Ultrasone monstervoorbereiding voor ELISA-tests
Assays zoals ELISA worden veel gebruikt voor in-vitrodiagnostiek, detectie van ziektegerelateerde eiwitten en kwaliteitscontrole (bijv. bewaking van voedselallergenen). Ultrasone monstervoorbereiding is een snelle, betrouwbare en reproduceerbare techniek om cellen te lyseren en intracellulaire eiwitten, DNA, RNA en organellen te isoleren. Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone oplossingen voor het eenvoudig prepareren van afzonderlijke monsters, meerdere flacons en voor microtiterplaten en 96-wells platen.
ELISA – Enzymgekoppelde Immunosorbent Assay
ELISA staat voor enzyme-linked immunosorbent assay en is een veelgebruikte biochemische analysetechniek in de categorie van ligand-bindende assays. Bij ELISA wordt een vloeibaar monster toegevoegd aan een stationaire vaste fase met speciale bindende eigenschappen. Normaal gesproken wordt de stationaire vaste fase als coating aangebracht op een well-plaat of ELISA-plaat. Vervolgens worden achtereenvolgens verschillende vloeibare reagentia toegevoegd, geïncubeerd en gewassen, zodat uiteindelijk een optische verandering (bijvoorbeeld kleurontwikkeling door het product van een enzymatische reactie) optreedt in de uiteindelijke vloeistof in de well. De optische verandering maakt het mogelijk om de hoeveelheid van de analyt te meten met een zogenaamde kwantitatieve methode. “reading”. For the quantitative reading, a spectrophotometer, fluorometer, or luminometer is used to detect and measure the intensity of the transmitted light. The sensitivity of detection is influenced by the amplification of the signal during the analytic reactions. Since enzyme reactions are well investigated and reliable amplification processes, enzymes are used to create the signal. The enzymes are linked to the detection reagents in fixed proportions to allow accurate quantification, which explains also the name “enzymgekoppeld” immunosorbent assay.
Aangezien ELISA-tests worden uitgevoerd in microtiterplaten? 96-wells platen, staat het bekend als plate-based assay techniek en wordt het bijvoorbeeld gebruikt in klinische in-vitro diagnostiek, onderzoek, medicijnontwikkeling etc. voor het detecteren en kwantificeren van antilichamen, peptiden, eiwitten en hormonen.
De ELISA-techniek wordt vaak gebruikt als diagnostisch hulpmiddel in de geneeskunde, biotech, plantenziektekunde en is ook een belangrijke kwaliteitscontrolemeting in verschillende industrieën.
Het ultrasone monstervoorzetapparaat VialTweeter wordt gebruikt voor cellyse en eiwitextractie vóór ELISA-tests
Ultrasone monstervoorbereiding vóór ELISA
Voordat de ELISA-test kan worden uitgevoerd, moeten de monsters worden voorbereid, zoals cellyse en extractie van intracellulaire eiwitten, DNA, RNA enz. Het voordeel van ultrasone cellyse en eiwitisolatie is de hoge efficiëntie, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid. Al deze factoren zijn belangrijk om diagnostiek en onderzoeksresultaten van hoge kwaliteit te verkrijgen.
- Homogene monsterbehandeling
- Volledige lysis
- Volledige eiwitextractie (bijv. antilichamen, DNA)
- Optimale aanpassing aan celtype
- Voor elke steekproefgrootte
- reproduceerbaar
- temperatuurgeregeld
- Automatische gegevensprotocollering op SD-kaart
Protocol voor pre-ELISA ultrasone cellyse
- Voor celculturen: Centrifugeer de cellen vóór de ultrasone cellyse gedurende 5 minuten bij 270 x g in een microcentrifuge. Verwijder het supernatant door aspiratie en resuspendeer de cellen in 30 - 100 μL RIPA-buffer. Incubeer de celpellet vervolgens 30 minuten op ijs.
- Nu is het celmonster klaar voor ultrasone lysis:
Gebruik een ultrasone sonde (bijv. UP200Ht met S26d2 sonde) of een ultrasoon multi-sample apparaat (bijv. VialTweeter voor gelijktijdige sonificatie van maximaal 10 vials of de UIP400MPT voor microtiterplaten? 96-wells platen), afhankelijk van de hoeveelheid monsters die u moet bereiden.
Voor de sonde-type sonicatie van een enkel monster plaatst u de cellen in 1,5 ml microcentrifugebuizen. - Stel uw ultrasone tijdsduur, totale energie-input, cyclusmodus en/of temperatuurlimieten vooraf in het digitale menu van de ultrasoonmachine in. Dit zorgt voor zeer betrouwbare sonicatie en herhaalbaarheid.
- Breng de sonotrode aan en schakel het ultrasone apparaat in. Beweeg de microtip van de ultrasone sonde voorzichtig door het monster om het monster gelijkmatig te sonificeren.
Voor de meeste cellen is de ultrasone lysis voltooid na 2 -4 cycli van 10 seconden sonicatie. - Verwijder na de sonicatie de sonotrode van het monster. De monsters moeten 5 minuten op ijs worden geïncubeerd. Centrifugeer vervolgens bij 10.000 xg gedurende 20 minuten om de brokstukken te pelleteren. Breng de supernatanten over in een nieuwe microcentrifugebuis. Label de analyten en bewaar bij -20°C.
- De ultrasone sonotrode kan worden gereinigd door hem goed af te vegen met alcohol of door hem te sonificeren in een bekerglas gevuld met alcohol, bijvoorbeeld 70% ethanol. Alle ultrasone sondes van titanium zijn autoclaveerbaar.
Eiwitextractie uit E.coli-cellen met de ultrasone sonde UP200St
- Spoel het weefsel met ijskoud PBS (0,01M, pH=7,4) om overtollig hemolysebloed grondig te verwijderen.
- Weeg het weefsel (nier, hart, long, milt enz.) en macereer het in kleine stukjes, die gehomogeniseerd worden in PBS. Het benodigde volume PBS is gerelateerd aan het gewicht van het weefsel. Als vuistregel geldt dat voor 1 g weefsel ongeveer 9 ml PBS nodig is. Het wordt aanbevolen om wat proteaseremmer aan de PBS toe te voegen. (Als alternatief kan RIPA of hypotone lysisbuffer met protease- en fosfataseremmercocktail worden gebruikt).
- Afhankelijk van de grootte van het weefsel kan een korte vortexbehandeling (ongeveer 1-2 min. in pulsen van 15 sec.) nuttig zijn om het weefsel voor te behandelen.
- Bevestig een microtip, bijv. S26d2, op uw ultrasoonapparaat. Plaats de monsterbuis met het weefsel in een ijsbad.
- Sonificeer het monster met uw ultrasoonapparaat, bijvoorbeeld UP200St (80% amplitude) gedurende 1 minuut in pulsmodus (15 seconden aan, 15 seconden pauze). Houd het monster in het ijsbad.
- De homogenaten worden vervolgens gecentrifugeerd om specifieke groepen te verkrijgen (cytosolisch, nucleair, mitochondriaal of lysosomaal) om het eiwit voor analyse te verrijken. Door het monster 5 minuten te centrifugeren bij 5000×g wordt het supernatant opgevangen.
De sonotrode MTP-24-8-96 heeft acht ultrasone sondes voor de sonicatie van de wells van microtiterplaten.
Betrouwbare temperatuurregeling tijdens Sonicatie
Temperatuur is een cruciale procesbeïnvloedende factor die vooral belangrijk is voor de behandeling van biologische monsters, bijvoorbeeld om thermische degradatie van eiwitten te voorkomen. Net als alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken creëert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed onder controle worden gehouden met de Hielscher ultrasoonapparaten. We bieden u verschillende opties om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te regelen terwijl u ze pre-analytisch prepareert met een ultrasone sonde of de VialTweeter.
- Bewaking van de monstertemperatuur: Alle Hielscher digitale ultrasoonprocessoren zijn uitgerust met intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Steek de temperatuursensor in het ultrasone apparaat (bijv, UP200Ht, UP200St, VialTweeter, Multi-well platen sonicator UIP400MTP) en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via het digitale gekleurde touch-display kunt u in het menu van de ultrasoonprocessor een specifiek temperatuurbereik instellen voor de sonicatie van uw monster. De ultrasone processor stopt automatisch wanneer de maximumtemperatuur is bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Dan start de sonicatie automatisch opnieuw. Daarna start de sonicatie automatisch opnieuw. Deze slimme functie voorkomt door warmte veroorzaakte degradatie.
- Bij het ultrasone multimonsterapparaat VialTweeter kan het titanium blok waarin de monsterbuizen zitten, worden voorgekoeld. Door het VialTweeter-blok (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer te leggen om het titanium blok voor te koelen, wordt temperatuurstijging in het monster uitgesteld. Indien mogelijk kan het monster zelf ook worden voorgekoeld.
- Gebruik een ijsbad of droog ijs om te koelen tijdens sonicatie. Plaats de monsterbuisjes tijdens de sonicatie in een ijsbad. Gebruik voor de VialTweeter een ondiep bakje gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs zodat de warmte snel afgevoerd kan worden.
Klanten wereldwijd gebruiken de Hielscher ultrasoonapparaten van het probe-type en de multi-sample sonication units VialTweeter en UIP400MTP voor hun dagelijkse monstervoorbereidingswerkzaamheden in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Dankzij de intelligente software en temperatuurregeling van de Hielscher processors wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt door warmte veroorzaakte degradatie van monsters voorkomen. Ultrasone monstervoorbereiding met Hielscher ultrasoonoplossingen levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!
Lees meer over sonicatie met hoge verwerkingscapaciteit met de multi-well plaat sonicator UIP400MTP voor assays!
Neem contact met ons op!? Vraag het ons!
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren voor mengtoepassingen, dispergeren, emulgeren en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.
Literatuur? Referenties
- Brandy Verhalen , Stefan Ernst, Michael Börsch, Stephan Wilkens (2012): Dynamic Ligand-induced Conformational Rearrangements in P-glycoprotein as Probed by Fluorescence Resonance Energy Transfer Spectroscopy. J Biol Chem. 2012 Jan 6;287(2): 1112-27.
- Claudia Lindemann, Nataliya Lupilova, Alexandra Müller, Bettina Warscheid, Helmut E. Meyer, Katja Kuhlmann, Martin Eisenacher, Lars I. Leichert (2013): Redox Proteomics Uncovers Peroxynitrite-Sensitive Proteins that Help Escherichia coli to Overcome Nitrosative Stress. J Biol Chem. 2013 Jul 5; 288(27): 19698–19714.
- Elahe Motevaseli, Mahdieh Shirzad, Seyed Mohammad Akrami, Azam-Sadat Mousavi, Akbar Mirsalehian, Mohammad Hossein Modarressi (2013): Normal and tumour cervical cells respond differently to vaginal lactobacilli, independent of pH and lactate. ed. Microbiol. 2013 Jul; 62(Pt 7):1065-1072.
- Nico Böhmer, Andreas Dautel, Thomas Eisele, Lutz Fischer (2012): Recombinant expression, purification and characterisation of the native glutamate racemase from Lactobacillus plantarum NC8. Protein Expr Purif. 2013 Mar;88(1):54-60.
Wetenswaardigheden
Welke soorten ELISA's zijn er?
Er zijn verschillende soorten ELISA's die zich onderscheiden door hun werkingsprincipe. Ze staan bekend als directe ELISA, indirecte ELISA, sandwich ELISA, competitie ELISA en omgekeerde ELISA. Hieronder geven we een overzicht van de verschillende ELISA-typen en hun belangrijkste kenmerken en verschillen.
ELISA's kunnen kwalitatief of kwantitatief worden uitgevoerd. Kwalitatieve resultaten geven een eenvoudig positief of negatief resultaat, terwijl bij kwantitatieve ELISA de optische dichtheid (OD) van het monster wordt vergeleken met een standaardcurve, die meestal een seriële verdunning is van een oplossing met een bekende concentratie van het doelmolecuul.
Directe ELISA
De directe ELISA is de meest eenvoudige testvorm van Elisa, waarbij alleen een met een enzym gelabeld primair antilichaam wordt gebruikt en geen secundaire antilichamen nodig zijn. Het enzymgelabelde primaire antilichaam bindt direct aan het doelwit, d.w.z. het antigeen. De gebufferde antigeenoplossing wordt toegevoegd aan elk putje van een microtiterplaat (meestal 96-wellsplaten, ELISA-platen), waar het zich door ladingsinteracties aan het plastic oppervlak hecht. Wanneer het enzym dat gekoppeld is aan het primaire antilichaam reageert met zijn substraat, produceert het een zichtbaar signaal dat gemeten kan worden met een spectrofotometer, fluorometer of luminometer.
Indirecte ELISA
Voor de indirecte ELISA-test zijn zowel een primair antilichaam als een secundair antilichaam nodig. In tegenstelling tot de directe ELISA wordt echter niet het primaire antilichaam, maar het secundaire antilichaam gelabeld met een enzym. Het antigeen wordt geïmmobiliseerd op de plaat met putjes en gebonden door het primaire antilichaam. Vervolgens bindt het met een enzym gelabelde secundaire antilichaam aan het primaire antilichaam. Tot slot reageert het enzym dat aan het secundaire antilichaam is gekoppeld met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat kan worden gedetecteerd.
Sandwich ELISA
Terwijl bij directe en indirecte ELISA-tests het antigeen geïmmobiliseerd en gecoat is op het oppervlak van de plaat met putjes, is bij de sandwich ELISA het antilichaam geïmmobiliseerd op het plastic oppervlak van de ELISA-plaat. De geïmmobiliseerde antilichamen in sandwich-Elisa staan bekend als capture antilichamen. Naast de vangstantilichamen zijn in sandwich-ELISA ook zogenaamde detectieantilichamen nodig. Detectieantilichamen omvatten een ongelabeld primair detectieantilichaam en een enzymgelabeld secundair detectieantilichaam.
Stap voor stap bindt het gewenste antigeen aan het capture antilichaam dat op de plaat is geïmmobiliseerd. Vervolgens bindt het primaire detectieantilichaam aan het antigeen. Daarna bindt het secundaire detectieantilichaam aan het primaire detectieantilichaam. In de laatste reactiestap reageert het enzym met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat optisch kan worden gedetecteerd.
Concurrerende ELISA
Competitieve ELISA, ook bekend als inhibitie-ELISA, is het meest complexe ELISA-type omdat hierbij een inhibitorantigeen wordt gebruikt. Elk van de drie formaten, directe, indirecte en sandwich ELISA, kan worden aangepast aan het competitieve ELISA-formaat. Bij competitie-ELISA concurreren het inhibitorantigeen en het antigeen van interesse om binding met het primaire antilichaam.
Bij competitie-Elisa wordt ongelabeld antilichaam geïncubeerd in aanwezigheid van het antigeen, d.w.z. het monster. Deze gebonden antilichaam/antigeencomplexen worden vervolgens toegevoegd aan een met antigeen gecoate well.
De plaat wordt gewassen, zodat ongebonden antilichamen worden verwijderd. Competitieve ELISA heeft zijn naam te danken aan het feit dat hoe meer antigeen er in het monster zit, hoe meer antigeen-antilichaamcomplexen er worden gevormd. Dit betekent dat er minder ongebonden antilichamen beschikbaar zijn om te binden aan het antigeen in de well en dat de antigenen moeten concurreren om een beschikbaar antilichaam. Een secundair antilichaam, dat overeenkomt met het primaire antilichaam, wordt toegevoegd. Dit tweede antilichaam is gekoppeld aan het enzym. Wanneer het substraat wordt toegevoegd, produceren de resterende enzymen een chromogeen of fluorescerend signaal.
Op dit punt wordt de reactie gestopt om de uiteindelijke verzadiging van het signaal te voorkomen.
Sommige competitieve ELISA-kits bevatten een enzymgekoppeld antigeen in plaats van een enzymgekoppeld antilichaam. Het gelabelde antigeen concurreert om de primaire antilichaambindingsplaatsen met het antigeen van het monster (ongelabeld). Hoe minder antigeen in het monster, hoe meer gelabeld antigeen wordt vastgehouden in de well en hoe sterker het signaal.
Omgekeerde ELISA
Bij omgekeerde ELISA worden geen plaatjes met putjes gebruikt, maar blijven de antigenen in suspensie in de testvloeistof. De omgekeerde ELISA-test meet de hoeveelheid gebonden antilichaam via het antigeen. De test is speciaal ontwikkeld om het enveloppe-eiwit van het West-Nijlvirus op te sporen en te onderzoeken en hoe het in staat is om virus-specifieke antilichamen te vinden.
Welke enzymatische markers worden gebruikt voor ELISA?
De onderstaande lijst bevat de meest gebruikte enzymatische markers in ELISA-tests, waarmee de resultaten van de test na voltooiing gemeten kunnen worden.
- OPD (o-fenyleendiaminedihydrochloride) kleurt amberkleurig om HRP (mierikswortelperoxidase) te detecteren, dat vaak wordt gebruikt als een geconjugeerd eiwit.
- TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) wordt blauw bij het detecteren van HRP en wordt geel na toevoeging van zwavelzuur of fosforzuur.
- ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur]-diammoniumzout) wordt groen bij het detecteren van HRP.
- PNPP (p-Nitrofenylfosfaat, Dinatriumzout) wordt geel bij het detecteren van alkalische fosfatase.