Usprawnij analizę HPLC dzięki niezawodnemu przygotowaniu próbek
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) pozostaje jedną z najważniejszych technik analitycznych służących do identyfikacji i ilościowego oznaczania związków w złożonych matrycach. Od kontroli jakości produktów farmaceutycznych po monitorowanie środowiska i analizę żywności, metody HPLC są cenione za czułość, selektywność i odtwarzalność. Jednak wiarygodność danych chromatograficznych w dużej mierze zależy od jednego kluczowego etapu: przygotowania próbek do HPLC.
Badania i rutynowe procedury przygotowania próbek pokazują, że ekstrakcja i przygotowanie próbek wspomagane sonikacją znacząco poprawiają wydajność, dokładność i szybkość analizy HPLC. Wykorzystując energię ultradźwiękową do rozbijania matryc i zwiększania przenoszenia analitów do rozpuszczalników, laboratoria mogą uzyskiwać wyższe odzyski, krótsze czasy ekstrakcji i bardziej odtwarzalne wyniki analityczne.
Dlaczego przygotowanie próbek ma znaczenie w HPLC
W wielu procedurach analitycznych matryca próbki – taka jak materiał roślinny, tkanka biologiczna, gleba lub woda – zawiera złożone mieszaniny związków, które mogą zakłócać rozdzielanie chromatograficzne. Skuteczne przygotowanie próbek jest zatem konieczne, aby wyizolować anality, usunąć substancje zakłócające i zatężyć związki docelowe przed wprowadzeniem próbki do układu HPLC.
Tradycyjne techniki ekstrakcji często obejmują długotrwałe procedury, duże objętości rozpuszczalników organicznych i wiele etapów oczyszczania. Metody te mogą wprowadzać zmienność, zwiększać koszty operacyjne i wydłużać całkowity czas analizy.
Ultradźwiękowe przygotowanie próbek stanowi skuteczną alternatywę. Sonikacja wprowadza do ośrodka ciekłego energię akustyczną o wysokiej częstotliwości, wytwarzając mikroskopijne pęcherzyki kawitacyjne. Gdy pęcherzyki te zapadają się, generują lokalne siły ścinające i efekty mikromieszania, które rozbijają stałe matryce i przyspieszają transport masy. Proces ten radykalnie zwiększa wydajność ekstrakcji.
Sonikator UIP400MTP o wysokiej wydajności przetwarzania próbek ze statywem na fiolki do autosamplera
Dowody naukowe: sonikacja poprawia parametry analityczne
Kilka recenzowanych badań wykazało zalety ekstrakcji ultradźwiękowej w procedurach HPLC.
Na przykład w metodzie opracowanej do monitorowania pozostałości pestycydów w próbkach wody wykorzystano sonikację w połączeniu z analizą LC–MS/MS do oznaczania stężeń pestycydu karbarylu. W tym podejściu próbki wody poddawano ekstrakcji acetonitrylem przy działaniu ultradźwięków przed analizą chromatograficzną. Metoda osiągnęła bardzo dobre parametry analityczne, w tym odzyski od 89,53% do 101,72%, potwierdzając dokładność i niezawodność procedury ultradźwiękowego przygotowania próbek.
Etap ekstrakcji ultradźwiękowej umożliwił skuteczne przenoszenie analitów z matrycy wodnej do rozpuszczalnika organicznego, zmniejszając zużycie rozpuszczalników i eliminując potrzebę stosowania rozbudowanych procedur oczyszczania. Zwalidowana metoda analityczna wykazała doskonałą liniowość, precyzję i granice oznaczalności, podkreślając skuteczność sonikacji w nowoczesnych procedurach chromatograficznych. (por. Roudani et al., 2018)
W innym badaniu wprowadzono wspomaganą ultradźwiękami dyspersję matrycy w fazie stałej (UA-MSPD) do oznaczania oleuropeiny w liściach oliwnych za pomocą analizy HPLC. W tej technice sproszkowany materiał roślinny mieszano z sorbentem, a następnie poddawano działaniu fal ultradźwiękowych podczas etapu elucji. Ultradźwięki zwiększały desorpcję analitu z powierzchni sorbentu, jednocześnie poprawiając ekstrakcję z matrycy próbki. (por. Rashidipour i Heydari, 2018)
Zoptymalizowana procedura ultradźwiękowa przyniosła znaczną poprawę parametrów analitycznych, w tym:
- Liniowe krzywe kalibracyjne z R² = 0,9979
- Granice wykrywalności wynoszące zaledwie 0,03 µg mL⁻¹
- Odzyski od 90,2% do 96,7%
Wyniki te potwierdzają, że ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami nie tylko przyspiesza przygotowanie próbek, lecz także zwiększa wydajność ekstrakcji w porównaniu z klasycznymi technikami dyspersji matrycy w fazie stałej.
Sonikator z sondą UP200St do przygotowania próbek do HPLC
Główne zalety ultradźwiękowego przygotowania próbek do HPLC
Rosnące wykorzystanie ekstrakcji ultradźwiękowej w laboratoriach analitycznych wynika z kilku wymiernych korzyści.
- Wyższa wydajność ekstrakcji
Kawitacja akustyczna rozbija stałe matryce i poprawia penetrację rozpuszczalnika. Zwiększa to uwalnianie analitów i ich odzysk, szczególnie w przypadku związków występujących w ilościach śladowych w złożonych próbkach. - Krótszy czas przygotowania próbek
Ekstrakcja ultradźwiękowa często pozwala zakończyć przygotowanie próbek w ciągu sekund lub minut. Na przykład zoptymalizowane parametry ekstrakcji ultradźwiękowej w UA-MSPD umożliwiły skuteczny odzysk analitów po około 30 sekundach sonikacji, pokazując, jak znacząco można przyspieszyć procedury analityczne. - Mniejsze zużycie rozpuszczalników
Ponieważ ultradźwięki intensyfikują transport masy, zazwyczaj wymagane są mniejsze objętości rozpuszczalników. Ograniczenie ich zużycia zwiększa zrównoważenie środowiskowe działalności laboratorium i obniża koszty operacyjne. - Lepsza odtwarzalność
Równomierny rozkład energii ultradźwiękowej zapewnia jednakowe rozbijanie i ekstrakcję próbek w powtórzeniach, co prowadzi do lepszej precyzji pomiarów analitycznych. - Zgodność z nowoczesnymi metodami chromatograficznymi
Ekstrakcję ultradźwiękową można łatwo zintegrować z systemami HPLC, UHPLC i LC-MS, dzięki czemu nadaje się do zastosowań analitycznych wymagających wysokiej wydajności przetwarzania próbek.
Chromatogram HPLC związków fenolowych z ekstraktu z liści Annona muricata uzyskanego metodą ultradźwiękową przy użyciu sonikatora UP400S.
(Badanie i grafika: ©Nolasco-González et al., 2022)
Praktyczne rozwiązania do sonikacji w przygotowaniu próbek do HPLC
Laboratoriom wdrażającym ekstrakcję ultradźwiękową sonikatory Hielscher zapewniają precyzyjną kontrolę parametrów takich jak amplituda, czas i tryb impulsowy. Dlatego sonikatory laboratoryjne Hielscher są szczególnie odpowiednie dla laboratoriów analitycznych.
