Aplicações ultrassónicas no vírus da varíola dos macacos

A ultrassonicação é um método de processamento importante para o isolamento do vírus da varíola dos macacos (MPXV) a partir de amostras para análise, para a fragmentação do ADN viral, bem como para o fabrico de vacinas contra a varíola dos macacos. Na preparação de amostras antes do diagnóstico e da análise (PCR, ELISA, etc.), a ultrassonicação é utilizada para lisar as células, a fim de libertar o vírus da varíola dos macacos do interior celular e / ou fragmentar o ADN. Na produção de vacinas, as aplicações abrangem a preparação de partículas virais / ADN, o encapsulamento em veículos de fármacos e a formulação dos inóculos.
Abaixo encontrará informações detalhadas sobre a preparação ultrassónica de amostras do vírus da varíola dos macacos, bem como sobre a produção de vacinas contra o MPXV assistida por ultrassons.

O que encontrará nesta página:

• Lise ultrassónica para a extração do vírus da varíola dos macacos
• Fragmentação ultrassónica do ADN do vírus da varíola dos macacos
• Aplicações ultrassónicas na produção de vacinas contra o MPXV

Lise ultrassónica e fragmentação do ADN antes da reação em cadeia da polimerase (PCR)

Uma infeção pelo vírus da varíola dos macacos é detetada através de testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT), utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real ou convencional para detetar sequências únicas do ADN viral. A amostra (por exemplo, obtida por zaragatoa nasofaríngea ou por biópsias cutâneas) contém o vírus no interior das células.
Para a análise, o vírus tem de ser libertado das células e o ADN viral tem de ser fragmentado para a PCR.

Lise ultrassónica:

A rutura celular / lise ultrassónica é um método fiável e eficiente para isolar vírus a partir de amostras celulares, sendo, por isso, uma técnica preferível à utilização de agentes químicos, como a lisozima, a proteinase K e diferentes detergentes, que são utilizados como alternativa para conseguir a lise celular e a libertação do ADN.
No entanto, a utilização destes reagentes químicos exige uma preparação de amostras demorada, em várias etapas, antes da análise por PCR, para evitar a inibição da reação de PCR. Como os inibidores da PCR afetam a eficiência da amplificação, pequenas variações na quantidade de inibidores que não são removidos podem provocar grandes variações na amplificação do produto da PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultrassonicação para a lise é que a rutura completa das estruturas celulares e a libertação do ADN, sem necessidade de reagentes de lise nem de uma preparação de amostras demorada, são desejáveis. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentação ultrassónica do ADN:

A fragmentação ultrassónica do ADN é simples e fiável, pois produz fragmentos de ADN com comprimento ajustável (pares de bases, bp). Utilizando ultrassons, o ADN pode ser fragmentado eficazmente até ao comprimento pretendido. O controlo preciso dos parâmetros ultrassónicos e as opções sofisticadas de arrefecimento evitam a degradação do ADN.
Saiba mais sobre a fragmentação ultrassónica do ADN!

Aplicações ultrassónicas na vacina contra o vírus da varíola dos macacos

As vacinas utilizadas contra o vírus da varíola dos macacos são atualmente vacinas de vírus vivos. As vacinas recentemente desenvolvidas poderão utilizar outras plataformas, como as baseadas em ADN… Atualmente contém um vírus Vaccinia Ankara modificado, um ortopoxvírus atenuado e não replicante. Contém também Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina pode também conter pequenas quantidades de ADN e proteínas das células de fibroblastos de embrião de galinha, que são utilizadas para cultivar o vírus vacinal, benzonase e compostos antibióticos, como a gentamicina e a ciprofloxacina.

A homogeneização ultrassónica é utilizada na produção de vacinas de vírus vivos atenuados, vacinas de ADN, misturas multivalentes de ADN, vacinas de ARNm, vacinas de proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.

Pode encontrar informações mais aprofundadas sobre as aplicações ultrassónicas para melhorar o fabrico de vacinas!

Protocolo para o isolamento ultrassónico do vírus da varíola dos macacos

A equipa de investigação de Stittelaar (2005) utilizou a lise ultrassónica para libertar o vírus da varíola dos macacos da cultura de células hospedeiras utilizada para o seu crescimento, bem como de células obtidas por zaragatoas da garganta de primatas infetados.

Preparação da vacina contra a varíola dos macacos:

Os vírus da varíola dos macacos foram cultivados em células de fibroblastos de embrião de galinha isentas de agentes patogénicos específicos. Após uma incubação de 1 a 2 dias, a suspensão de vírus e células foi recolhida mediante um ciclo de congelação e descongelação e, em seguida, concentrada por centrifugação. O sedimento foi ressuspenso e submetido a vários ciclos de homogeneização ultrassónica.

Isolamento do vírus da varíola dos macacos de macacos vacinados:

As amostras foram congeladas e descongeladas três vezes e sonicadas num CupHorn ultrassónico. Foram utilizadas duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro fetal bovino para inocular monocamadas de células Vero em placas de seis poços. Após 1 h de incubação a 37°C, os inóculos foram removidos e substituídos por meio de cultura suplementado com 1% de soro fetal bovino. As monocamadas foram cultivadas durante 5 dias a 37°C e coradas com uma solução de violeta de cristal.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Sonicadores para análise de vírus e produção de vacinas

A vasta gama de produtos da Hielscher Ultrasonics oferece o sonicador ideal para laboratórios de investigação e análise, bem como para o fabrico industrial de vacinas.
A Hielscher Ultrasonics é especializada na conceção, no fabrico e na distribuição de sonicadores de elevado desempenho e de sonobiorreatores para utilização em laboratórios de investigação e análise, bem como para integração na produção industrial de vacinas (por exemplo, vacinas, ingredientes farmacêuticos ativos).
A sonicação pode ser aplicada em recipientes abertos, reatores fechados com agitação contínua e reatores de fluxo contínuo. Todas as peças dos sistemas ultrassónicos que entram em contacto com o meio líquido são fabricadas em aço inoxidável, titânio ou vidro. As peças autoclaváveis e as conexões sanitárias asseguram a produção em condições de qualidade farmacêutica.
Registo automático de dados: O software inteligente regista automaticamente os parâmetros do processo de sonicação no cartão de memória SD integrado. O controlo preciso de todos os parâmetros do processo assegura a reprodutibilidade, normalização da produção, e facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Os processadores ultrassónicos da Hielscher Ultrasonics são altamente fiáveis e podem ser controlados com precisão. Todos os sonicadores industriais podem ser ajustados para fornecer toda a gama de amplitudes, desde amplitudes mais baixas até amplitudes muito elevadas. A robustez dos sistemas ultrassónicos da Hielscher permite o funcionamento 24/7 em condições de trabalho intensivo e em ambientes exigentes.

A tabela abaixo dá uma indicação da capacidade aproximada de processamento dos nossos sonicadores: