Ultrasone monstervoorbereiding voor ELISA-assays
Assays zoals ELISA worden veel gebruikt voor in-vitrodiagnostiek, de detectie van ziektegerelateerde eiwitten en kwaliteitscontrole (bijv. het monitoren van voedselallergenen). Ultrasone monstervoorbereiding is een snelle, betrouwbare en reproduceerbare techniek om cellen te lyseren en intracellulaire eiwitten, DNA, RNA en organellen te isoleren. Hielscher Ultrasonics biedt diverse ultrasone oplossingen voor de eenvoudige voorbereiding van afzonderlijke monsters, meerdere monsterflesjes, microtiterplaten en 96-wellsplaten.
ELISA – Enzymgekoppelde immunosorbenttest
ELISA staat voor enzymgekoppelde immunosorbenttest en is een veelgebruikte biochemische analysetechniek uit de categorie ligandbindingsassays. Bij ELISA wordt een vloeibaar monster toegevoegd aan een stationaire vaste fase met specifieke bindingseigenschappen. Gewoonlijk wordt de stationaire vaste fase als coating op een wellsplaat of ELISA-plaat aangebracht. Vervolgens worden achtereenvolgens verschillende vloeibare reagentia toegevoegd en geïncubeerd en worden wasstappen uitgevoerd, zodat uiteindelijk een optische verandering (bijv. kleurontwikkeling door het product van een enzymatische reactie) optreedt in de uiteindelijke vloeistof in de well. Door de optische verandering kan de hoeveelheid analyt worden gemeten via een zogenoemde kwantitatieve “aflezing”. Voor de kwantitatieve aflezing wordt een spectrofotometer, fluorometer of luminometer gebruikt om de intensiteit van het doorgelaten licht te detecteren en te meten. De detectiegevoeligheid wordt beïnvloed door de versterking van het signaal tijdens de analytische reacties. Omdat enzymreacties goed onderzochte en betrouwbare versterkingsprocessen zijn, worden enzymen gebruikt om het signaal te genereren. De enzymen worden in vaste verhoudingen aan de detectiereagentia gekoppeld om een nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken, wat ook de naam “enzymgekoppelde” immunosorbenttest verklaart.
Omdat ELISA-assays worden uitgevoerd in microtiterplaten / 96-wellsplaten, staat ELISA bekend als een plaatgebaseerde assaytechniek. Deze wordt bijv. gebruikt in de klinische in-vitrodiagnostiek, onderzoek en geneesmiddelenontwikkeling enz. voor het detecteren en kwantificeren van antilichamen, peptiden, eiwitten en hormonen.
De ELISA-techniek wordt vaak gebruikt als diagnostisch hulpmiddel in de geneeskunde, biotechnologie en plantenziektekunde en is ook een belangrijke kwaliteitscontrolemeting in verschillende industrieën.
Het ultrasone apparaat VialTweeter voor monstervoorbereiding wordt gebruikt voor cellyse en eiwitextractie voorafgaand aan ELISA-assays
Ultrasone monstervoorbereiding voorafgaand aan ELISA
Voordat de ELISA-assay kan worden uitgevoerd, moeten de monsters voorbereidende stappen ondergaan, zoals cellyse en extractie van intracellulaire eiwitten, DNA, RNA enz. Het voordeel van ultrasone cellyse en eiwitisolatie is de hoge efficiëntie, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid. Al deze factoren zijn belangrijk om hoogwaardige diagnostiek en onderzoeksresultaten te verkrijgen
- Homogene monsterbehandeling
- Volledige lyse
- Volledige eiwitextractie (bijv. antilichamen, DNA)
- Optimale afstemming op het celtype
- Voor elke monstergrootte
- Reproduceerbaar
- Temperatuurgecontroleerd
- Automatische gegevensregistratie op SD-kaart
Protocol voor ultrasone cellyse voorafgaand aan ELISA
- Voor celculturen: Centrifugeer de cellen vóór de ultrasone cellyse gedurende 5 min bij 270 x g in een microcentrifuge. Verwijder het supernatant door aspiratie en resuspendeer de cellen in 30 – 100 μL RIPA-buffer. Incubeer vervolgens de celpellet gedurende 30 min op ijs.
- Het celmonster is nu klaar voor ultrasone lyse:
Gebruik een ultrasone sonicator met sonde (bijv. UP200Ht met S26d2-sonde) of een ultrasoon apparaat voor meerdere monsters (bijv. VialTweeter voor gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 monsterflesjes of de UIP400MPT voor microtiterplaten / 96-wellsplaten), afhankelijk van het aantal monsters dat u moet voorbereiden.
Plaats voor de sonicatie van één monster met een sonde de cellen in microcentrifugebuisjes van 1,5 mL. - Stel vooraf de sonicatieduur, totale energietoevoer, cyclusmodus en/of temperatuurgrenzen in het digitale menu van de ultrasone sonicator in. Dit zorgt voor een zeer betrouwbare sonicatie en herhaalbaarheid.
- Breng de sonotrode in het monster en schakel het ultrasone apparaat in. Beweeg de microtip van de ultrasone sonde voorzichtig door het monster om het gelijkmatig te soniceren.
Voor de meeste cellen is de ultrasone lyse voltooid na 2 – 4 cycli van 10 sec sonicatie. - Verwijder na de sonicatie de sonotrode uit het monster. De monsters moeten gedurende 5 min op ijs worden geïncubeerd. Centrifugeer vervolgens gedurende 20 min bij 10.000 x g om de celresten als pellet neer te slaan. Breng de supernatanten over in een nieuw microcentrifugebuisje. Label de analyten en bewaar ze bij -20°C.
- De ultrasone sonotrode kan worden gereinigd door deze grondig met alcohol af te nemen of te soniceren in een bekerglas gevuld met alcohol, bijv. 70% ethanol. Alle ultrasone sondes van titanium kunnen worden geautoclaveerd.
Eiwitextractie uit cellen van E.coli met de ultrasone sonde UP200St
- Spoel het weefsel met ijskoude PBS (0,01M, pH=7,4) om overtollig gehemolyseerd bloed grondig te verwijderen.
- Weeg het weefsel (nier, hart, long, milt enz.) en macereer het tot kleine stukjes, die in PBS worden gehomogeniseerd. Het benodigde volume PBS hangt samen met het gewicht van het weefsel. Als vuistregel is voor 1g weefsel ongeveer 9mL PBS nodig. Het wordt aanbevolen om een proteaseremmer aan de PBS toe te voegen. (Als alternatief kan RIPA of een hypotone lysisbuffer met een cocktail van protease- en fosfataseremmers worden gebruikt.)
- Afhankelijk van de weefselgrootte kan een korte vortexbehandeling (ongeveer 1–2 min. in pulsen van 15 sec.) nuttig zijn om het weefsel voor te behandelen.
- Monteer een microtip, bijv. S26d2, op uw ultrasone sonicator. Plaats het monsterbuisje met het weefsel in een ijsbad.
- Soniceer het monster met uw ultrasone sonicator, bijv. UP200St (80% amplitude), gedurende 1 min. in pulsmodus (15sec aan, 15sec pauze). Houd het monster in het ijsbad.
- De homogenaten worden vervolgens gecentrifugeerd om specifieke fracties (cytosolisch, nucleair, mitochondriaal of lysosomaal) te verkrijgen en zo het eiwit voor analyse aan te rijken. Door het monster gedurende 5 minuten bij 5000×g te centrifugeren, wordt het supernatant verkregen.
De sonotrode MTP-24-8-96 heeft acht ultrasone sondes voor de sonicatie van de wells van microtiterplaten.
Betrouwbare temperatuurregeling tijdens sonicatie
Temperatuur is een cruciale factor die het proces beïnvloedt en vooral belangrijk is bij de behandeling van biologische monsters, bijv. om thermische afbraak van eiwitten te voorkomen. Net als alle mechanische technieken voor monstervoorbereiding genereert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden geregeld met de apparaten van Hielscher Ultrasonics. Wij presenteren verschillende mogelijkheden om de temperatuur van uw monsters te monitoren en te regelen terwijl u ze voorafgaand aan de analyse voorbereidt met een ultrasone sonicator met sonde of de VialTweeter.
