Eiwitextractie uit tumorweefsel met behulp van sonificatie – protocol
Dit protocol beschrijft een sonicatie-geassisteerde eiwitextractie methode voor tumorweefsel dat de standaard CPTAC ureum lysis workflow vooruitgang door het toevoegen van een gecontroleerde sonde-sonicatie stap tijdens weefsel disruptie. Voortbouwend op de gevestigde diep-schaal CPTAC proteoom en fosfoproteoom voorbereiding strategie, deze wijziging verbetert cel en subcellulaire structuur verstoring, vermindert monster viscositeit, en verbetert het vrijkomen van eiwitten die meestal moeilijker te herstellen met ureum lysis alleen, met name membraan-gebonden en DNA-bindende of nucleus-geassocieerde eiwitten. In het onderliggende onderzoek verhoogde de sonicatie-ondersteunde workflow de detectie van zowel eiwitten als fosfopeptiden met behoud van compatibiliteit met de downstream CPTAC-stijl digestie, TMT labeling, fractionering, fosfopeptide verrijking en LC-MS/MS analyse pijplijn.
Eiwitextractie met behulp van sonificatie uit tumorweefsel voor diepe proteomische en fosfoproteomische analyse
The following protocol is optimized for extraction of proteins from cryopulverized tumor tissue in 8 M urea lysis buffer: An added probe-type sonication step improves the recovery of difficult protein classes, especially membrane-associated and DNA-/nucleus-associated proteins, before digestion and downstream LC-MS/MS analysis. In the underlying study by Li et al. (2025), adding sonication increased detection of membrane and nucleus-associated proteins and supported deep-scale coverage of >12,000 proteins and >25,000 phosphopeptides under their workflow.
ultrasone sonde UP200St voor eiwitextractie in proteomics
Toepassingsgebied van het protocol
Gebruik deze procedure voor:
- vers ingevroren, gecryopulveriseerd tumorweefsel
- celpellets of andere biologische monsters waarvoor extractie op basis van ureum al is vastgesteld
- globale proteomics- en fosfoproteomics-workflows met tryptische ontsluiting en optionele TMT-labeling
Het onderzoek van Li et al. (2025) stelt dat de workflow ook toepasbaar is op andere typen monsters, zoals cellijnen, bloed en urine, maar dat optimalisatie per type monster nodig kan zijn.
Geoptimaliseerde monstervoorbereidingsworkflow met geïmplementeerde sonicatiestap. De geoptimaliseerde workflow en het experimentele ontwerp zijn gebaseerd op het CPTAC monstervoorbereidingsprotocol voor globale proteomische en fosfoproteomische analyse.
Studie en schema: ©Li et al., 2025
Werkingsprincipe
Het oorspronkelijke onderzoek voegde sonicatie toe aan de standaard CPTAC ureum lysis workflow en vond een verbeterde detectie van eiwitten die geassocieerd zijn met membranen en kernen. De auteurs stellen dat de sonicatieparameters nauwkeurig moeten worden afgestemd op de grootte/concentratie van het monster. – door de grootte van de sonotrode, de energie-input en de pulstiming te kiezen.
Voor de Hielscher UP200Ht en UP200St betekent dit bijvoorbeeld:
- gebruik amplitude en pulsmodus als belangrijkste controlevariabelen
- houd monsters altijd koud (d.w.z. op ijs)
- begin met conservatieve instellingen
- optimaliseren op basis van helderheid monster, temperatuur, eiwitopbrengst en downstream peptidekwaliteit
Beide Hielscher 200 watt sonicatormodellen UP200Ht en UP200St zijn ontworpen voor kleine en middelgrote monstervolumes, met instelbare amplitude en pulsinstellingen; beide ultrasone homogenisatoren bieden digitale touchscreenbediening voor nauwkeurige parameteraanpassing, automatische gegevensregistratie, insteekbare temperatuursensor, afstandsbediening, monsterverlichting.
Reagentia voor Sonication-ondersteunde eiwitextractie
Ureum lysisbuffer
Direct voor gebruik vers bereiden:
- 8 M ureum
- 75 mM NaCl
- 50 mM Tris, pH 8,0
- 1 mM EDTA
- 2 µg/mL aprotinine
- 10 µg/mL leupeptine
- 1 mM PMSF
- 10 mM NaF
- 20 µM PUGNAc
- Fosfataseremmer Cocktail 2, 1:100 (v/v)
- Fosfataseremmer Cocktail 3, 1:100 (v/v)
Ureum moet volledig opgelost zijn voordat additieven worden toegevoegd; remmers moeten direct voor gebruik worden toegevoegd; de buffer moet op ijs worden bewaard; en na het toevoegen van additieven wordt aangeraden om te zwenken in plaats van krachtig te vortexen.
Aanvullende reagentia:
- BCA eiwit assay reagentia
- 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
- DTT
- Iodoacetamide
- LysC
- trypsine
- Mierenzuur
- TMT-reagentia, bij gebruik van multiplex kwantitatieve proteomica
- IMAC-reagentia, indien fosfopeptideverrijking wordt uitgevoerd
Ultrasoonapparaat UP200Ht met microtip S26d2 voor monstervoorbereiding
Apparatuur voor Sonication-ondersteunde eiwitextractie
Vereist
Aanbevolen sondeselectie
Gebruik voor monsters van 200-1000 µL een sonotrode met een kleine diameter die geschikt is voor directe verwerking van kleine volumes met hoge intensiteit. Hielscher biedt meerdere sonotrodediameters en kleinere tipdiameters zorgen voor een hogere intensiteit bij de tip.
Praktische opmerking: Gebruik de kleinste sonde die efficiënt mengen mogelijk maakt zonder overmatig schuimen of contact met de wand van het vat.
Als je met meerdere monsters tegelijk werkt, kun je het volgende overwegen de Multi-Tube Sonicator VialTweeter of de Microplate Sonicator UIP400MTP!
Stap-voor-stap instructies: Procedure van Sonication-Assisted Protein Extraction
A. Voorkoelen en voorbereiden
- Koel de centrifuge tot 4°C.
- Bereid verse ureumlysebuffer en bewaar deze in ijs.
- Zet de UP200Ht of UP200St op een standaard in een geluidskast.
- Maak een ijsbad klaar dat groot genoeg is om de monsterbuizen rechtop en stabiel te houden.
De bereiding van verse buffers en koude behandeling zijn van cruciaal belang.
B. Eerste extractie van ureum
- Bewaar gecryopulveriseerd weefsel op ijs.
- Voeg 200 µL gekoelde ureum lysisbuffer per 50 mg nat weefsel toe.
- Vortex 5-10 s op hoge snelheid.
- Incubeer 15 min. bij 4°C.
- Herhaal de vortex-plus-incubatiestap nog een keer.
- Centrifugeer bij 20.000 g gedurende 10 minuten bij 4°C.
- Breng het lysaat/supernatans over in een schone laagbindende buis.
C. Sonificatie met UP200Ht of UP200St
Startcondities voor Sonicatie
- Amplitude: begin bij 20-30%
- Pulslengte: 5 s AAN
- Koelen: 2 min. op ijs tussen pulsen
- Aantal cycli: 4 cycli
- Totale actieve sonificatietijd: 20 s
- Totale procestijd inclusief afkoelen: ongeveer 8-10 min.
Sonicatiestappen
- Breng het lysaat over in een buis die geschikt is voor sonicatie. Gebruik een smalle, dunwandige buis die een goede warmte-uitwisseling en een veilige onderdompeling in de sonde mogelijk maakt.
- Plaats de buis in een ijsbad. Volgens het artikel is koeling tijdens sonicatie essentieel om hitteschade te voorkomen.
- Dompel de sondepunt in het monster. Houd de punt voldoende ondergedompeld voor stabiele cavitatie, maar laat deze de buiswand of -bodem niet raken.
- Voer één puls van 5 seconden uit op de startamplitude.
- Plaats het monster onmiddellijk gedurende 2 minuten volledig in ijs.
- Herhaal dit tot er 4 cycli zijn voltooid.
- Inspecteer het lysaat na de cyclus.
- Ga alleen door indien nodig, met telkens een extra puls van 5 seconden, altijd gevolgd door volledig afkoelen.
- Stop zodra het lysaat uniformer en minder draderig/viskeus wordt.
Het eindpunt is een meer doorzichtig lysaat dat druppels vormt in plaats van een continue viskeuze stroom. - Centrifugeer bij ongeveer 16.000 g gedurende 15 minuten bij 4°C.
- Breng het geklaarde supernatant over in een nieuwe buis en meet de eiwitconcentratie.
Vergelijking van globale proteomics en fosfoproteomics tussen gesoniseerde en niet-gesoneerde monsters.
a. Aantal geïdentificeerde eiwitten (global proteomics) in alle PDX tumorweefsels met of zonder sonicatie. b. Aantal geïdentificeerde fosfopeptiden (IMAC verrijking) in alle PDX tumorweefsels met of zonder sonicatie. Alleen eiwitten en fosfopeptiden met een abundantieratio groter dan of gelijk aan het 25e percentiel werden geteld. De overvloedratio werd berekend tussen dezelfde typen monsters.
Studie en grafieken: ©Li et al., 2025
Downstream ontsluiting en analyse
Ga na sonicatie en klaring verder zoals beschreven in de oorspronkelijke CPTAC-workflow:
- Verdun lysaat 1:3 (v/v) met 50 mM Tris-HCl pH 8,0 om ureum te reduceren tot <2 M.
- Voeg LysC toe met 1 mAU per 50 µg eiwit en incubeer 2 uur bij 25°C.
- Voeg trypsine toe in een verhouding van 1:49 enzym:substraat (g/g) en verteer overnacht bij 25 °C.
- Blussen met mierenzuur tot 1% definitief.
- Ga verder met ontzouten, TMT-labeling, fractionering, fosfopeptideverrijking en LC-MS/MS zoals vereist.
Differentiële expressie van fosfopeptiden van TMT-gelabelde MS.
a. Het basale subtype, met de nadruk op een aantal menselijke fosfopeptiden (eiwit-sequentie begin en einde) upgereguleerd in gesoneerde monsters in vergelijking met niet gesoneerde monsters. b. Het luminale subtype, met de nadruk op een aantal menselijke fosfopeptiden (eiwit_sequentie begin en einde) upgereguleerd in gesoneerde monsters in vergelijking met niet gesoneerde monsters. c. Verrijkte KEGG pathways gebaseerd op de eiwitten van upgereguleerde fosfopeptiden in gesoneerde basale subtype tumoren. d. Verrijkte KEGG pathways gebaseerd op de eiwitten van upgereguleerde fosfopeptiden in gesoneerde luminale subtype tumoren.
Studie en grafieken: ©Li et al., 2025
Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit Made in Germany
Hielscher ultrasone machines staan bekend om hun hoge kwaliteit en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening zorgen voor een soepele integratie van onze ultrasoonapparatuur in industriële faciliteiten. Ruwe omstandigheden en veeleisende omgevingen worden gemakkelijk door Hielscher ultrasoontoestellen aangepakt.
Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt speciale nadruk op hoogwaardige ultrasone apparaten met state-of-the-art technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn de Hielscher ultrasoonapparaten CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.
Multi-well platen sonicator UIP400MTP voor high-throughput eiwitextractie uit monsters
Literatuur / Referenties
- Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
- Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
- Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
- Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
- Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.
veelgestelde vragen
Wat is het verschil tussen eiwitextractie uit plantenweefsel en uit weefsel van zoogdieren?
Eiwitextractie uit plantenweefsel is meestal moeilijker dan uit zoogdierweefsel omdat plantencellen een stijve celluloserijke celwand, overvloedige polysachariden, fenolverbindingen, pigmenten en actieve endogene enzymen hebben die de eiwitoplosbaarheid kunnen verstoren, extracten kunnen verontreinigen of eiwitafbraak kunnen bevorderen. Zoogdierweefsel heeft daarentegen geen celwand en is over het algemeen gemakkelijker chemisch te ontregelen, hoewel het vaak meer lipiden, extracellulaire matrix en proteasen bevat die de extractie nog steeds kunnen bemoeilijken. Als gevolg hiervan vereisen plantenprotocollen meestal een sterkere mechanische verstoring, malen bij lage temperatuur en additieven zoals PVPP, reductiemiddelen of reiniging op basis van fenol, terwijl weefsel van zoogdieren vaker succesvol wordt behandeld met buffers op basis van detergentia zoals RIPA of lysissystemen op basis van ureum. Zowel plantaardig als zoogdierweefsel kan efficiënt worden gelyseerd door middel van sonicatie!
Hoe verbeter je de eiwitextractie uit weefsel met behulp van RIPA-buffer?
Eiwitextractie uit weefsel met RIPA-buffer kan worden verbeterd door zowel de verstoring als de bescherming van het monster te optimaliseren. De belangrijkste maatregelen zijn om het weefsel en de buffer koud te houden, vers bereide protease- en fosfataseremmers te gebruiken, het weefsel vóór de lysis grondig fijn te hakken of te verpulveren, een geschikte buffer-weefselverhouding aan te houden en een mechanische verstoringsstap zoals homogenisatie of korte sonde-sonicatie toe te voegen om dicht weefsel op te breken en de viscositeit te verminderen. De efficiëntie van de extractie verbetert ook wanneer lysaten op ijs worden geïncubeerd met intermitterend mengen, gevolgd door centrifugeren met hoge snelheid in de koelkast om onoplosbare debris te verwijderen. Voor vezelige, lipide-rijke, of zeer gestructureerde weefsels, het herhalen van de extractie een keer of het verhogen van detergent blootstelling tijd kan het herstel te verbeteren, maar overmatige sonicatie of langdurige kamertemperatuur behandeling moet worden vermeden omdat ze kunnen denature eiwitten of verhogen proteolyse.
Aan welke veiligheidsvereisten moet worden voldaan tijdens ultrasone eiwitextractie?
Voer de sonicatie van de sonde uit in een geluidsbeschermingsbox of met geschikte gehoorbescherming. Het bronprotocol waarschuwt specifiek voor schadelijk hoorbaar geluid dat gegenereerd wordt tijdens sonicatie.
Draag oogbescherming, laboratoriumjas en handschoenen.
Houd de sonde uit de buurt van de huid en sonificeer nooit een open vat zonder spatbescherming.
Behandel PMSF en andere remmers volgens de plaatselijke chemische veiligheidsregels.
Bewaar monsters op ijs om schade aan eiwitten door hitte te beperken; in het artikel wordt herhaaldelijk aangegeven dat temperatuurbeheersing van cruciaal belang is.
De VialTweeter Sonicator versnelt en verbetert eiwitextractie in proteomics
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.