A ultrassônica é um importante método de processamento para o isolamento do vírus macacopox (MPXV) a partir de amostras analíticas, para fragmentação de DNA de vírus, bem como na fabricação de vacinas de macaco. Para preparação da amostra antes do diagnóstico e análise (PCR, ELISA etc.) a ultrassonização é usada para lise células a fim de liberar o vírus da varíola macaco do interior da célula e/ou fragmentar o DNA. Na produção de vacinas, as aplicações vão desde a preparação de partículas/DNA do vírus, encapsulamento em portadores de medicamentos e formulação do inocula.
Abaixo você pode encontrar informações detalhadas sobre a preparação da amostra de vírus macaco-aranha ultrassônico, bem como a produção de vacinas MPXV ultrasonicamente assistidas.

O que você vai encontrar nesta página:

• Lise ultrassônica para extração de vírus monkeypox
• Fragmentação ultrassônica do DNA do vírus Monkeypox
• Aplicações ultrassônicas na produção de vacinas MPXV

Lise ultrassônica e fragmentação de DNA antes da Reação de Cadeia de Polimerase (PCR)

Uma infecção por vírus macaco-varexo é detectada por testes de amplificação de ácido nucleico (NAAT), usando reação em cadeia de polimerase em tempo real ou convencional (PCR), para detecção de sequências únicas de DNA viral. A amostra (por exemplo, de troca de nasofaríngea ou biópsias de pele) contém o vírus em células.
Para análise, o vírus deve ser liberado das células ans o DNA viral deve ser fragmentado para PCR.

Lysis ultrassônica:

A ruptura /lise celular ultrassônica é um método confiável e eficiente para isolar vírus de amostras de células e, assim, uma técnica preferível sobre agentes químicos, como lysozyme, proteinase K e diferentes detergentes que são usados alternativamente para alcançar a lise celular e a liberação do DNA.
No entanto, o uso desses reagentes químicos requer a preparação demorada da amostra em várias etapas antes da análise do PCR para evitar a inibição da reação pcr. Uma vez que os inibidores de PCR afetam a eficiência da amplificação, pequenas variações da quantidade de inibidores que não são removidos podem levar a grandes variações na amplificação do produto PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultrassonização para a lise é que a completa interrupção das estruturas celulares e a liberação de DNA sem a necessidade de reagentes e preparação demorada da amostra são desejáveis. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentação de DNA ultrassônico:

A fragmentação do DNA ultrassônico é simples e confiável, pois produz fragmentos de DNA tunable in length (pastas de base, bp). Usando ultrassom, o DNA pode ser efetivamente fragmentado para o comprimento do DNA alvo. Controle preciso sobre parâmetros ultrassônicos e opções sofisticadas de resfriamento impedem a degradação do DNA.
Leia mais sobre fragmentação de DNA ultrassônico!

Aplicações ultrassônicas na vacina contra o vírus Monkeypox

Vacinas usadas contra o vírus macaco-varexi são atualmente vacinas contra vírus vivos. Vacinas recém-desenvolvidas podem usar outras plataformas, como a baseada em DNA Atualmente contém uma vaccinia ankara viurs modificada, um ortoxivírus atenuado e não replicante. Também contém Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina também pode conter pequenas quantidades de DNA e proteína das células fibroblastos de embrião de frango, que são usadas para cultivar o vírus da vacina, benzonase e compostos antibióticos como gentamicina e ciprofloxacina.

A homogeneização ultrassônica é usada na produção de vacinas contra vírus atenuadas ao vivo, vacinas de DNA, coquetéis de DNA multi-valentes, vacinas de mRNA, vacinas contra proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.

Você pode encontrar informações mais aprofundadas sobre aplicações ultrassônicas para uma melhor fabricação de vacinas!

Protocolo para isolamento ultrassônico do vírus Monkeypox

A equipe de pesquisa de Stittelaar (2005) usou a lise ultrassônica para liberar o vírus macacopox da cultura celular hospedeira de crescimento, bem como de células obtidas através de trocas de garganta de primatas infectados.

Preparação da vacina Monkeypox:

Os vírus monkeypox foram cultivados em células fibroblastos de embrião de frango sem patógenos específicos. Após a incubação por 1 a 2 dias, a suspensão da célula do vírus foi colhida por uma rodada de congelamento e depois concentrada por centrifugação. A pelota foi resuspendida e submetida a várias rodadas de homogeneização ultrassônica.

Isolamento do vírus Monkeypox de macaques vacinados:

As amostras foram descongeladas três vezes e sônicas em um CupHorn ultrassônico. Duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro bovino fetal foram usadas para inocular monocamadas celulares Vero em placas de seis poços. Após 1h de incubação a 37°C, o inocula foi removido e substituído por meio de cultura suplementado com 1% de soro bovino fetal. As monocamadas foram cultivadas por 5 dias a 37°C e manchadas com uma solução violeta cristalina.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultrassonicadores para Análise de Vírus e Produção de Vacinas

O amplo portfólio de produtos hielscher ultrasonics oferece o ultrassonicador ideal para pesquisas e laboratórios analíticos, bem como para a fabricação de vacinas industriais.
A Hielscher Ultrasonics é especializada no projeto, fabricação e distribuição de ultrassononicadores de alto desempenho e ultrassom para uso em laboratórios de pesquisa e análise, bem como para implementação na produção de vacinas industriais (por exemplo. vacinas, Apis).
A sônica pode ser aplicada a embarcações abertas, reatores fechados e reatores contínuos de fluxo. Todas as partes dos sistemas ultrassônicos, que entram em contato com o meio líquido, são feitas de aço inoxidável, titânio ou vidro. Peças autoclaváveis e acessórios sanitários garantem a produção sob condições de grau farmacêutico.
Gravação automática de dados: O software inteligente registra os parâmetros do processo de sonicação automaticamente no cartão de memória SD integrado. O controle preciso de todos os parâmetros do processo assegura a reprodutibilidade, normalização da produção, e facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Os processadores ultrassônicos são altamente confiáveis e podem ser precisamente controlados. Todos os ultrassonicadores industriais podem ser ajustados para fornecer a gama completa de amplitudes mais baixas a muito altas. A robustez dos sistemas ultrassônicos da Hielscher permite a operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, sob serviço pesado e em ambientes exigentes.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximado de nossos ultrasonicators: