Aplicações ultrassônicas no vírus MonkeyPox

A ultrassônica é um importante método de processamento para o isolamento do vírus macacopox (MPXV) a partir de amostras analíticas, para fragmentação de DNA de vírus, bem como na fabricação de vacinas de macaco. Para preparação da amostra antes do diagnóstico e análise (PCR, ELISA etc.) a ultrassonização é usada para lise células a fim de liberar o vírus da varíola macaco do interior da célula e/ou fragmentar o DNA. Na produção de vacinas, as aplicações vão desde a preparação de partículas/DNA do vírus, encapsulamento em portadores de medicamentos e formulação do inocula.
Abaixo você pode encontrar informações detalhadas sobre a preparação da amostra de vírus macaco-aranha ultrassônico, bem como a produção de vacinas MPXV ultrasonicamente assistidas.

 

O que você vai encontrar nesta página:

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Ultrassonicadores de alto desempenho são uma ferramenta crítica de processamento na produção de muitas vacinas.

Este sistema de ultrassonicadores 2x 1kW para operação de fluxo contínuo é instalado em uma instalação de produção de vacinas.

Lise ultrassônica e fragmentação de DNA antes da Reação de Cadeia de Polimerase (PCR)

Uma infecção por vírus macaco-varexo é detectada por testes de amplificação de ácido nucleico (NAAT), usando reação em cadeia de polimerase em tempo real ou convencional (PCR), para detecção de sequências únicas de DNA viral. A amostra (por exemplo, de troca de nasofaríngea ou biópsias de pele) contém o vírus em células.
Para análise, o vírus deve ser liberado das células ans o DNA viral deve ser fragmentado para PCR.

Lysis ultrassônica:

Ultrassonicator UP200Ht com microtipO S26d2 para lise ultrassônica de amostras biológicasA ruptura /lise celular ultrassônica é um método confiável e eficiente para isolar vírus de amostras de células e, assim, uma técnica preferível sobre agentes químicos, como lysozyme, proteinase K e diferentes detergentes que são usados alternativamente para alcançar a lise celular e a liberação do DNA.
No entanto, o uso desses reagentes químicos requer a preparação demorada da amostra em várias etapas antes da análise do PCR para evitar a inibição da reação pcr. Uma vez que os inibidores de PCR afetam a eficiência da amplificação, pequenas variações da quantidade de inibidores que não são removidos podem levar a grandes variações na amplificação do produto PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultrassonização para a lise é que a completa interrupção das estruturas celulares e a liberação de DNA sem a necessidade de reagentes e preparação demorada da amostra são desejáveis. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentação de DNA ultrassônico:

A fragmentação do DNA ultrassônico é simples e confiável, pois produz fragmentos de DNA tunable in length (pastas de base, bp). Usando ultrassom, o DNA pode ser efetivamente fragmentado para o comprimento do DNA alvo. Controle preciso sobre parâmetros ultrassônicos e opções sofisticadas de resfriamento impedem a degradação do DNA.
Leia mais sobre fragmentação de DNA ultrassônico!

 

O vídeo mostra o sistema de preparação de amostras ultrassônicas UIP400MTP, que permite a preparação confiável da amostra de qualquer placa multi-bem padrão usando ultrassom de alta intensidade. Aplicações típicas do UIP400MTP incluem lise celular, DNA, RNA e cromatina, bem como extração de proteínas.

Ultrassonicator UIP400MTP para sônica de placa multi-bem

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Aplicações ultrassônicas na vacina contra o vírus Monkeypox

A ultrassônica é usada para produzir vacinas como vacinas contra a varíola. Vacinas usadas contra o vírus macaco-varexi são atualmente vacinas contra vírus vivos. Vacinas recém-desenvolvidas podem usar outras plataformas, como a baseada em DNA Atualmente contém uma vaccinia ankara viurs modificada, um ortoxivírus atenuado e não replicante. Também contém Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina também pode conter pequenas quantidades de DNA e proteína das células fibroblastos de embrião de frango, que são usadas para cultivar o vírus da vacina, benzonase e compostos antibióticos como gentamicina e ciprofloxacina.

A homogeneização ultrassônica é usada na produção de vacinas contra vírus atenuadas ao vivo, vacinas de DNA, coquetéis de DNA multi-valentes, vacinas de mRNA, vacinas contra proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.

As aplicações de ultrassonônicos na produção de vacinas variam de

  • dispersão de partículas e agentes de vírus
  • emulsificação
  • inativação de vírus
  • formulação de portadores de drogas (NLC, SLN)
  • encapsulamento
  • dissolvendo agentes
  • preparação de adjuvantes
  • Desgassing / De-Aeração

 

Você pode encontrar informações mais aprofundadas sobre aplicações ultrassônicas para uma melhor fabricação de vacinas!

Protocolo para isolamento ultrassônico do vírus Monkeypox

A equipe de pesquisa de Stittelaar (2005) usou a lise ultrassônica para liberar o vírus macacopox da cultura celular hospedeira de crescimento, bem como de células obtidas através de trocas de garganta de primatas infectados.

