Niosomy to nanocząsteczki, które mogą być stosowane jako nośnik leków (np. leków onkologicznych) i innych substancji bioaktywnych. Emulsyfikacja ultradźwiękowa jest prostą i szybką metodą formowania małych niosomów o dużym ładunku leku.

Przygotowanie niosomu

niosom jest niejonowym pęcherzykiem powierzchniowo czynnym, tworzonym głównie przez niejonowy środek powierzchniowo czynny i włączenie cholesterolu jako rozczynnika. Niosomy są bardziej stabilne przeciwko degradacji chemicznej lub utlenianiu i mają długi czas przechowywania w porównaniu z liposomami. Ze względu na środki powierzchniowo czynne stosowane do przygotowania niosomów, są one biodegradowalne, biokompatybilne i nieimmunogenne. Niosomy są osmotycznie aktywne, chemicznie stabilne i oferują dłuższy czas przechowywania w porównaniu do liposomów. W zależności od wielkości i stopnia zmatowienia dostępne są różne metody przygotowania, takie jak sonizacja, odparowywanie w odwrotnej fazie, nawilżanie cienkowarstwowe lub trans-membranowy gradient pH procesu absorpcji leków. Ultradźwiękowy preparat niosomowy jest preferowaną techniką do produkcji pęcherzyków jednokomórkowych, które są małe i jednolite pod względem wielkości.

Preparat do niosomów ultradźwiękowych

W celu utworzenia niosomów należy przygotować emulsję typu olej w wodzie (o/w) z organicznego roztworu środka powierzchniowo czynnego, cholesterolu oraz wodnego roztworu zawierającego związek bioaktywny, tj. lek. Emulsyfikacja ultradźwiękowa jest doskonałą techniką mieszania niemieszających się cieczy, takich jak olej i woda. Poprzez ścinanie kropel obu faz i rozbijanie ich na nanocząsteczki uzyskuje się nano-emulsję. Następnie rozpuszczalnik organiczny jest odparowywany, w wyniku czego niosomy są obciążone środkami leczniczymi, które są rozproszone w fazie wodnej. W porównaniu do mieszania mechanicznego, technika ultradźwiękowego formowania niosomów wyróżnia się poprzez formowanie niosomów o mniejszym średnim wymiarze i niższym indeksie polidyspersyjności w szybkim procesie. Zastosowanie mniejszych pęcherzyków jest generalnie preferowane, biorąc pod uwagę, że mają one tendencję do unikania mechanizmów oczyszczania ciała lepiej niż większe cząsteczki i pozostają przez dłuższy czas w krwiobiegu. (por. Bragagni i in. 2014)

Protokoły przygotowania niosomów ultradźwiękowych

N-palmitoil Glucosamine niosomes (Glu) napełniony doksorubicyną, lekiem przeciwnowotworowym, przygotowano poprzez wstrząsanie mieszaniną NPG (16 mg), Span 60 (65 mg), cholesterolu (58 mg) i Solulan C24 (54 mg) w roztworze doksorubicyny (1,5 mg/ml, 2 ml, przygotowanym w PBS) w temperaturze 90°C przez 1 h, a następnie sondę przez 10 min (75% maks.).
Pęcherzyki glikolu palmitynianowego chitozanu (GCP) przygotowano w sposób opisany wcześniej (11) poprzez sondę soniującą glikol chitozan (10 mg) i cholesterol (4 mg) w roztworze doksorubicyny (1,5 mg/ml). (Dufes i in. 2004)

Alternatywne metody przygotowywania niosomów

Alternatywne metody recepturowania niosomów, takie jak technika odparowania odwrotnej fazy lub proces absorpcji leków w trans-membranowym gradiencie pH, wymagają zastosowania energii ultradźwiękowej. Obie techniki wykorzystywane są głównie do tworzenia pęcherzyków wielopęcherzykowych (MLV). Poniżej znajduje się krótki opis obu technik i kroku sonicznego, który jest z nimi związany.

Sygnalizacja w preparacie niosomowym poprzez odwrotne odparowanie fazowe

W metodzie odwróconego odparowania fazowego (REV) składniki preparatu niosomalnego są rozpuszczane w mieszaninie eteru i chloroformu i dodawane do fazy wodnej, która zawiera lek. Emulgowanie ultradźwiękowe stosuje się w celu przekształcenia mieszaniny w emulsję o drobnych rozmiarach. Następnie faza organiczna jest odparowywana. Otrzymany podczas odparowania rozpuszczalnika organicznego niosom to pęcherzyki jednokomórkowe o dużych rozmiarach.