Wybierz sonikator laboratoryjny najlepiej dopasowany do Twoich próbek do HPLC
| Model sonikatora | Zalety w HPLC | Najlepsze zastosowania w przygotowaniu próbek do HPLC |
| Sonikator wieloprobówkowy VialTweeter |
• Jednoczesna sonikacja do 10 szczelnie zamkniętych fiolek przy jednakowej energii ultradźwiękowej • Sterylność: brak zanieczyszczenia krzyżowego, ponieważ próbki pozostają zamknięte • Wysoce odtwarzalne warunki ekstrakcji w kolejnych seriach • Skuteczna kawitacja dla próbek analitycznych o małej objętości |
• Przygotowanie próbek środowiskowych, żywnościowych lub farmaceutycznych z wysoką wydajnością przetwarzania próbek • Ekstrakcja analitów śladowych przed analizą HPLC, UHPLC lub LC-MS • Znormalizowane procedury wymagające jednakowego traktowania wielu próbek |
| Sonikator do mikropłytek UIP400MTP |
• Bezkontaktowa sonikacja całych mikropłytek (formaty 96-dołkowe i 384-dołkowe) • Równomierny rozkład energii ultradźwiękowej we wszystkich dołkach • Umożliwia automatyzację i integrację z robotami w procedurach analitycznych • Wysoka wydajność przetwarzania próbek z precyzyjną kontrolą amplitudy i czasu sonikacji |
• Procedury badań przesiewowych UHPLC o wysokiej wydajności przetwarzania próbek • Biblioteki związków farmaceutycznych i przygotowanie próbek do metabolomiki • Ekstrakcja na płytkach w ciągach procedur analitycznych LC-MS lub UHPLC |
| Sonikatory laboratoryjne z mikrosonotrodą (sonikacja bezpośrednia) |
• Maksymalna intensywność ultradźwięków zapewniająca skuteczne rozbijanie matrycy • Bardzo szybka ekstrakcja analitów z próbek stałych, lepkich lub niejednorodnych • Regulowana amplituda i parametry impulsów umożliwiające optymalizację warunków ekstrakcji • Wysoka energia kawitacji poprawia odzysk analitów i wydajność ekstrakcji |
• Ekstrakcja z trudnych matryc, takich jak tkanka roślinna, próbki żywności lub polimery • Homogenizacja przed SPE, filtracją lub ekstrakcją ciecz–ciecz • Opracowywanie metod ultradźwiękowego przygotowania próbek do HPLC |
| CupHorn („łaźnia o wysokiej intensywności” do zlewek i probówek) |
• Sonikacja pośrednia zapobiega zanieczyszczeniu sonotrody • Równomierne pole ultradźwiękowe dla wielu probówek jednocześnie • Idealny do próbek sterylnych, niebezpiecznych lub lotnych, które muszą pozostawać szczelnie zamknięte • Upraszcza obsługę, zachowując wysoką energię kawitacji |
• Równoległa ekstrakcja wielu próbek do HPLC w szczelnie zamkniętych probówkach wirówkowych • Przygotowanie próbek biologicznych, farmaceutycznych lub środowiskowych • Procedury wymagające sonikacji pośredniej bez zanieczyszczeń |
Znaczenie naukowe dla chemii analitycznej
W miarę jak chemia analityczna zmierza ku szybszym i bardziej zrównoważonym praktykom laboratoryjnym, ultradźwiękowe przygotowanie próbek staje się skuteczną technologią umożliwiającą ten postęp. Sonikacja wspiera opracowywanie szybkich metod analitycznych o mniejszym zużyciu rozpuszczalników, lepszej wydajności ekstrakcji i solidnych parametrach walidacyjnych.
Rosnący zasób literatury dotyczącej ekstrakcji ultradźwiękowej pokazuje, że wspomagane sonikacją przygotowanie próbek do HPLC nie jest jedynie udogodnieniem – jest to naukowo zwalidowane podejście poprawiające parametry analityczne. Łącząc ekstrakcję ultradźwiękową z nowoczesnymi technikami chromatograficznymi, laboratoria mogą osiągnąć wiarygodne wykrywanie analitów śladowych w coraz bardziej złożonych matrycach próbek.
Procedury HPLC usprawnione dzięki sonikacji
Wraz z ciągłym rozwojem aparatury analitycznej i technologii przygotowania próbek ekstrakcja ultradźwiękowa prawdopodobnie będzie odgrywać jeszcze większą rolę w laboratoriach chromatograficznych. Jej zdolność do usprawniania procedur, poprawy jakości danych i zmniejszania wpływu na środowisko dobrze odpowiada zmieniającym się wymaganiom współczesnej analityki.
Chemikom analitykom i laboratoriom przemysłowym dążącym do optymalizacji przygotowania próbek do HPLC ekstrakcja ultradźwiękowa oferuje sprawdzone, skalowalne i solidne pod względem naukowym rozwiązanie. Włączając sonikację do rutynowych protokołów przygotowania próbek, laboratoria mogą znacząco poprawić zarówno wydajność, jak i wiarygodność analizy chromatograficznej.
Projektowanie, produkcja i doradztwo – jakość Made in Germany
Sonikatory Hielscher są dobrze znane z najwyższej jakości i najwyższych standardów projektowych. Solidność i łatwość obsługi umożliwiają bezproblemową integrację naszych sonikatorów z instalacjami przemysłowymi. Sonikatory Hielscher z łatwością radzą sobie z trudnymi warunkami i wymagającymi środowiskami pracy.
Hielscher Ultrasonics jest firmą z certyfikatem ISO i kładzie szczególny nacisk na wysokowydajne sonikatory wyposażone w najnowocześniejszą technologię i przyjazne dla użytkownika. Oczywiście sonikatory Hielscher są zgodne z wymaganiami CE i spełniają wymagania UL, CSA i RoHs.
Literatura / źródła
- M. Rashidipour and R. Heydari (2018): Ultrasonic-Assisted Matrix Solid-Phase Dispersion and High-Performance Liquid Chromatography as an Improved Methodology for Determination of Oleuropein from Olive Leaves. Analytical and Bioanalytical Chemistry Research 52, 2018. 307-316.
- Roudani, A.; Rachid, Mamouni; Nabil, Saffaj; Laknifli, A.; Gharby, Said; Noureddine, El Baraka; Bakka, Abdelhamid; Abdellah, Faouzi (2018): Method validation in the determination of Carbaryl pesticide in water samples using sonication and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. JMES 8 (7), 2017. 2409-2420.
- Bimakr M., Ganjloo A., Zarringhalami S., Ansarian E. (2017): Ultrasound-assisted extraction of bioactive compounds from Malva sylvestris leaves and its comparison with agitated bed extraction technique. Food Science and Biotechnology 2017 Nov 30;26(6):1481-1490.
Najczęściej zadawane pytania
Czym jest HPLC?
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest analityczną techniką rozdzielania stosowaną do identyfikacji, ilościowego oznaczania i oczyszczania składników mieszaniny. W HPLC ciekła faza ruchoma przenosi rozpuszczone anality pod wysokim ciśnieniem przez kolumnę wypełnioną fazą stacjonarną. Różnice w oddziaływaniach między analitami, fazą stacjonarną i fazą ruchomą powodują rozdzielanie związków podczas ich przemieszczania się przez kolumnę. Detektory, takie jak detektory UV-Vis, fluorescencyjne lub spektrometrii mas, mierzą rozdzielone związki, umożliwiając precyzyjną analizę jakościową i ilościową.
Jakie są rodzaje chromatografii cieczowej?
Chromatografię cieczową można klasyfikować według mechanizmu rozdzielania wynikającego z oddziaływań między analitem, fazą stacjonarną i fazą ruchomą. Najczęstsze rodzaje to chromatografia w odwróconym układzie faz, w której niepolarna faza stacjonarna rozdziela związki na podstawie oddziaływań hydrofobowych; chromatografia w normalnym układzie faz, która wykorzystuje polarną fazę stacjonarną i rozdziela związki według polarności; chromatografia jonowymienna, w której naładowane fazy stacjonarne rozdzielają anality na podstawie oddziaływań jonowych; oraz chromatografia wykluczania, która rozdziela cząsteczki według ich rozmiaru hydrodynamicznego i masy cząsteczkowej. Dodatkowe metody specjalistyczne obejmują chromatografię powinowactwa i chromatografię oddziaływań hydrofilowych (HILIC), ukierunkowane na określone oddziaływania molekularne lub związki polarne.