- De monstertemperatuur monitoren: Alle digitale ultrasone processors van Hielscher zijn uitgerust met intelligente software en een aansluitbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op het ultrasone apparaat (bijv. UP200Ht, UP200St, VialTweeter, sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten) en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuisjes. Via het digitale kleurentouchscreen kunt u in het menu van de ultrasone processor een specifiek temperatuurbereik voor de sonicatie van uw monsters instellen. De ultrasone sonicator stopt automatisch wanneer de maximale temperatuur is bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de onderste waarde van het ingestelde temperatuurbereik ∆. Daarna start de sonicatie automatisch opnieuw. Deze slimme functie voorkomt afbraak door warmte.
- Bij het ultrasone apparaat VialTweeter voor meerdere monsters kan het titaniumblok dat de monsterbuisjes vasthoudt vooraf worden gekoeld. Plaats het blok van de VialTweeter (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblok vooraf te koelen. Dit helpt de temperatuurstijging in het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan ook het monster zelf vooraf worden gekoeld.
- Gebruik een ijsbad of droogijs om tijdens de sonicatie te koelen. Plaats uw monsterbuisje(s) tijdens de sonicatie in een ijsbad. Gebruik voor de VialTweeter een ondiepe bak gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs, zodat de warmte snel kan worden afgevoerd.
Klanten wereldwijd gebruiken de ultrasone sonicators met sonde van Hielscher en de sonicatieapparaten VialTweeter en UIP400MTP voor meerdere monsters voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Dankzij de intelligente software en temperatuurregeling van de processors van Hielscher wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt afbraak van monsters door warmte voorkomen. Ultrasone monstervoorbereiding met ultrasone oplossingen van Hielscher levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!
Lees meer over sonicatie met een hoge verwerkingscapaciteit voor monsters met de sonicator UIP400MTP voor multiwellplaten voor assays!
Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!
Hielscher Ultrasonics produceert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties voor mengtoepassingen, dispersie, emulgering en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.
Literatuur / Referenties
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Wetenswaardigheden
Welke soorten ELISA zijn er?
Er zijn verschillende soorten ELISA, die worden onderscheiden op basis van hun werkingsprincipe. Ze staan bekend als directe ELISA, indirecte ELISA, sandwich-ELISA, competitieve ELISA en omgekeerde ELISA. Hieronder presenteren wij een overzicht van de verschillende soorten ELISA en hun belangrijkste kenmerken en verschillen.
ELISA kan kwalitatief of kwantitatief worden uitgevoerd. Kwalitatieve resultaten geven eenvoudigweg een positief of negatief resultaat, terwijl bij kwantitatieve ELISA de optische dichtheid (OD) van het monster wordt vergeleken met een standaardcurve. Deze is doorgaans gebaseerd op een seriële verdunning van een oplossing van het doelmolecuul met een bekende concentratie.
Directe ELISA
De directe ELISA is de eenvoudigste assayvorm van ELISA, waarbij alleen een enzymgelabeld primair antilichaam wordt gebruikt en secundaire antilichamen niet nodig zijn. Het enzymgelabelde primaire antilichaam bindt rechtstreeks aan het doelwit, d.w.z. het antigeen. De gebufferde antigeenoplossing wordt toegevoegd aan elke well van een microtiterplaat (gewoonlijk 96-wellsplaten, ELISA-platen), waar het antigeen door ladingsinteracties aan het kunststofoppervlak hecht. Wanneer het enzym dat aan het primaire antilichaam is gekoppeld met zijn substraat reageert, produceert het een zichtbaar signaal dat met een spectrofotometer, fluorometer of luminometer kan worden gemeten.
Indirecte ELISA
Voor de indirecte ELISA-test zijn zowel een primair als een secundair antilichaam nodig. In tegenstelling tot de directe ELISA wordt echter het secundaire antilichaam in plaats van het primaire antilichaam met een enzym gelabeld. Het antigeen wordt op de wellsplaat geïmmobiliseerd en door het primaire antilichaam gebonden. Vervolgens bindt het enzymgelabelde secundaire antilichaam aan het primaire antilichaam. Ten slotte reageert het enzym dat aan het secundaire antilichaam is gekoppeld met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat kan worden gedetecteerd.
Sandwich-ELISA
Terwijl bij directe en indirecte ELISA-tests het antigeen wordt geïmmobiliseerd en als coating op het oppervlak van de wellsplaat wordt aangebracht, wordt bij sandwich-ELISA het antilichaam op het kunststofoppervlak van de ELISA-plaat geïmmobiliseerd. De geïmmobiliseerde antilichamen bij sandwich-ELISA staan bekend als vangantilichamen. Naast de vangantilichamen zijn bij sandwich-ELISA ook zogenoemde detectieantilichamen nodig. Detectieantilichamen omvatten een ongelabeld primair detectieantilichaam en een enzymgelabeld secundair detectieantilichaam.
Stapsgewijs bindt het antigeen van interesse aan het vangantilichaam dat op de plaat is geïmmobiliseerd. Vervolgens bindt het primaire detectieantilichaam aan het antigeen. Daarna bindt het secundaire detectieantilichaam aan het primaire detectieantilichaam. In de laatste reactiestap reageert het enzym met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat optisch kan worden gedetecteerd.
Competitieve ELISA
Competitieve ELISA, ook bekend als inhibitie-ELISA, is het meest complexe ELISA-type omdat hierbij een remmend antigeen wordt gebruikt. Elk van de drie vormen, directe, indirecte en sandwich-ELISA, kan worden aangepast aan de competitieve ELISA-vorm. Bij competitieve ELISA concurreren het remmende antigeen en het antigeen van interesse om binding aan het primaire antilichaam.
Voor competitieve ELISA wordt een ongelabeld antilichaam geïncubeerd in aanwezigheid van zijn antigeen, d.w.z. het monster. Deze gebonden antilichaam/antigeencomplexen worden vervolgens toegevoegd aan een well met een antigeencoating.
De plaat wordt gewassen, zodat ongebonden antilichamen worden verwijderd. Competitieve ELISA dankt zijn naam aan het feit dat er meer antigeen-antilichaamcomplexen worden gevormd naarmate er meer antigeen in het monster aanwezig is. Dit betekent dat er minder ongebonden antilichamen beschikbaar zijn om aan het antigeen in de well te binden en dat de antigenen moeten concurreren om een beschikbaar antilichaam. Er wordt een secundair antilichaam toegevoegd dat bij het primaire antilichaam past. Dit tweede antilichaam is gekoppeld aan het enzym. Wanneer het substraat wordt toegevoegd, produceren de resterende enzymen een chromogeen of fluorescent signaal.
Op dit punt wordt de reactie gestopt om uiteindelijke verzadiging van het signaal te voorkomen.
Sommige competitieve ELISA-kits bevatten een enzymgekoppeld antigeen in plaats van een enzymgekoppeld antilichaam. Het gelabelde antigeen concurreert met het monsterantigeen (ongelabeld) om bindingsplaatsen op het primaire antilichaam. Hoe minder antigeen er in het monster aanwezig is, hoe meer gelabeld antigeen in de well wordt vastgehouden en hoe sterker het signaal.
Omgekeerde ELISA
Omgekeerde ELISA gebruikt geen wellsplaten, maar laat de antigenen gesuspendeerd in de testvloeistof. De omgekeerde ELISA-test meet de hoeveelheid gebonden antilichaam via het antigeen. Deze werd specifiek ontwikkeld om het envelopeiwit van het Westnijlvirus te detecteren en te onderzoeken, evenals hoe het virusspecifieke antilichamen kan vinden.
Welke enzymatische markers worden voor ELISA gebruikt?
De onderstaande lijst geeft de meest gebruikte enzymatische markers in ELISA-assays, waarmee de resultaten van de assay na voltooiing kunnen worden gemeten.
- OPD (o-fenyleendiaminedihydrochloride) kleurt amberkleurig bij de detectie van HRP (mierikswortelperoxidase), dat vaak als geconjugeerd eiwit wordt gebruikt.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) kleurt blauw bij de detectie van HRP en kleurt geel na toevoeging van zwavelzuur of fosforzuur.
- ABTS (diammoniumzout van 2,2′-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur]) kleurt groen bij de detectie van HRP.
- PNPP (p-nitrofenylfosfaat, dinatriumzout) kleurt geel bij de detectie van alkalische fosfatase.