Aplicações ultrassônicas no vírus MonkeyPox

A ultrassonografia é um importante método de processamento para o isolamento do vírus da varíola dos macacos (MPXV) de amostras analíticas, para fragmentação do DNA do vírus, bem como na fabricação de vacinas contra a varíola dos macacos. Para a preparação da amostra antes do diagnóstico e análise (PCR, ELISA etc.), a ultrassonografia é usada para lisar as células, a fim de liberar o vírus da varíola dos macacos do interior da célula e? ou fragmentar o DNA. Na produção de vacinas, as aplicações vão desde a preparação de partículas virais/DNA, encapsulamento em carreadores de fármacos e formulação do inóculo.
Abaixo, você pode encontrar informações detalhadas sobre a preparação de amostras de amostras de vírus ultrassônicos do vírus da varíola dos macacos, bem como a produção de vacinas MPXV assistidas por ultrassom.

O que você encontrará nesta página:

• Lise ultrassônica para extração do vírus da varíola dos macacos
• Fragmentação ultrassônica do DNA do vírus da varíola dos macacos
• Aplicações ultrassônicas na produção de vacinas MPXV

Lise ultrassônica e fragmentação do DNA antes da reação em cadeia da polimerase (PCR)

Uma infecção pelo vírus da varíola dos macacos é detectada por teste de amplificação de ácido nucleico (NAAT), usando reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional ou em tempo real, para detecção de sequências únicas de DNA viral. A amostra (por exemplo, de troca nasofaríngea ou biópsias de pele) contém o vírus nas células.
Para análise, o vírus deve ser liberado das células e o DNA viral deve ser fragmentado para PCR.

Lise ultrassônica:

A ruptura? lise celular ultrassônica é um método confiável e eficiente para isolar vírus de amostras de células e, portanto, uma técnica preferível a agentes químicos, como lisozima, proteinase K e diferentes detergentes que são usados alternativamente para obter lise celular e liberação de DNA.
No entanto, o uso de tais reagentes químicos requer uma preparação demorada da amostra em várias etapas antes da análise de PCR para evitar a inibição da reação de PCR. Como os inibidores de PCR afetam a eficiência da amplificação, pequenas variações da quantidade de inibidores que não são removidos podem levar a grandes variações na amplificação do produto de PCR (Diaco, 1995).
A vantagem da ultrassonografia para lise é que a ruptura completa das estruturas celulares e a liberação de DNA sem a necessidade de reagentes de lise e preparação demorada de amostras são desejáveis. (cf. Fykse et al., 2003)

Fragmentação ultrassônica do ADN:

A fragmentação ultrassônica do ADN é simples e segura, uma vez que produz fragmentos de ADN ajustáveis em comprimento (pares de bases, pb). Usando ultrassom, o DNA pode ser efetivamente fragmentado até o comprimento de DNA desejado. O controle preciso sobre os parâmetros ultrassônicos e as sofisticadas opções de resfriamento evitam a degradação do DNA.
Leia mais sobre fragmentação de DNA ultrassônica!

Aplicações ultrassônicas na vacina contra o vírus da varíola dos macacos

As vacinas usadas contra o vírus da varíola dos macacos são atualmente vacinas de vírus vivos. Vacinas recém-desenvolvidas podem usar outras plataformas, como baseadas em DNA O atualmente contém um Vaccinia Ankara viurs modificado, um orthopoxvirus atenuado e não replicante. Ele também contém Tris (tris-aminometano) e cloreto de sódio. A vacina também pode conter pequenas quantidades de DNA e proteína das células de fibroblastos de embrião de galinha, que são usadas para cultivar o vírus da vacina, benzonase e compostos antibióticos, como gentamicina e ciprofloxacina.

A homogeneização ultrassônica é usada na produção de vacinas de vírus vivos atenuados, vacinas de DNA, coquetéis de DNA multivalentes, vacinas de mRNA, vacinas de proteínas recombinantes, vacinas de partículas semelhantes a vírus, etc.

Você pode encontrar informações mais detalhadas sobre aplicações ultrassônicas para melhorar a fabricação de vacinas!

Protocolo para Isolamento Ultrassônico do Vírus da Varíola dos Macacos

A equipe de pesquisa de Stittelaar (2005) usou lise ultrassônica para liberar o vírus da varíola dos macacos da cultura de células hospedeiras em crescimento, bem como de células obtidas por meio de trocas de garganta de primatas infectados.

Preparação da vacina contra a varíola dos macacos:

Os vírus da varíola dos macacos foram cultivados em células de fibroblastos de embriões de galinha livres de patógenos específicos. Após incubação por 1 a 2 dias, a suspensão de células virais foi colhida por uma rodada de congelamento e descongelamento e depois concentrada por centrifugação. O pellet foi ressuspenso e submetido a várias rodadas de homogeneização ultrassônica.

Isolamento do vírus da varíola dos macacos vacinados:

As amostras foram congeladas e descongeladas três vezes e sonicadas em um CupHorn ultrassônico. Duas diluições (1:10 e 1:100) em meio de transporte suplementado com 1% de soro fetal bovino foram utilizadas para inocular monocamadas de células Vero em placas de seis poços. Após 1 h de incubação a 37°C, os inóculos foram removidos e substituídos por meio de cultura suplementado com soro fetal bovino a 1%. As monocamadas foram cultivadas por 5 dias a 37°C e coradas com uma solução de cristal violeta.
(cf. Stittelaar et al., 2005)

Ultrassônicos para análise de vírus e produção de vacinas

O amplo portfólio de produtos da Hielscher Ultrasonics oferece o ultrassônico ideal para laboratórios de pesquisa e análise, bem como para a fabricação industrial de vacinas.
A Hielscher Ultrasonics é especializada na concepção, fabrico e distribuição de ultrassónicos e sono-biorreatores de alto desempenho para utilização em laboratórios de investigação e analíticos, bem como para implementação na produção industrial de vacinas (p. ex. Vacinas, Apis).
A sonicação pode ser aplicada a vasos abertos, reatores fechados continuamente agitados e reatores de fluxo contínuo. Todas as partes dos sistemas ultrassônicos, que entram em contato com o meio líquido, são feitas de aço inoxidável, titânio ou vidro. Peças autoclaváveis e acessórios sanitários garantem a produção sob condições de grau farmacêutico.
Gravação automática de dados: O software inteligente registra os parâmetros do processo de sonicação automaticamente no cartão de memória SD integrado. O controle preciso de todos os parâmetros do processo garante o Reprodutibilidade, Normalização da produçãoe facilita o cumprimento das normas de segurança dos produtos farmacêuticos.
Hielscher Ultrasonics’ Os processadores ultra-sônicos são altamente confiáveis e podem ser controlados com precisão. Todos os ultrasonicators industriais podem ser ajustados para oferecer uma gama completa de amplitudes mais baixas a muito altas. A robustez dos sistemas ultrassônicos da Hielscher permite a operação 24 horas por dia, 7 dias por semana, em serviços pesados e em ambientes exigentes.

A tabela abaixo fornece uma indicação da capacidade aproximada de processamento de nossos ultrassônicos: