativas. Estas vesículas, com diâmetros entre 25 e 5000 nm, são frequentemente utilizadas como veículos de fármacos nas indústrias farmacêutica e cosmética, em aplicações como a administração oral ou tópica de fármacos, a terapia génica e a imunização. O tratamento por ultrassons é um método cientificamente comprovado para a produção altamente eficiente de liposomas. Os sonicadores ultrassónicos Hielscher produzem liposomas com elevadas cargas de ingredientes ativos e uma biodisponibilidade superior.

Liposomas e formulação liposomal

Os liposomas são sistemas vesiculares unilamelares, oligolamelares ou multilamelares e são compostos pelo mesmo material que uma membrana celular (bicamada lipídica). Quanto à sua composição e ao seu tamanho, os liposomas distinguem-se da seguinte forma:

• vesículas multilamelares (MLV, 0,1–10μm)
• vesículas unilamelares pequenas (SUV, <100 nm)
• vesículas unilamelares grandes (LUV, 100–500 nm)
• vesículas unilamelares gigantes (GUV, ≥1 μm)

A estrutura principal dos liposomas é constituída por fosfolípidos. Os fosfolípidos possuem um grupo polar hidrofílico e um grupo caudal hidrofóbico, constituído por uma longa cadeia de hidrocarbonetos.
A membrana dos liposomas tem uma composição muito semelhante à da barreira cutânea, pelo que estes podem ser facilmente integrados na pele humana. À medida que os liposomas se fundem com a pele, podem libertar os agentes incorporados diretamente no destino, onde os ingredientes ativos podem desempenhar as suas funções. Assim, os liposomas aumentam a penetrabilidade/permeabilidade da pele aos agentes farmacêuticos e cosméticos incorporados. Também os liposomas sem agentes encapsulados, as vesículas vazias, são potentes ingredientes ativos para a pele, uma vez que a «phosphatidylcholin» incorpora dois componentes essenciais que o organismo humano não consegue produzir por si próprio: ácido linoleico e colina.
Os liposomas são utilizados como veículos biocompatíveis de fármacos, péptidos, proteínas, «plasmic DNA», oligonucleótidos antissentido ou ribozimas, para fins farmacêuticos, cosméticos e bioquímicos. A enorme versatilidade no tamanho das partículas e nos parâmetros físicos dos lípidos oferece um potencial atrativo para a criação de veículos à medida para uma vasta gama de aplicações. (Ulrich 2002)

Formação ultrassónica de liposomas

Os liposomas podem ser formados através da utilização de ultrassons. O material de base para a preparação de liposomas são moléculas «amphilic» derivadas dos lípidos das membranas biológicas ou baseadas nestes. Para a formação de vesículas unilamelares pequenas (SUV), a dispersão lipídica é suavemente sonicada – por exemplo, com o dispositivo ultrassónico de mão UP50H (50W, 30kHz), o VialTweeter ou o reator ultrassónico CupHorn – num banho de gelo. Um tratamento ultrassónico deste tipo dura aproximadamente 5 – 15 minutos. Outro método para produzir vesículas unilamelares pequenas é a sonicação dos liposomas de vesículas multilamelares.
Dinu-Pirvu et al. (2010) relatam a obtenção de transferosomas através da sonicação de MLV à temperatura ambiente.
A Hielscher Ultrasonics disponibiliza vários dispositivos ultrassónicos, sonotrodos e acessórios, podendo assim fornecer a configuração ultrassónica mais adequada para um encapsulamento altamente eficiente em liposomas a qualquer escala.

Encapsulamento ultrassónico de substâncias ativas em liposomas

Os liposomas funcionam como veículos de ingredientes ativos, tais como vitaminas, moléculas terapêuticas, péptidos, etc. Os ultrassons são uma ferramenta eficaz para preparar e formar liposomas destinados à incorporação de agentes ativos. Simultaneamente, a sonicação auxilia o processo de encapsulamento e incorporação, permitindo produzir liposomas com uma elevada carga de ingredientes ativos. Antes do encapsulamento, os liposomas tendem a formar aglomerados devido à interação carga–carga à superfície das cabeças polares dos fosfolípidos (cf. Míckova et al. 2008); além disso, têm de ser abertos. A título de exemplo, Zhu et al. (2003) descrevem o encapsulamento de biotina em pó em liposomas por ultrassons. Quando a biotina em pó foi adicionada à solução da suspensão de vesículas, a solução foi sonicada. Após este tratamento, a biotina ficou incorporada nos liposomas.
Saiba mais sobre o encapsulamento ultrassónico de «peptrides» GLP-1 (por exemplo, semaglutida) em liposomas!

