Aplicações ultrassônicas no vírus MonkeyPox
A ultrassonografia é um importante método de processamento para o isolamento do vírus da varíola dos macacos (MPXV) de amostras analíticas, para fragmentação do DNA do vírus, bem como na fabricação de vacinas contra a varíola dos macacos. Para a preparação da amostra antes do diagnóstico e análise (PCR, ELISA etc.), a ultrassonografia é usada para lisar as células, a fim de liberar o vírus da varíola dos macacos do interior da célula e? ou fragmentar o DNA. Na produção de vacinas, as aplicações vão desde a preparação de partículas virais/DNA, encapsulamento em carreadores de fármacos e formulação do inóculo.
Abaixo, você pode encontrar informações detalhadas sobre a preparação de amostras de amostras de vírus ultrassônicos do vírus da varíola dos macacos, bem como a produção de vacinas MPXV assistidas por ultrassom.
O que você encontrará nesta página:
- Lise ultrassônica para extração do vírus da varíola dos macacos
- Fragmentação ultrassônica do DNA do vírus da varíola dos macacos
- Aplicações ultrassônicas na produção de vacinas MPXV
Lise ultrassônica e fragmentação do DNA antes da reação em cadeia da polimerase (PCR)
Uma infecção pelo vírus da varíola dos macacos é detectada por teste de amplificação de ácido nucleico (NAAT), usando reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional ou em tempo real, para detecção de sequências únicas de DNA viral. A amostra (por exemplo, de troca nasofaríngea ou biópsias de pele) contém o vírus nas células.
Para análise, o vírus deve ser liberado das células e o DNA viral deve ser fragmentado para PCR.
Lise ultrassônica:
A ruptura? lise celular ultrassônica é um método confiável e eficiente para isolar vírus de amostras de células e, portanto, uma técnica preferível a agentes químicos, como lisozima, proteinase K e diferentes detergentes que são usados alternativamente para obter lise celular e liberação de DNA.
No entanto, o uso de tais reagentes químicos requer uma preparação demorada da amostra em várias etapas antes da análise de PCR para evitar a inibição da reação de PCR. Como os inibidores de PCR afetam a eficiência da amplificação, pequenas variações da quantidade de inibidores que não são removidos podem levar a grandes variações na amplificação do produto de PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultrassonografia para lise é que a ruptura completa das estruturas celulares e a liberação de DNA sem a necessidade de reagentes de lise e preparação demorada de amostras são desejáveis. (cf. Fykse et al., 2003)
Fragmentação ultrassônica do ADN:
A fragmentação ultrassônica do ADN é simples e segura, uma vez que produz fragmentos de ADN ajustáveis em comprimento (pares de bases, pb). Usando ultrassom, o DNA pode ser efetivamente fragmentado até o comprimento de DNA desejado. O controle preciso sobre os parâmetros ultrassônicos e as sofisticadas opções de resfriamento evitam a degradação do DNA.
Leia mais sobre fragmentação de DNA ultrassônica!
Aplicações ultrassônicas na vacina contra o vírus da varíola dos macacos
As vacinas usadas contra o vírus da varíola dos macacos são atualmente vacinas de vírus vivos. Vacinas recém-desenvolvidas podem usar outras plataformas, como baseadas em DNA O atualmente contém um Vaccinia Ankara viurs modificado, um orthopoxvirus atenuado e não replicante. Ele também contém Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina também pode conter pequenas quantidades de DNA e proteína das células de fibroblastos de embrião de galinha, que são usadas para cultivar o vírus da vacina, benzonase e compostos antibióticos, como gentamicina e ciprofloxacina.
A homogeneização ultrassônica é usada na produção de vacinas de vírus vivos atenuados, vacinas de DNA, coquetéis de DNA multivalentes, vacinas de mRNA, vacinas de proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.
- dispersão de partículas e agentes virais
- Emulsificação
- inativação de vírus
- formulação de carreador de medicamentos (NLC, SLN)
- encapsulação
- Dissolução de agentes
- Preparação de adjuvantes
- Desgaseificação? Desaeração
Protocolo para Isolamento Ultrassônico do Vírus da Varíola dos Macacos
A equipe de pesquisa de Stittelaar (2005) usou lise ultrassônica para liberar o vírus da varíola dos macacos da cultura de células hospedeiras em crescimento, bem como de células obtidas por meio de trocas de garganta de primatas infectados.
Preparação da vacina contra a varíola dos macacos:
Os vírus da varíola dos macacos foram cultivados em células de fibroblastos de embriões de galinha livres de patógenos específicos. Após incubação por 1 a 2 dias, a suspensão de células virais foi colhida por uma rodada de congelamento e descongelamento e depois concentrada por centrifugação. O pellet foi ressuspenso e submetido a várias rodadas de homogeneização ultrassônica.
Isolamento do vírus da varíola dos macacos vacinados:
As amostras foram congeladas e descongeladas três vezes e sonicadas em um CupHorn ultrassônico. Duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro fetal bovino foram utilizadas para inocular monocamadas de células Vero em placas de seis poços. Após 1 h de incubação a 37°C, os inóculos foram removidos e substituídos por meio de cultura suplementado com soro fetal bovino a 1%. As monocamadas foram cultivadas por 5 dias a 37°C e coradas com uma solução de cristal violeta.
(cf. Stittelaar et al., 2005)
Ultrassônicos para análise de vírus e produção de vacinas
O amplo portfólio de produtos da Hielscher Ultrasonics oferece o ultrassônico ideal para laboratórios de pesquisa e análise, bem como para a fabricação industrial de vacinas.
A Hielscher Ultrasonics é especializada na concepção, fabrico e distribuição de ultrassónicos e sono-biorreatores de alto desempenho para utilização em laboratórios de investigação e analíticos, bem como para implementação na produção industrial de vacinas (p. ex. Vacinas, Apis).
A sonicação pode ser aplicada a vasos abertos, reatores fechados continuamente agitados e reatores de fluxo contínuo. Todas as partes dos sistemas ultrassônicos, que entram em contato com o meio líquido, são feitas de aço inoxidável, titânio ou vidro. Peças autoclaváveis e acessórios sanitários garantem a produção sob condições de grau farmacêutico.
Gravação automática de dados: O software inteligente registra os parâmetros do processo de sonicação automaticamente no cartão de memória SD integrado. O controle preciso de todos os parâmetros do processo garante o Reprodutibilidade, Normalização da produçãoe facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Os processadores ultra-sônicos são altamente confiáveis e podem ser controlados com precisão. Todos os ultrasonicators industriais podem ser ajustados para oferecer uma gama completa de amplitudes mais baixas a muito altas. A robustez dos sistemas ultrassônicos da Hielscher permite a operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, em serviços pesados e em ambientes exigentes.
A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassônicos:
Volume do lote | Vazão | Dispositivos recomendados |
---|---|---|
placas de microtitulação? multipoços | n/a | UIP400MTP |
1 a 500mL | 10 a 200mL/min | UP100H |
10 a 2000mL | 20 a 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
0.1 a 20L | 0.2 a 4L/min | UIP2000hdT |
10 a 100L | 2 a 10L/min | UIP4000hdT |
n/a | 10 a 100L/min | UIP16000 |
n/a | maior | cluster de UIP16000 |
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Literatura? Referências
- Stittelaar, Koert; Amerongen, Geert; Kondova, Ivanela; Kuiken, Thijs; Lavieren, Rob; Pistoor, Frank; Niesters, Hubert; Doornum, Gerard; Van der Zeijst, Bernard; Mateo, Luis; Chaplin, Paul; Osterhaus, Albert (2005): Modified Vaccinia Virus Ankara Protects Macaques against Respiratory Challenge with Monkeypox Virus. Journal of Virology 79, 2005. 7845-51.
- Shah Purvin, Parameswara Rao Vuddanda, Sanjay Kumar Singh, Achint Jain, and Sanjay Singh (2014): Pharmacokinetic and Tissue Distribution Study of Solid Lipid Nanoparticles of Zidov in Rats. Journal of Nanotechnology, Volume 2014.
- J. Robin Harris, Andrei Soliakova, Richard J. Lewis, Frank Depoix, Allan Watkinson, Jeremy H. Lakeya (2012): Alhydrogel® adjuvant, ultrasonic dispersion and protein binding: a TEM and analytical study. Micron Volume 43, Issues 2–3, February 2012, 192-200.
- Doron Melamed, Gabriel Leitner, E. Dan Heller (1991): A Vaccine against Avian Colibacillosis Based on Ultrasonic Inactivation of Escherichia coli. Avian Diseases Vol. 35, No. 1 (Jan. – Mar., 1991), 17-22.
- Huang C-F, Wu T-C, Wu C-C, Lee C-C, Lo W-T, Hwang K-S, Hsu M-L, Peng H-J. (2011): Sublingual vaccination with sonicated Salmonella proteins and mucosal adjuvant induces mucosal and systemic immunity and protects mice from lethal enteritis. APMIS 119, 2011. 468–78.
Fatos, vale a pena conhecer
vírus da varíola dos macacos
A varíola dos macacos (MPV, MPXV ou hMPXV) é uma espécie de vírus de DNA de fita dupla, que causa uma doença zoonótica viral. Esta doença é conhecida como infecção por varíola dos macacos e pode ocorrer em humanos e animais. Pertence ao gênero Orthopoxvirus da família Poxviridae. O vírus da varíola dos macacos é um dos orthopoxvírus humanos, juntamente com os vírus da varíola (VARV), varíola bovina (CPX) e vaccinia (VACV). Os orthopoxvirus são caracterizados por grandes partículas virais em forma de tijolo, contendo um genoma de DNA de fita dupla de aproximadamente 200.000 pb.
Ensaio ELISA
ELISA significa Ensaio de Imunoabsorção Enzimática e é um imunoensaio marcado que é considerado o padrão-ouro dos imunoensaios. O ELISA é um teste imunológico, valorizado por sua alta sensibilidade diagnóstica, é usado para detectar e quantificar moléculas, incluindo anticorpos, antígenos, proteínas, glicoproteínas e hormônios. O princípio do ELISA é baseado em uma interação antígeno-anticorpo. Por essa interação antígeno-anticorpo, os anticorpos específicos se ligam ao antígeno alvo. Somente quando a interação ocorre, o substrato pode se ligar à enzima e uma subsequente conversão de substrato pode ser observada, o que significa que um resultado positivo é obtido.

A Hielscher Ultrasonics fabrica homogeneizadores ultrassônicos de alto desempenho de labrador Para tamanho industrial.