Monstervoorbereiding met de ultrasone VialTweeter

Monstervoorbereiding vóór de analyse kan verschillende pre-analytische processen vereisen zoals weefselhomogenisatie, lysis, extractie van eiwitten, DNA, RNA, organellen en andere intracellulaire stoffen, oplossen en ontgassen. De VialTweeter is een uniek ultrasoon apparaat dat meerdere monsterbuizen tegelijkertijd bereidt onder exact dezelfde omstandigheden. Door de indirecte sonicatie van gesloten reageerbuizen worden kruisbesmetting en monsterverlies voorkomen.

Ultrasoon prepareren van monsters

Ultrasonicatie is een veel voorkomende techniek van monsterbehandeling om het monster klaar te krijgen voor analyses zoals polymeren kettingreactie (PCR), Western Blots, assays, moleculaire sequencing, chromatografie enz. Ultrasonicatie is een techniek die veel gebruikt wordt in laboratoria om monsters pre-analytisch te behandelen. Een groot voordeel van ultrasoonbehandeling is dat het werkingsprincipe van ultrasoon geluid gebaseerd is op zuiver mechanische krachten. Ultrasone lyse en celverstoring wordt bereikt door sonomechanische schuifkrachten, wat ultrasoon het voordeel geeft dat de oplosmiddelen die gebruikt worden voor eiwitextractie ook tijdens de lyse kunnen worden gebruikt. Ultrasone celverstoorders zoals de VialTweeter breken de celwanden/membranen en bevorderen de massatransfer tussen celinterieur en oplosmiddel. Daarbij wordt de analyt (bijv. DNA, RNA, eiwitten, organellen etc.) efficiënt van de celmatrix naar het oplosmiddel overgedragen. Dit betekent dat de stappen van afschrikking en extractie overlappen met het ultrasone celverstoringsproces, wat de ultrasone lyse zeer effectief maakt. Bovendien zijn voor de ultrasone monstervoorbereiding geen reinigingsmiddelen en andere lysisreagentia nodig, die de structuur van het lysaat kunnen veranderen en vernietigen en die bekend staan om de latere problemen met de zuivering. Een andere lysemethode, de enzymatische verstoring vereist lange incubatietijden en levert vaak niet-reproduceerbare resultaten op. Ultrasone monstervoorbereiding overwint veel voorkomende problemen bij monstervoorbereiding zoals weefselhomogenisatie, celverstoring, lyse, eiwitextractie en lysaatsolubilisatie. Aangezien de intensiteit van de ultrasone behandeling precies kan worden gecontroleerd en aangepast aan het biologische monster, worden degradatie en monsterverlies vermeden. Automatisch bewaakte en gecontroleerde monstertemperatuur, pulsmodus en sonicatieduur zorgen voor een optimaal resultaat.

De VialTweeter is vooral geschikt voor laboratoriumwerk dat de gelijktijdige bereiding van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden vereist. De VialTweeter is een ultrasone bloksonotrode die tot 10 flacons (bijv. Eppendorf, centriguge, NUNC-buizen, cryo-vials) kan bevatten en deze onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden intensief sonicateert. Aangezien de ultrasone energie via de wanden van de flesjes in het monstermedium wordt gekoppeld, blijven de flesjes tijdens de behandeling gesloten. Hierdoor worden monsterverlies en kruisbesmetting volledig vermeden.

Flacons en buizen die op de VialTweeter passen

De VialTweeter is geschikt voor 10 gangbare conische of rondbodembuizen zoals Eppendorf, centrifuge, cryo-vials en diverse NUNC-flacons, maar de gaten kunnen op verzoek worden aangepast aan andere flacons en buisafmetingen. Laat ons weten welk soort reageerbuizen u wilt gebruiken, zodat we uw VialTweeter dienovereenkomstig kunnen aanpassen. Voor grotere reageerbuizen zoals Falcon-buizen en andere testbakken, bekers en vaten is de VialPress een handige oplossing.

De VialTweeter met VialPress

Terwijl de VialTweeter zelf met zijn 10 buisgaten al een uniek en zeer functioneel ultrasoon apparaat is, maakt de VialPress add-on de VialTweeter nog veelzijdiger en flexibeler in gebruik. De VialPress is een accessoire voor de VialTweeter die bestaat uit een klemstang die het mogelijk maakt om grotere monsterbuizen zoals Falcon-buizen of andere kleine tot middelgrote testbekers aan het VialTweeter-front te bevestigen. De foto links toont de VialTweeter met 10 Eppendorf-flesjes in het blok, terwijl de VialPress een grotere reageerbuis aan de voorkant fixeert voor sonicatie. De VialPress is in staat om tot 5 grotere reageerbuizen vast te houden voor intense sonicatie.