Emulsões liposomais com tratamento por ultrassons

Para melhorar o efeito nutritivo de cremes hidratantes ou antienvelhecimento, loções, géis e outras formulações cosmecêuticas, adicionam-se emulsionantes às dispersões liposomais para estabilizar quantidades mais elevadas de lípidos. No entanto, estudos demonstraram que a capacidade dos liposomas é geralmente limitada. Com a adição de emulsionantes, este efeito manifesta-se mais cedo e os emulsionantes adicionais reduzem a afinidade da fosfatidilcolina pela barreira cutânea. As nanopartículas – compostas por fosfatidilcolina e lípidos – são a resposta a este problema. Estas nanopartículas são formadas por uma gotícula de óleo revestida por uma monocamada de fosfatidilcolina. A utilização de nanopartículas permite obter formulações capazes de absorver mais lípidos e de permanecer estáveis, pelo que não são necessários emulsionantes adicionais.
O tratamento por ultrassons é um método comprovado para a produção de nanoemulsões e nanodispersões. Os ultrassons de elevada intensidade fornecem a potência necessária para dispersar uma fase líquida (fase dispersa), sob a forma de pequenas gotículas, numa segunda fase (fase contínua). Na zona de dispersão, as bolhas de cavitação que implodem provocam ondas de choque intensas no líquido circundante e originam a formação de jatos de líquido de elevada velocidade. Para estabilizar as gotículas recém-formadas da fase dispersa contra a coalescência, adicionam-se emulsionantes (substâncias com atividade superficial, tensioativos) e estabilizantes à emulsão. Como a coalescência das gotículas após a rutura influencia a distribuição final dos tamanhos das gotículas, utilizam-se emulsionantes com estabilização eficiente para manter a distribuição final dos tamanhos das gotículas num nível igual ao da distribuição imediatamente após a rutura das gotículas na zona de dispersão ultrassónica.

Dispersões liposomais por tratamento ultrassónico

As dispersões liposomais à base de «phosphatidylchlorine» insaturada apresentam pouca estabilidade face à oxidação. A estabilização da dispersão pode ser conseguida através de antioxidantes, como um complexo de vitaminas C e E.
 

Formação de liposomas pelo método de evaporação em fase inversa com sonicação

 
Ortan et al. (2002) obtiveram bons resultados no seu estudo sobre a preparação ultrassónica de óleo essencial de Anethum graveolens em liposomas. Após a sonicação, o tamanho dos liposomas situava-se entre 70–150 nm e, no caso das MLV, entre 230–475 nm; estes valores mantiveram-se aproximadamente constantes também após 2 meses, mas aumentaram após 12 meses, especialmente na dispersão de SUV (ver histogramas abaixo). A medição da estabilidade, relativa à perda de óleo essencial e à distribuição de tamanhos, também mostrou que as dispersões liposomais mantinham o teor de óleo volátil. Isto sugere que a incorporação do óleo essencial em liposomas aumentou a estabilidade do óleo.

Ortan et al. (2009): Estabilidade das dispersões de MLV e SUV após 1 ano. As formulações liposomais foram armazenadas a 4±1 ºC.

Os processadores ultrassónicos Hielscher são os dispositivos ideais para aplicações nas indústrias cosmética e farmacêutica. Os sistemas constituídos por vários processadores ultrassónicos de até 16 000 watts cada fornecem a capacidade necessária para transformar esta aplicação laboratorial num método de produção eficiente que permite obter emulsões finamente dispersas em fluxo contínuo ou em modo descontínuo – alcançando resultados comparáveis aos dos melhores homogeneizadores de alta pressão atualmente disponíveis, tais como válvulas de orifício. Além desta elevada eficiência na emulsificação contínua, os dispositivos ultrassónicos Hielscher requerem muito pouca manutenção e são muito fáceis de operar e de limpar. Os ultrassons auxiliam efetivamente a limpeza e o enxaguamento. A potência ultrassónica é ajustável e pode ser adaptada a produtos específicos e aos requisitos de emulsificação. Estão também disponíveis reatores especiais de célula de fluxo que cumprem os requisitos avançados de CIP (limpeza no local) e SIP (esterilização no local).

Perguntas frequentes sobre liposomas

Que tipos de liposomas se distinguem?

Os liposomas são classificados em diferentes tipos com base no seu tamanho e no número de bicamadas que contêm. Estas categorias incluem:

• Vesículas unilamelares pequenas (SUV): São os liposomas mais pequenos, com uma única bicamada lipídica.
• Vesículas unilamelares grandes (LUV): Maiores do que as SUV, também possuem uma única bicamada.
• Vesículas multilamelares (MLV): Contêm várias bicamadas concêntricas.
• Vesículas multivesiculares (MVV): São compostas por várias vesículas mais pequenas no interior de uma vesícula maior.

 
Outros tipos especializados incluem:

• Liposomas PEGuilados: Liposomas modificados com polietilenoglicol (PEG) para melhorar a estabilidade e o tempo de circulação.
• Nanoliposomas: Liposomas muito pequenos, normalmente utilizados para a administração direcionada de fármacos.

Que estruturas vesiculares podem os liposomas apresentar?