Jakie fiolki stosuje się w HPLC?
W analizach HPLC zazwyczaj stosuje się małe fiolki szklane lub polimerowe przeznaczone do przechowywania przygotowanych próbek przed ich wprowadzeniem do układu chromatograficznego. Najczęstszym formatem jest fiolka do autosamplera o pojemności 2 mL, kompatybilna z większością autosamplerów HPLC. Fiolki te są zwykle wykonane ze szkła borokrzemowego, aby zapewnić odporność chemiczną i minimalne oddziaływanie z rozpuszczalnikami i analitami. W zależności od rodzaju próbki fiolki mogą mieć wkładki do próbek o małej objętości, zamknięcia zakręcane lub zaciskane oraz septa wykonane z materiałów takich jak PTFE/silikon, aby zachować integralność próbki.
Czym są fiolki do autosamplera?
Fiolki do autosamplera to specjalistyczne pojemniki na próbki przeznaczone do systemów automatycznego dozowania w aparatach HPLC i UHPLC. Zawierają przygotowany roztwór próbki i są umieszczane na tacy autosamplera aparatu, skąd system automatycznie pobiera określoną objętość do wprowadzenia do kolumny chromatograficznej. Fiolki do autosamplera są produkowane z zachowaniem precyzyjnych wymiarów, aby zapewnić kompatybilność z igłami zrobotyzowanych systemów pobierania próbek i zminimalizować odparowywanie próbki, zanieczyszczenie lub adsorpcję. Ich konstrukcja umożliwia odtwarzalną analizę o wysokiej wydajności przetwarzania próbek w nowoczesnych laboratoriach chromatograficznych.
Jakie są etapy HPLC?
Typowa procedura wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) składa się z kilku kolejnych etapów, które zapewniają wiarygodne rozdzielanie i wykrywanie analitów.
- Najpierw przeprowadza się przygotowanie próbki, aby rozpuścić analit, usunąć cząstki stałe, a często także wyekstrahować lub zatężyć związki docelowe z matrycy próbki. Etap ten może obejmować filtrację, rozcieńczanie lub techniki ekstrakcji, takie jak ekstrakcja ultradźwiękowa, ekstrakcja do fazy stałej lub ekstrakcja ciecz–ciecz.
- Następnie przygotowaną próbkę umieszcza się w fiolce HPLC i ładuje do autosamplera. Autosampler wprowadza precyzyjną objętość próbki do przepływającej fazy ruchomej.
- Następnie na etapie dostarczania fazy ruchomej wprowadzona próbka jest transportowana przez układ za pomocą pompy wysokociśnieniowej. Faza ruchoma przenosi anality przez kolumnę chromatograficzną przy kontrolowanym natężeniu przepływu.
- Wewnątrz kolumny chromatograficznej zachodzi rozdzielanie. Kolumna zawiera fazę stacjonarną, zazwyczaj złoże cząstek o określonych właściwościach chemicznych. Przemieszczając się przez kolumnę, anality w różny sposób oddziałują z fazą stacjonarną i fazą ruchomą, co powoduje ich elucję w różnych momentach.
- Po rozdzieleniu związki przechodzą przez detektor, taki jak detektor UV-Vis, fluorescencyjny lub spektrometrii mas. Detektor mierzy obecność i stężenie eluowanych związków oraz przekształca sygnał w dane elektroniczne.
- Na końcu przeprowadza się akwizycję i analizę danych przy użyciu oprogramowania chromatograficznego. System generuje chromatogram, w którym piki odpowiadają poszczególnym związkom. Czasy retencji pików pomagają identyfikować anality, natomiast pola powierzchni lub wysokości pików umożliwiają ilościowe oznaczanie ich stężenia.
Hielscher Ultrasonics produkuje wysokowydajne homogenizatory ultradźwiękowe od skali laboratoryjnej do skali przemysłowej.