Preparação da vacina Monkeypox:

Os vírus monkeypox foram cultivados em células fibroblastos de embrião de frango sem patógenos específicos. Após a incubação por 1 a 2 dias, a suspensão da célula do vírus foi colhida por uma rodada de congelamento e depois concentrada por centrifugação. A pelota foi resuspendida e submetida a várias rodadas de homogeneização ultrassônica.

Isolamento do vírus Monkeypox de macaques vacinados:

As amostras foram descongeladas três vezes e sônicas em um CupHorn ultrassônico. Duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro bovino fetal foram usadas para inocular monocamadas celulares Vero em placas de seis poços. Após 1h de incubação a 37°C, o inocula foi removido e substituído por meio de cultura suplementado com 1% de soro bovino fetal. As monocamadas foram cultivadas por 5 dias a 37°C e manchadas com uma solução violeta cristalina.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Neste vídeo mostramos um sistema ultrassônico de 2 kilowatts para operação inline em um gabinete purgável. A Hielscher fornece equipamentos ultrassônicos para quase todas as indústrias, como indústria química, farmacêutica, cosmética, processos petroquímicos, bem como para processos de extração à base de solventes. Este armário de aço inoxidável expurgável é projetado para operação em áreas perigosas. Para isso, o armário selado pode ser purgado pelo cliente com nitrogênio ou ar fresco para evitar que gases ou vapores inflamáveis entrem no armário.

Ultrassonicadores 2x 1000 Watts em Gabinete Purgável para Instalação em Áreas Perigosas

Ultrassonicadores para Análise de Vírus e Produção de Vacinas

O amplo portfólio de produtos hielscher ultrasonics oferece o ultrassonicador ideal para pesquisas e laboratórios analíticos, bem como para a fabricação de vacinas industriais.
A Hielscher Ultrasonics é especializada no projeto, fabricação e distribuição de ultrassononicadores de alto desempenho e ultrassom para uso em laboratórios de pesquisa e análise, bem como para implementação na produção de vacinas industriais (por exemplo. vacinas, Apis).
Controle preciso sobre os parâmetros do processo ultrassônico por Hielscher Ultrasonics' software inteligenteA sônica pode ser aplicada a embarcações abertas, reatores fechados e reatores contínuos de fluxo. Todas as partes dos sistemas ultrassônicos, que entram em contato com o meio líquido, são feitas de aço inoxidável, titânio ou vidro. Peças autoclaváveis e acessórios sanitários garantem a produção sob condições de grau farmacêutico.
Gravação automática de dados: O software inteligente registra os parâmetros do processo de sonicação automaticamente no cartão de memória SD integrado. O controle preciso de todos os parâmetros do processo assegura a reprodutibilidade, normalização da produção, e facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Os processadores ultrassônicos são altamente confiáveis e podem ser precisamente controlados. Todos os ultrassonicadores industriais podem ser ajustados para fornecer a gama completa de amplitudes mais baixas a muito altas. A robustez dos sistemas ultrassônicos da Hielscher permite a operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, sob serviço pesado e em ambientes exigentes.

A tabela abaixo dá-lhe uma indicação da capacidade de processamento aproximado de nossos ultrasonicators:

Volume batch Quociente de vazão Dispositivos Recomendados
placas multi-bem /microtiter n/a UIP400MTP
1 a 500mL 10 a 200 mL / min UP100H
10 a 2000 mL 20 a 400 mL / min UP200Ht, UP400St
0.1 a 20L 00,2 a 4 L / min UIP2000hdT
10 a 100L 2 de 10L / min UIP4000hdT
n/a 10 a 100L / min UIP16000
n/a maior aglomerado de UIP16000

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Homogeneizadores ultrassônicos são confiáveis para a cisalhamento de DNA

Ultra-sons ADN Shearing
Adaptado de Jkwchui sob CC-BY-SA.03



Literatura / Referências

  • Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
  • Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidovudine in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
  • J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
  • Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
  • Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.

Fatos, vale a pena conhecer

Vírus Monkeypox

Monkeypox (MPV, MPXV ou hMPXV) é uma espécie de vírus de DNA de dupla derivação, que causa uma doença zoonótica viral. Esta doença é conhecida como infecção por varíola de macacos e pode ocorrer em humanos e animais. Pertence ao gênero Ortoxixo na família Poxviridae. O vírus Monkeypox é um dos vírus ortoxixo humanos, juntamente com os vírus variola (VARV), cowpox (CPX) e vaccinia (VACV). Ortooxivírus são caracterizados por grandes partículas de vírus em forma de tijolo, contendo um genoma de DNA de dupla cadeia de aproximadamente 200.000 bp.

Ensaio ELISA

ELISA significa Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay e é um imunoensaio rotulado que é considerado o padrão ouro dos imunoensaios. ELISA é um teste imunológico, valorizado por sua alta sensibilidade diagnóstica, é usado para detectar e quantificar moléculas, incluindo anticorpos, antígenos, proteínas, glicoproteínas e hormônios. O princípio da ELISA baseia-se em uma interação antígeno-anticorpo. Por esta interação antígeno-anticorpo, os anticorpos específicos se ligam ao seu antígeno alvo. Somente quando a interação ocorre, o substrato pode se ligar à enzima e uma conversão subsequente de substrato pode ser observada, o que significa que um resultado positivo é obtido.


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