Os liposomas são ainda classificados, com base na sua estrutura vesicular, em sete tipos principais:

• Vesículas multilamelares grandes (MLV): Contêm várias bicamadas.
• Vesículas oligolamelares (OLV): Possuem algumas bicamadas.
• Vesículas unilamelares pequenas (SUV): As mais pequenas, com uma única bicamada.
• Vesículas unilamelares de tamanho médio (MUV): De tamanho intermédio, com uma única bicamada.
• Vesículas unilamelares grandes (LUV): Maiores, com uma única bicamada.
• Vesículas unilamelares gigantes (GUV): Muito grandes, com uma única bicamada.
• Vesículas multivesiculares (MVV): Várias vesículas no interior de uma única vesícula grande.

Quais são as diferenças entre liposomas e niosomas?

Os liposomas e os niosomas diferem principalmente na sua composição:
Liposomas: Constituídos por fosfolípidos de cadeia dupla, que podem ser neutros ou apresentar carga.
Niosomas: Constituídos por tensioativos de cadeia simples sem carga e colesterol.
Ambas as estruturas são formadas através de sonicação, que promove a organização das vesículas com bicamada.

Qual é o tamanho ideal de um liposoma?

Para a administração terapêutica, o tamanho ideal de um liposoma situa-se teoricamente entre 50 e 200 nanómetros de diâmetro. Este intervalo de tamanhos otimiza a estabilidade e a biodisponibilidade. A sonicação é frequentemente utilizada para reduzir a vesícula ao tamanho desejado.

Os liposomas podem transportar fármacos hidrofílicos?

Sim, os liposomas podem transportar fármacos hidrofílicos. São valorizados em aplicações biomédicas pela sua capacidade de encapsular tanto agentes hidrofóbicos como hidrofílicos. Além disso, oferecem elevada biocompatibilidade e biodegradabilidade, o que os torna sistemas eficazes de administração.

Como produzir liposomas?

As técnicas mais comuns de preparação de liposomas são o método da película fina e o método de evaporação em fase inversa.
Método de hidratação de película fina:

1. Dissolva os lípidos num solvente orgânico.
2. Evapore o solvente para formar uma película lipídica fina.
3. Hidrate a película com uma solução aquosa, utilizando sonicação para formar vesículas multilamelares.

Método de evaporação em fase inversa:

1. Dissolva os lípidos em água e etanol.
2. Sonique a solução a 60°C durante cerca de 10 minutos para criar uma pasta lipídica.
3. Arrefeça a suspensão lipídica e adicione água ou solução tampão gota a gota, enquanto agita.
4. Hidrate a suspensão durante 1 hora para formar vesículas multilamelares.
5. Reduza o tamanho dos liposomas através de sonicação adicional.

O que são arqueosomas?

Os arqueosomas são liposomas produzidos a partir de lípidos de arqueias, conhecidos pela sua estabilidade e resistência a condições extremas. Estas propriedades tornam os arqueosomas particularmente úteis para a administração de fármacos e o desenvolvimento de vacinas em ambientes exigentes.

Como são preparados os arqueosomas?

Procedimento de sonicação segundo Pise (2022): Os arqueosomas podem ser produzidos a partir da fração lipídica polar «PLF» de Sulfolobussolfataricus por sonicação a 60°C, sem necessidade de reposição externa de lípidos. A 0°C, os lípidos polares de Sulfolobusacidocaldarius foram sonicados eficazmente para formar arqueosomas. Foram produzidos arqueosomas carregados com BMD e liposomas convencionais, bem como lípidos de arqueias isolados de Archaea H. salinarum e enriquecidos com fosfatidilcolina, através de técnicas de sonicação. Foram criadas vesículas sonicadas para administração tópica através da sonicação de dispersões de MLV a 80 por cento de amplitude durante 4 minutos, utilizando um sonicador de sonda Hielscher UP50H (ver imagem à esquerda).

Bibliografia/Referências

• Raquel Martínez-González, Joan Estelrich, Maria Antònia Busquets (2016): Liposomes Loaded with Hydrophobic Iron Oxide Nanoparticles: Suitable T2 Contrast Agents for MRI. International Journal of Molecular Science 2016.
• Zahra Hadian, Mohammad Ali Sahari, Hamid Reza Moghimi; Mohsen Barzegar (2014): Formulation, Characterization and Optimization of Liposomes Containing Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic Acids; A Methodology Approach. Iranian Journal of Pharmaceutical Research (2014), 13 (2): 393-404.
• Joanna Kopecka, Giuseppina Salzano, Ivana Campia, Sara Lusa, Dario Ghigo, Giuseppe De Rosa, Chiara Riganti (2014): Insights in the chemical components of liposomes responsible for P-glycoprotein inhibition. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 2013.
• Pise, Ganesh (2022): Archaeosomes for both cell-based delivery applications and drug-based delivery applications. Journal of Medical Pharmaceutical and Allied Sciences 11, 2022. 4995-5003.