Trans-membranowy gradient pH proces absorpcji leków

W trans-membranowym gradiencie pH (wewnątrz kwaśnego) procesu absorpcji leków (przy zdalnym załadunku), środek powierzchniowo czynny i cholesterol są rozpuszczane w chloroformie. Rozpuszczalnik jest następnie odparowywany w próżni, aby uzyskać cienką warstwę na ścianie kolby okrągłodennej. Folia jest nawilżana 300 mM kwasem cytrynowym (pH 4,0) przez wirowanie zawiesiny. Wielokomórkowe pęcherzyki są zamrażane i rozmrażane trzykrotnie, a następnie sonikowane za pomocą sondy ultrasonograficznej. Do tej zawiesiny niosomalnej dodaje się wodny roztwór zawierający 10 mg/ml leku i wiruje. Następnie pH próbki jest podnoszone do pH 7,0-7,2 za pomocą 1M fosforanu disodowego. Następnie mieszanina jest podgrzewana do temperatury 60°C przez 10 minut. Technika ta prowadzi do powstania pęcherzyków wielowarstwowych. (por. Kazi i in. 2010)

Ultradźwiękowa redukcja wielkości niosomów

Niosomy zwykle mieszczą się w zakresie wielkości od 10nm do 1000nm. W zależności od techniki preparacji, niosomy są często stosunkowo dużych rozmiarów i mają tendencję do tworzenia agregatów. Jednakże, specyficzne rozmiary niosomów są ważnym czynnikiem, jeśli chodzi o docelowy typ systemu podawania. Na przykład bardzo mały rozmiar niosomu w zakresie nanometrów jest najbardziej odpowiedni do ogólnoustrojowego podawania leków, gdzie lek musi być podawany przez błony komórkowe, aby dotrzeć do docelowego miejsca w komórce, podczas gdy większe niosomy są zalecane do podawania domięśniowego i wewnątrzkomorowego lub do zastosowań okulistycznych. Ultrasonograficzna redukcja wielkości niosomów jest częstym etapem w przygotowywaniu bardzo silnych niosomów. Ultradźwiękowe siły ścinające powodują dezaglomerację i rozproszenie niosomów na mono-dyspergowane nano-niosomy.

Protokół – Ultradźwiękowa redukcja rozmiaru lipoNiosomów

Naderinezhad i wsp. (2017) opracowali biokompatybilne lipoNiosomy (połączenie niosomu i liposomu) zawierające Tween 60: cholesterol: DPPC (w 55 : 30 : 15 : 3) z 3% DSPE-mPEG. Aby zmniejszyć wielkość przygotowanych LipoNiosomów, po uwodnieniu sonikowały one zawiesinę przez 45 min (15 s włączona i 10 s wyłączona, amplituda 70% przy 100 watach), aby zminimalizować agregację cząstek przy użyciu homogenizatora ultradźwiękowego UP200St (Hielscher Ultrasonics GmbH, Niemcy). W metodzie gradientu pH, wysuszone warstwy CUR, środków powierzchniowo czynnych i lipidów były nawilżane 1300 mL siarczanu amonu (pH 1⁄4 4) w 63 C przez 47 min. Następnie nanocząsteczki były sonikowane nad kąpielą lodową w celu wytworzenia małych pęcherzyków.

Ultrasonografy do preparacji niosomów

Firma Hielscher Ultrasonic posiada wieloletnie doświadczenie w projektowaniu, produkcji, dystrybucji i serwisie wysokowydajnych homogenizatorów ultradźwiękowych dla przemysłu farmaceutycznego, spożywczego i kosmetycznego.
Przygotowywanie wysokiej jakości niosomów, liposomów, stałych nanocząsteczek lipidowych, nanocząsteczek polimerowych, kompleksów cyklodekstrynowych i innych nanostrukturalnych nośników leków to procesy, w których ultradźwiękowe systemy Hielscher wyróżniają się wysoką niezawodnością, stałą mocą wyjściową i precyzyjną sterowalnością. Ultradźwięki firmy Hielscher pozwalają na precyzyjną kontrolę nad wszystkimi parametrami procesu, takimi jak amplituda, temperatura, ciśnienie i energia sonacji. Inteligentne oprogramowanie automatycznie protokołuje wszystkie parametry sonacji (czas, datę, amplitudę, energię netto, energię całkowitą, temperaturę, ciśnienie) na wbudowanej karcie SD.
Odporność urządzenia ultradźwiękowe Hielscher pozwala do pracy 24/7 w ciężkich i środowisk wymagających.
Poniższa tabela daje wskazanie przybliżonej mocy przerobowych naszych ultrasonicators: