Sonicatieondersteunde eiwitextractie uit tumorweefsel – Protocol

Dit protocol beschrijft een methode voor sonicatieondersteunde eiwitextractie uit tumorweefsel die de standaardworkflow voor ureumlyse van CPTAC verbetert door tijdens de weefselontsluiting een gecontroleerde sonicatiestap met een sonde toe te voegen. Voortbouwend op de gevestigde strategie van CPTAC voor monstervoorbereiding voor diepgaande proteoom- en fosfoproteoomanalyse verbetert deze aanpassing de ontsluiting van cellen en subcellulaire structuren, verlaagt zij de viscositeit van monsters en bevordert zij het vrijkomen van eiwitten die doorgaans moeilijker terug te winnen zijn met alleen ureumlyse, vooral membraangebonden eiwitten en eiwitten die DNA binden of met de celkern geassocieerd zijn. In de onderliggende studie verhoogde de sonicatieondersteunde workflow de detectie van zowel eiwitten als fosfopeptiden, terwijl de compatibiliteit met de daaropvolgende analyseketen volgens de aanpak van CPTAC voor digestie, labeling met TMT, fractionering, fosfopeptideverrijking en analyse met LC-MS/MS behouden bleef.

Sonicatieondersteunde eiwitextractie uit tumorweefsel voor diepgaande proteomische en fosfoproteomische analyse

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor de extractie van eiwitten uit cryogeen verpulverd tumorweefsel in een lysebuffer met 8 M ureum: een toegevoegde sonicatiestap met een sonde verbetert de terugwinning van moeilijk extraheerbare eiwitklassen, vooral eiwitten die met membranen, DNA of de celkern geassocieerd zijn, vóór digestie en daaropvolgende analyse met LC-MS/MS. In de onderliggende studie van Li et al. (2025) verhoogde de toevoeging van sonicatie de detectie van membraan- en celkerngeassocieerde eiwitten en ondersteunde deze binnen hun workflow een diepgaande dekking van >12.000 eiwitten en >25.000 fosfopeptiden.

Toepassingsgebied van het protocol

Gebruik deze procedure voor:

• vers ingevroren, cryogeen verpulverd tumorweefsel
• celpellets of andere biologische monsters waarvoor extractie op basis van ureum al een gevestigde methode is
• workflows voor globale proteomica en fosfoproteomica met tryptische digestie en optionele TMT-labeling

De studie van Li et al. (2025) stelt dat de workflow ook toepasbaar is op andere monstertypen, zoals cellijnen, bloed en urine; optimalisatie kan echter per monstertype nodig zijn.

Geoptimaliseerde workflow voor monstervoorbereiding met een geïntegreerde sonicatiestap. De geoptimaliseerde workflow en de experimentele opzet zijn gebaseerd op het CPTAC-protocol voor monstervoorbereiding voor globale proteomische en fosfoproteomische analyse.
Studie en schema: ©Li et al., 2025

Werkingsprincipe

In de oorspronkelijke studie werd sonicatie toegevoegd aan de standaardworkflow voor ureumlyse van CPTAC en werd een verbeterde detectie van membraan- en celkerngeassocieerde eiwitten vastgesteld. De auteurs stellen dat de sonicatieparameters nauwkeurig moeten worden afgestemd op de monstergrootte en -concentratie – door de grootte van de sonotrode, de energietoevoer en de pulstiming te kiezen.

Voor de Hielscher UP200Ht en UP200St betekent dit bijvoorbeeld:

• gebruik amplitude en pulsmodus als de belangrijkste regelvariabelen
• houd de monsters gedurende het hele proces koud (d.w.z. op ijs)
• begin met voorzichtige instellingen
• optimaliseer op basis van de helderheid van het monster, de temperatuur, de eiwitopbrengst en de kwaliteit van de peptiden in de daaropvolgende stappen

 
Beide sonicatormodellen van Hielscher van 200 watt, UP200Ht en UP200St, zijn ontworpen voor kleine en middelgrote monstervolumes, met instelbare amplitude en pulsinstellingen; beide ultrasone homogenisatoren bieden digitale touchscreenbediening voor nauwkeurige parameterinstelling, automatische gegevensregistratie, een aansluitbare temperatuursensor, afstandsbediening en monsterverlichting.
 

Reagentia voor sonicatieondersteunde eiwitextractie

Ureumlysebuffer

Bereid deze direct vóór gebruik vers:

• 8 M ureum
• 75 mM NaCl
• 50 mM Tris, pH 8,0
• 1 mM EDTA
• 2 µg/mL aprotinine
• 10 µg/mL leupeptine
• 1 mM PMSF
• 10 mM NaF
• 20 µM PUGNAc
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 2, 1:100 (v/v)
• Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, 1:100 (v/v)

Ureum moet volledig opgelost zijn voordat additieven worden toegevoegd; remmers moeten direct vóór gebruik worden toegevoegd; de buffer moet op ijs worden gehouden; en na toevoeging van de additieven wordt rustig zwenken aanbevolen in plaats van krachtig vortexen.
 

Aanvullende reagentia:

• Reagentia voor de BCA-eiwitbepaling
• 50 mM Tris-HCl, pH 8,0
• DTT
• Joodacetamide
• LysC
• Trypsine
• Mierenzuur
• TMT-reagentia, bij gebruik van gemultiplexte kwantitatieve proteomica
• IMAC-reagentia, bij uitvoering van fosfopeptideverrijking

Apparatuur voor sonicatieondersteunde eiwitextractie

Benodigd

Aanbevolen sondekeuze

Gebruik voor monsters van ongeveer 200–1000 µL een sonotrode met een kleine diameter die geschikt is voor directe verwerking van kleine volumes met hoge intensiteit. Hielscher biedt verschillende sonotrodediameters, en kleinere tipdiameters leveren een hogere intensiteit aan de tip.

Praktische opmerking: gebruik de kleinste sonde die efficiënt mengt zonder overmatige schuimvorming of contact met de wand van het vat.

Als u met meerdere monsters tegelijk werkt, kunt u overwegen gebruik te maken van de Multi-Tube Sonicator VialTweeter of de Microplate Sonicator UIP400MTP!

Stapsgewijze instructies: procedure voor sonicatieondersteunde eiwitextractie

A. Voorkoelen en voorbereiden

1. Koel de centrifuge tot 4°C.
2. Bereid verse ureumlysebuffer en houd deze op ijs.
3. Plaats de UP200Ht of UP200St op een statief in een geluidswerende behuizing.
4. Bereid een ijsbad dat groot genoeg is om de monsterbuisjes rechtop en stabiel te houden.

Verse bereiding van de buffer en verwerking onder koude omstandigheden zijn cruciaal.

B. Eerste extractie met ureum

1. Houd cryogeen verpulverd weefsel op ijs.
2. Voeg 200 µL gekoelde ureumlysebuffer toe per 50 mg nat weefsel.
3. Vortex 5–10 s op hoge snelheid.
4. Incubeer 15 min bij 4°C.
5. Herhaal de stap van vortexen gevolgd door incubatie nog eenmaal.
6. Centrifugeer gedurende 10 min bij 20.000g en 4°C.
7. Breng het lysaat/supernatant over naar een schoon buisje met geringe eiwitbinding.

C. Sonicatie met UP200Ht of UP200St

Startcondities voor sonicatie

• Amplitude: begin bij 20–30%
• Pulslengte: 5 s AAN
• Koeling: 2 min op ijs tussen de pulsen
• Aantal cycli: 4 cycli
• Totale actieve sonicatietijd: 20 s
• Totale procestijd inclusief koeling: ongeveer 8–10 min

Sonicatiestappen

1. Breng het lysaat over naar een buisje dat geschikt is voor sonicatie. Gebruik een smal, dunwandig buisje dat een goede warmte-uitwisseling en veilige onderdompeling van de sonde mogelijk maakt.
2. Plaats het buisje in een ijsbad. Het artikel noemt koeling tijdens sonicatie cruciaal om hitteschade te voorkomen.
3. Dompel de sondetip onder in het monster. Houd de tip voldoende ondergedompeld voor stabiele cavitatie, maar laat deze de wand of bodem van het buisje niet raken.
4. Voer één puls van 5 s uit bij de startamplitude.
5. Plaats het monster onmiddellijk weer volledig op ijs gedurende 2 min.
6. Herhaal totdat 4 cycli zijn voltooid.
7. Inspecteer het lysaat na de cyclus.
8. Ga alleen verder indien nodig, met telkens één extra puls van 5 s, altijd gevolgd door volledige koeling.
9. Stop zodra het lysaat homogener en minder draderig/viskeus wordt.
   Het eindpunt is een doorschijnender lysaat dat druppels vormt in plaats van een continue viskeuze stroom.
10. Centrifugeer gedurende 15 min bij ongeveer 16.000g en 4°C.
11. Breng het geklaarde supernatant over naar een nieuw buisje en meet de eiwitconcentratie.

Vergelijking van globale proteomica en fosfoproteomica tussen gesoniceerde en niet-gesoniceerde monsters.
a. Aantal geïdentificeerde eiwitten (globale proteomica) in alle PDX-tumorweefsels met of zonder sonicatie. b. Aantal geïdentificeerde fosfopeptiden (IMAC-verrijking) in alle PDX-tumorweefsels met of zonder sonicatie. Alleen eiwitten en fosfopeptiden met een abundantieverhouding groter dan of gelijk aan het 25e percentiel werden geteld. De abundantieverhouding werd berekend tussen dezelfde typen monsters.
Studie en grafieken: ©Li et al., 2025

Daaropvolgende digestie en analyse

Ga na sonicatie en klaring verder zoals beschreven in de oorspronkelijke workflow volgens de CPTAC-aanpak:

1. Verdun het lysaat 1:3 (v/v) met 50 mM Tris-HCl pH 8,0 om de ureumconcentratie tot <2 M te verlagen.
2. Voeg LysC toe in een hoeveelheid van 1 mAU per 50 µg eiwit en incubeer 2 h bij 25°C.
3. Voeg trypsine toe in een verhouding van 1:49 enzym:substraat (w/w) en laat de digestie een nacht plaatsvinden bij 25°C.
4. Stop de reactie met mierenzuur tot een eindconcentratie van 1%.
5. Ga naar behoefte verder met ontzouting, TMT-labeling, fractionering, fosfopeptideverrijking en LC-MS/MS.

Differentiële expressie van fosfopeptiden bepaald met MS na TMT-labeling.
a. Het basale subtype, met uitlichting van enkele humane fosfopeptiden (begin en einde van de eiwitsequentie) die in gesoniceerde monsters opgereguleerd zijn ten opzichte van niet-gesoniceerde monsters. b. Het luminale subtype, met uitlichting van enkele humane fosfopeptiden (begin en einde van de eiwitsequentie) die in gesoniceerde monsters opgereguleerd zijn ten opzichte van niet-gesoniceerde monsters. c. Verrijkte KEGG-signaalroutes op basis van de eiwitten van opgereguleerde fosfopeptiden in gesoniceerde tumoren van het basale subtype. d. Verrijkte KEGG-signaalroutes op basis van de eiwitten van opgereguleerde fosfopeptiden in gesoniceerde tumoren van het luminale subtype.
Studie en grafieken: ©Li et al., 2025

Ontwerp, productie en advies – Kwaliteit uit Duitsland

Sonicatoren van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Robuustheid en eenvoudige bediening maken een soepele integratie van onze sonicatoren in industriële installaties mogelijk. Sonicatoren van Hielscher kunnen gemakkelijk omgaan met zware omstandigheden en veeleisende omgevingen.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op sonicatoren met hoge prestaties met de modernste technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard voldoen sonicatoren van Hielscher aan de CE-voorschriften en aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

Literatuur / Referenties

• Li Q.K.; Lih T.M.; Clark D.J.; Chen L.; Schnaubelt M.; Zhang H. (2025): Sonication-assisted protein extraction improves proteomic detection of membrane-bound and DNA-binding proteins from tumor tissues. Nature Protocols 2025 Aug;20(8):2083-2099.
• Stadlmann, J., Taubenschmid, J., Wenzel, D. et al. (2017): Comparative glycoproteomics of stem cells identifies new players in ricin toxicity. Nature 549, 2017. 538–542
• Jakob, S., Steinchen, W., Hanßmann, J. et al. (2024): The virulence regulator VirB from Shigella flexneri uses a CTP-dependent switch mechanism to activate gene expression. Nature Communications 15, 318 (2024).
• Jorge S., Capelo J.L., LaFramboise W., Dhir R., Lodeiro C., Santos H.M. (2019): Development of a Robust Ultrasonic-Based Sample Treatment To Unravel the Proteome of OCT-Embedded Solid Tumor Biopsies. Journal of Proteome Research 2019 Jul 5;18(7):2979-2986.
• Mertins P, Tang LC, Krug K, et al. (2018): Reproducible workflow for multiplexed deep-scale proteome and phosphoproteome analysis of tumor tissues by liquid chromatography-mass spectrometry. (Initial CPTAC protocol). Nature Protocols 7, 2018. 1632-1661.