VialTweeter Monstervoorbereidingsprotocollen

De VialTweeter wordt veel gebruikt om biologische monsters te soniceren. Voorafgaand aan de analyse moeten de monsters worden voorbereid voor biochemische of biofysische analyses en assays, bijvoorbeeld door middel van lysis, weefselhomogenisatie, eiwitextractie, DNA / RNA afschuiving, ontgassing, enz. De VialTweeter vervult deze ultrasone processen betrouwbaar en levert reproduceerbare resultaten. Een veel voorkomende toepassing van de VialTweeter is de lysis/celverstoring van zoogdierweefsel (mens en dier) en van bacteriecellen en virusdeeltjes. Succesvol behandelde biologische monsters van VialTweeter omvatten menselijke longepitheelcellen, hematopoëtische stamcellen, myeloïde leukemiecellen, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Streptococcus pyogenes, Caulobacter sikkel, Mycoplasma longontstekingMycobacteriën / Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) en vele andere bacteriële, botanische en microbiële cellen.
Hieronder vindt u enkele geselecteerde protocollen met de VialTweeter.

E.Coli Lyse met VialTweeter voor In-Vivo Glutathionbepaling

Escherichia coli bacteriën van de stam MG1655 werden gekweekt in MOPS minimaal medium in een totaal volume van 200ml tot een A600 van 0,5 werd bereikt. De kweek werd opgesplitst in 50 ml kweken voor stressbehandeling. Na 15 min. incubatie met 0,79 mM allicine, 1 mM diamant of dimethylsulfoxide (controle), werden de cellen geoogst bij 4.000g bij 4°C gedurende 10 min. De cellen werden twee keer gewassen met KPE-buffer voor de resuspensie van de pellets in 700 µl KPE-buffer. Voor deproteïnering werden 300 µl van 10% (w/v) sulfosalicylzuur toegevoegd voorafgaand aan de verstoring van de cellen door ultrasonicatie (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanten werden verzameld na het centrifugeren (30 min, 13.000g, 4°C). Sulfosalicylzuurconcentraties werden verlaagd tot 1% door toevoeging van 3 volumes KPE-buffer. Metingen van totaal glutathion en GSSG werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Cellulaire glutathionconcentraties werden berekend op basis van een volume E. coli-cellen van 6,7×10-15 liter en een celdichtheid van A600 0,5 (equivalent aan 1×108 cellen ml-1 cultuur). GSH-concentraties werden berekend door 2[GSSG] af te trekken van het totaal aan glutathion. (Müller et al. 2016)

Celanalyse met VialTweeter voor grafietoven Atoomabsorptiespectrometrie

Bacillus subtilis 168 (trpC2) werden blootgesteld aan 15 min. antibiotische stress, vervolgens werden de cellen geoogst bij 3.320 x g, vijf keer gewassen met 100 mM Tris/1 mM EDTA, pH 7,5, geresuspendeerd in 10 mM Tris, pH 7,5 en verstoord door ultrasoonbehandeling in een Hielscher VialTweeter instrument. (Wenzel et al. 2014)

VialTweeter Monstervoorbereiding voor Massaspectrometrie

De gelyofiliseerde celpellets van menselijke CD34 hematopoëtische stam/progenitorcellen werden geresuspendeerd in 10 µl (200 µl voor bulk HEK293 voorbereiding voor de peptide verdunningsreeks) van 8 M ureum in 100 mM ammoniumwaterstofcarbonaat en gelyseerd met behulp van sonicatie met de Hielscher VialTweeter bij een amplitude van 60%, een cyclus van 60% en een duur van 20s voor drie keer met tussentijdse koeling op ijs. (Amon et al. 2019)

Voorbereidingsprotocollen voor monsters met behulp van de VialPress

Verse sla (Lactuca sativa) werd gehomogeniseerd in 0,5 M HEPES-buffer (pH 8, KOH aangepast) in een verhouding van 1 g plant (vers gewicht) tot 200, 100, 50 of 20 mL bufferoplossing. De verhouding tussen de massa van de plant en het volume van de bufferoplossing werd gevarieerd om het totale homogenaatvolume tussen 3,5 en 12 mL te houden. De verhouding tussen de massa van de plant en het volume van de bufferoplossing werd gevarieerd om het totale homogenaatvolume tussen 3,5 en 12 mL te houden, waardoor homogenisatie met de sonde mogelijk is. De homogenen ondergingen vervolgens een indirecte ultrasoonbehandeling met behulp van een UP200St met VialTweeter uitgerust met 200xt VialPress (Hielscher Ultrasonics GmbH, Duitsland) gedurende 3 minuten (80% puls en 100% vermogen). Door het gebruik van dit apparaat wordt vervuiling voorkomen. (Laughton et al. 2019)

Betrouwbare temperatuurregeling tijdens Sonication met de VialTweeter

Temperatuur is een cruciale procesbeïnvloedende factor die vooral belangrijk is voor de behandeling van biologische monsters. Zoals alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken, creëert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden gecontroleerd bij gebruik van de VialTweeter. Wij presenteren u verschillende mogelijkheden om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te controleren, terwijl u ze met de VialTweeter en VialPress voor analyse voorbereidt.

1. Bewaking van de monstertemperatuur: De ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aandrijft, is uitgerust met een intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via een digitaal gekleurd touch-display kunt u in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik voor uw monstername-sonicatie instellen. De ultrasonicator zal automatisch stoppen wanneer de maximale temperatuur is bereikt en pauzeren totdat de temperatuur van het monster is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Daarna begint de ultrasone meting weer automatisch. Deze slimme functie voorkomt warmte-inducerende degradatie.
2. Het VialTweeter blok kan voorgekoeld worden. Plaats het VialTweeter-blokje (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblokje voor te koelen en zo de temperatuurstijging van het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan het monster zelf ook voorgekoeld worden.
3. Gebruik droogijs om af te koelen tijdens de sonicatie. Gebruik een ondiepe bak gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs zodat de warmte snel kan worden afgevoerd.

Klanten gebruiken de VialTweeter en VialPress wereldwijd voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Door de intelligente software en temperatuurregeling van de UP200St-processor wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt door warmte veroorzaakte monsterafbraak vermeden. Ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter en VialPress levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!

Technische details van de VialTweeter

De VialTweeter is een bloksonotrode van titanium die tot 10 flesjes in de gaten in het blok kan houden. Daarnaast kunnen tot 5 grotere testbuizen met de VialPress op het front van de VialTweeter worden geklemd. De VialTweeter is zo ontworpen dat de ultrasone energie gelijkmatig wordt verdeeld in elke ingebrachte flacon om betrouwbare en uniforme sonarresultaten te garanderen. Een klein draaipunt past de sonotrode van de VialTweeter aan op een oneffen ondergrond en richt de reageerbuizen verticaal uit.

De voordelen van de VialTweeter in een oogopslag

• Intense ultrasoonapparaat van maximaal 10 flesjes tegelijk
• Indirecte sonificatie bij hoge ultrasone intensiteit door de vaatwand in het monster
• Indirect sonicatie voorkomt kruisbesmetting en sample verlies
• Reproduceerbare resultaten dankzij de instelbare en controleerbare geluidsamplitude
• De VialPress stelt u in staat om grotere buizen te sonificeren.
• Instelbare amplitude van 20 tot 100%
• Verstelbare pulsmodus 0-100%
• autoclaveerbaar

De VialTweeter wordt aangedreven door de UP200Steen 200 watt krachtige ultrasone processor. De UP200St is uitgerust met een intelligente software die het mogelijk maakt om alle belangrijke ultrasone procesparameters zoals amplitude, sonische tijd, pulsatie en temperatuur nauwkeurig te regelen. Dit maakt de VialTweeter tot een betrouwbaar instrument voor succesvolle reproduceerbare procesresultaten in biologische en biochemische laboratoria.
De amplitude kan worden aangepast tussen 20 en 100% en maakt het mogelijk om de ultrasone intensiteit aan te passen aan uw monster. Zo vereist het afschuiven en fragmenteren van DNA en RNA een mildere amplitude om de productie van te kleine DNA-fragmenten te voorkomen, de weefselhomogenisatie van de muizenhersenen heeft een hoge intensiteit nodig. Kies de ideale amplitude, sonische intensiteit en duur via het slimme en intuïtieve menu van de UP200St-processor. Het menu en de instellingen zijn eenvoudig toegankelijk en te bedienen via een gekleurd aanraakscherm. In de instellingen kunt u vooraf sonische parameters instellen, zoals amplitude, pulsatie/cyclusmodus, sonische duur, totale energie-input en temperatuurlimieten. Bij onderzoek en productie is de herhaalbaarheid van proeven en testresultaten cruciaal. Dit betekent dat een nauwkeurige registratie van de procescondities en sonische protocollen van groot belang is. De automatische dataprotocollering schrijft alle sonische gegevens in een CSV-bestand op een geïntegreerde SD-kaart, zodat u eenvoudig verschillende sonische runs kunt controleren en vergelijken. Alle ultrasone procesgegevens zijn eenvoudig toegankelijk en kunnen worden gedeeld als CSV-bestand.
Hielscher Ultrasonics streeft ernaar u te voorzien van geavanceerde technologie om uw onderzoekswerk te vergemakkelijken en te verbeteren!