Aplicações ultra-sónicas no vírus MonkeyPox

A ultrassonografia é um importante método de processamento para o isolamento do vírus da varíola do macaco (MPXV) de amostras analíticas, para a fragmentação do DNA do vírus, bem como na fabricação de vacinas contra a varíola do macaco. Para a preparação de amostras antes de diagnósticos e análises (PCR, ELISA, etc.), a ultrassonografia é utilizada para lisar células, a fim de libertar o vírus da varíola do interior da célula e/ou fragmentar o ADN. Na produção de vacinas, as aplicações vão desde a preparação de partículas de vírus / DNA, encapsulamento em portadores de drogas e formulação dos inóculos.
Abaixo pode encontrar informações detalhadas sobre a preparação ultra-sónica de amostras do vírus da varíola do macaco, bem como sobre a produção de vacinas MPXV assistida por ultra-sons.

O que encontrará nesta página:

• Lise ultra-sónica para extração do vírus da varíola do macaco
• Fragmentação ultra-sónica do ADN do vírus da varíola do macaco
• Aplicações ultra-sónicas na produção da vacina MPXV

Lise ultra-sónica e fragmentação do ADN antes da reação em cadeia da polimerase (PCR)

A infeção pelo vírus da varíola do macaco é detectada através de testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT), utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional ou em tempo real, para deteção de sequências únicas de ADN viral. A amostra (por exemplo, de swaps nasofaríngeos ou biópsias de pele) contém o vírus nas células.
Para a análise, o vírus deve ser libertado das células e o ADN viral deve ser fragmentado para PCR.

Lise por ultra-sons:

A rutura/lise de células por ultra-sons é um método fiável e eficaz para isolar vírus de amostras de células e, por conseguinte, uma técnica preferível em relação aos agentes químicos, como a lisozima, a proteinase K e diferentes detergentes que são alternativamente utilizados para obter a lise celular e a libertação de ADN.
No entanto, a utilização destes reagentes químicos requer uma preparação demorada da amostra em várias etapas antes da análise PCR para evitar a inibição da reação PCR. Uma vez que os inibidores da PCR afectam a eficiência da amplificação, pequenas variações da quantidade de inibidores que não são removidos podem levar a grandes variações na amplificação do produto da PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultra-sons para a lise é que é desejável a rutura completa das estruturas celulares e a libertação de ADN sem a necessidade de reagentes de lise e de uma preparação demorada da amostra. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentação ultra-sónica do ADN:

A fragmentação ultra-sónica do ADN é simples e fiável, uma vez que produz fragmentos de ADN de comprimento ajustável (pares de bases, pb). Utilizando ultra-sons, o ADN pode ser eficazmente fragmentado até ao comprimento de ADN pretendido. O controlo preciso dos parâmetros ultra-sónicos e as opções de arrefecimento sofisticadas evitam a degradação do ADN.
Leia mais sobre a fragmentação ultra-sónica do ADN!

Aplicações ultra-sónicas na vacina contra o vírus da varíola do macaco

As vacinas utilizadas contra o vírus da varíola dos macacos são atualmente vacinas de vírus vivos. As vacinas recentemente desenvolvidas poderão utilizar outras plataformas, como as baseadas no ADN. A vacina contém atualmente um vírus Vaccinia Ankara modificado, um ortopoxvírus atenuado e não replicante. Contém também Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina pode também conter pequenas quantidades de ADN e proteínas de células de fibroblastos de embrião de galinha, que são utilizadas para cultivar o vírus da vacina, benzonase e compostos antibióticos como a gentamicina e a ciprofloxacina.

A homogeneização por ultra-sons é utilizada na produção de vacinas de vírus vivos atenuados, vacinas de ADN, cocktails de ADN multivalente, vacinas de ARNm, vacinas de proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.

Pode encontrar informações mais aprofundadas sobre aplicações ultra-sónicas para melhorar o fabrico de vacinas!

Protocolo de isolamento ultrassónico do vírus da varíola do macaco

A equipa de investigação de Stittelaar (2005) utilizou a lise ultra-sónica para libertar o vírus da varíola do macaco da cultura de células hospedeiras em crescimento, bem como de células obtidas através de trocas de garganta de primatas infectados.

Preparação da vacina contra a varíola do macaco:

Os vírus da varíola do macaco foram cultivados em células de fibroblastos de embrião de galinha isentas de agentes patogénicos específicos. Após incubação durante 1 a 2 dias, a suspensão de células virais foi colhida por uma ronda de congelação-descongelação e depois concentrada por centrifugação. O pellet foi ressuspendido e sujeito a várias rondas de homogeneização ultra-sónica.

Isolamento do vírus da varíola dos macacos vacinados:

As amostras foram liofilizadas três vezes e sonicadas num CupHorn ultrassónico. Foram utilizadas duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro fetal de bovino para inocular monocamadas de células Vero em placas de seis poços. Após 1 h de incubação a 37°C, os inóculos foram removidos e substituídos por meio de cultura suplementado com 1% de soro fetal de bovino. As monocamadas foram cultivadas durante 5 dias a 37°C e coradas com uma solução de violeta cristal.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultrasonicators para análise de vírus e produção de vacinas

O vasto portfólio de produtos da Hielscher Ultrasonics oferece o ultrasonicador ideal para laboratórios de investigação e análise, bem como para o fabrico industrial de vacinas.
A Hielscher Ultrasonics é especializada na conceção, fabrico e distribuição de ultrasonicadores e sono-bioreactores de alto desempenho para utilização em laboratórios de investigação e análise, bem como para implementação na produção industrial de vacinas (por exemplo vacinas, APIs).
A sonicação pode ser aplicada a recipientes abertos, reactores fechados de agitação contínua e reactores de fluxo contínuo. Todas as peças dos sistemas de ultra-sons, que entram em contacto com o meio líquido, são feitas de aço inoxidável, titânio ou vidro. As peças autoclaváveis e os acessórios sanitários asseguram a produção sob condições de qualidade farmacêutica.
Registo automático de dados: O software inteligente regista automaticamente os parâmetros do processo de sonicação no cartão de memória SD integrado. O controlo preciso de todos os parâmetros do processo assegura a reprodutibilidade, normalização da produçãoe facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Os processadores ultra-sónicos são altamente fiáveis e podem ser controlados com precisão. Todos os ultrassons industriais podem ser ajustados para fornecer toda a gama de amplitudes, desde as mais baixas às mais elevadas. A robustez dos sistemas de ultra-sons da Hielscher permite um funcionamento 24 horas por dia, 7 dias por semana, em ambientes exigentes.

O quadro seguinte dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximada dos nossos ultra-sons: