Hielscher Echografietechniek

Ultrasone monstervoorbereiding voor ELISA-assays

Assays zoals ELISA worden veel gebruikt voor in-vitrodiagnostiek, ziektegerelateerde eiwitdetectie en kwaliteitscontrole (bijvoorbeeld het monitoren van voedselallergenen). Ultrasone monstervoorbereiding is een snelle, betrouwbare en reproduceerbare techniek om cellen te lyseren en intracellulaire eiwitten, DNA, RNA en organellen te isoleren. Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone oplossingen voor de gemakkelijke bereiding van enkele monsters, meerdere flacons en voor microtiterplaten en 96-wellsplaten.

ELISA – Enzymgekoppelde immuunremmende test

ELISA staat voor enzyme-linked immunosorbent assay en is een veelgebruikte biochemische analysetechniek van de categorie ligandbindende assays. Bij ELISA wordt een vloeibaar monster toegevoegd aan een stationaire vaste fase met speciale bindingseigenschappen. Normaal gesproken wordt de stationaire vaste fase als coating op een putplaat of ELISA-plaat aangebracht. Vervolgens worden verschillende vloeibare reagentia achtereenvolgens toegevoegd, geïncubeerd en gewassen, zodat uiteindelijk een optische verandering (bijv. kleurontwikkeling door het product van een enzymatische reactie) optreedt in de uiteindelijke vloeistof in de put. De optische verandering maakt het mogelijk om de hoeveelheid van de analyt te meten met behulp van een zogenaamd kwantitatief “lezen". Voor de kwantitatieve meting wordt een spectrofotometer, fluorometer of luminometer gebruikt om de intensiteit van het doorgelaten licht te detecteren en te meten. De gevoeligheid van de detectie wordt beïnvloed door de versterking van het signaal tijdens de analytische reacties. Aangezien enzymreacties goed worden onderzocht en betrouwbare versterkingsprocessen worden gebruikt, worden enzymen gebruikt om het signaal te creëren. De enzymen worden in vaste verhoudingen aan de detectiereagentia gekoppeld om een nauwkeurige kwantificering mogelijk te maken, wat ook de naam "enzyme-linked" immunosorbent assay verklaart.
Aangezien ELISA-tests worden uitgevoerd in microtiterplaten / 96-wellsplaten, staat het bekend als plaatgebaseerde assay-techniek en wordt het bijvoorbeeld gebruikt in klinische in-vitro diagnostiek, onderzoek, geneesmiddelenontwikkeling, enz. voor het opsporen en kwantificeren van antilichamen, peptiden, proteïnen en hormonen.
De ELISA-techniek wordt vaak gebruikt als diagnostisch hulpmiddel in de geneeskunde, de biotechnologie en de plantenpathologie en is ook een belangrijke kwaliteitscontrolemeting in meerdere industrieën.

Compleet VialTweeter setup: VialTweeter sonotrode bij ultrasone processor UP200St

De ultrasone monstervoorbereidingseenheid VialTweeter wordt gebruikt voor cellyse en eiwitextractie vóór ELISA-tests

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Ultrasoon monstervoorbereiding voor ELISA

Voordat de ELISA-test kan worden uitgevoerd, vereisen de monsters stappen van voorbereiding zoals cellyse en extractie van intracellulaire eiwitten, DNA, RNA, enz. Het voordeel van ultrasone cellyse en eiwitisolatie is het hoge rendement, de betrouwbaarheid en de reproduceerbaarheid. Al deze factoren zijn belangrijk voor het verkrijgen van hoogwaardige diagnostiek en onderzoeksresultaten.

Voordelen van Ultrasone Lyse voor ELISA

  • Homogene monsterbehandeling
  • Volledige lysis
  • Volledige eiwitextractie (bijv. antilichamen, DNA)
  • Optimale aanpassing aan het celtype
  • Voor elke monstergrootte
  • reproduceerbare
  • Temperatuur-gecontroleerde
  • Automatische dataprotocolering op SD-kaart

Protocol voor Pre-ELISA ultrasone celanalyse

Probe-type insonifier UP200St lyse

  • Voor celculturen: Voor de ultrasone cellyse, centrifugeer de cellen gedurende 5 min. bij 270 x g in een microcentrifuge. Verwijder het supernatant door aspiratie en resuspendeer de cellen in 30 - 100 μL RIPA-buffer. Vervolgens incubeer de celpellet op ijs gedurende 30 min.
  • Nu is het celmonster klaar voor ultrasone lysis:
    Gebruik een ultrasonicator van het type sonde (bijv. Uf200 ः t met S26d2 sonde) of een ultrasoon multi-sample apparaat (bijv. VialTweeter voor gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 flacons of de UIP400MPT voor microtiterplaten / 96-wellsplaten), afhankelijk van de hoeveelheid monsters die u moet voorbereiden.
    Voor de sonde-type sonicatie van een enkel monster, plaats de cellen in 1,5 mL microcentrifugebuizen.
  • Stel in het digitale menu van de ultrasonicator uw ultrasone duur, totale energie-input, cyclusmodus en/of temperatuurlimieten vooraf in. Dit zorgt voor een zeer betrouwbare geluidsweergave en herhaalbaarheid.
  • Zet de sonotrode in en schakel het ultrasone apparaat in. Beweeg de micro-tip van de ultrasone sonde voorzichtig door het monster om het monster gelijkmatig te soniceren.
    Voor de meeste cellen zal de ultrasone lyse worden voltooid na 2 -4 cycli van 10 sec sonicatie.
  • Verwijder de sonotrode na de sonicatie uit het monster. De monsters moeten gedurende 5 minuten op ijs worden geïncubeerd. Centrifugeer vervolgens bij 10.000 x g gedurende 20 minuten om het puin te pelleteren. Breng de supernatanten over naar een nieuwe microcentrifugeerbuis. Etiketteer de analyten en bewaar ze bij -20°C.
  • De ultrasone sonotrode kan worden gereinigd door deze goed af te vegen met alcohol of sonicaat in een bekerglas gevuld met alcohol, bijvoorbeeld 70% ethanol. Alle ultrasone sondes van titanium zijn autoclaveerbaar.

Voor weefselhomogenaten:

  • Spoel het weefsel met ijskoude PBS (0,01M, pH = 7,4) om het overtollige hemolysebloed grondig te verwijderen.
  • Weeg het weefsel (nier, hart, long, milt etc.) en macerateer het in kleine stukjes, die gehomogeniseerd zijn in PBS. Het benodigde volume PBS is gerelateerd aan het gewicht van het weefsel. Als vuistregel geldt dat voor 1g weefsel ongeveer 9mL PBS nodig is. Het wordt aanbevolen om wat proteaseremmer toe te voegen aan de PBS. (RIPA of hypotone lysisbuffer met protease en fosfataseremmende cocktail kan als alternatief worden gebruikt).
  • Afhankelijk van de grootte van het weefsel kan een korte vortexbehandeling (ca. 1-2 min. in 15 sec. pulsen) nuttig zijn om het weefsel voor te behandelen.
  • Monteer een micro-tip, bijv. S26d2, aan uw ultrasonicator. Plaats het monsterbuisje met het weefsel in een ijsbad.
  • Sonificeer het monster met uw ultrasonicator, bijv. UP200St (80% amplitude) gedurende 1 min. in de pulsmodus (15 sec. aan, 15 sec. pauze). Bewaar het monster in het ijsbad.
  • De homogenaten worden vervolgens gecentrifugeerd om specifieke pools te verkrijgen (cytosolisch, nucleair, mitochondriaal of lysosomaal) om het eiwit te verrijken voor analyse. Door het monster 5 minuten te centrifugeren bij 5000×g wordt het supernatant opgehaald.
De sonotrode MTP-24-8-96 heeft acht ultrasone sondes voor de sonificatie van de putten van microtiterplaten.

De sonotrode MTP-24-8-96 heeft acht ultrasone sondes voor de sonificatie van de putten van microtiterplaten.

Betrouwbare temperatuurregeling tijdens Sonication

Temperatuur is een cruciale procesbeïnvloedende factor die vooral belangrijk is voor de behandeling van biologische monsters, bijvoorbeeld om thermische afbraak van eiwitten te voorkomen. Zoals alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken, creëert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed gecontroleerd worden bij gebruik van de Hielscher Ultrasonics apparaten. Wij presenteren u verschillende mogelijkheden om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te controleren terwijl u ze voorbereidt met de ultrasone ultrasone sonde of de VialTweeter preanalytisch.

  1. Bewaking van de monstertemperatuur: Alle Hielscher digitale ultrasone processoren zijn uitgerust met een intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op het ultrasone apparaat (bijv, Uf200 ः t, UP200St, VialTweeterUIP400MTP) en plaats het uiteinde van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via een digitaal gekleurd touch-display kunt u in het menu van de ultrasone processor een specifiek temperatuurbereik voor uw monstername-sonicatie instellen. De ultrasone processor stopt automatisch wanneer de maximale temperatuur is bereikt en pauzeert totdat de temperatuur van het monster is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Daarna start de ultrasone processor automatisch weer. Deze slimme functie voorkomt warmte-inducerende degradatie.
  2. Met betrekking tot de ultrasone multi-sample unit VialTweeter kan het titanium blok, dat de monsterbuizen vasthoudt, voorgekoeld worden. Plaats het VialTweeter-blokje (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblokje voor te koelen en zo de temperatuurstijging van het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan het monster zelf ook voorgekoeld worden.
  3. Gebruik een ijsbad of droogijs om af te koelen tijdens de sonicatie. Plaats uw monsterbuisje(s) tijdens het soneren in een ijsbad. Gebruik voor de VialTweeter een ondiep bakje gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs zodat de warmte snel kan worden afgevoerd.

Klanten gebruiken wereldwijd de Hielscher sonde-ultrasonicators en de multi-sample sonication units VialTweeter en UIP400MTP voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Door de intelligente software en de temperatuurregeling van de Hielscher-processoren wordt de temperatuur betrouwbaar gecontroleerd en wordt door warmte veroorzaakte monsterafbraak vermeden. Ultrasone monstervoorbereiding met Hielscher ultrasone oplossingen levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!

Neem contact met ons op! / Vraag ons!

Vraag voor meer informatie

Gebruik het onderstaande formulier om aanvullende informatie aan te vragen over ultrasone processoren, toepassingen en prijs. Wij bespreken graag uw proces met u en bieden u een ultrasoon systeem aan dat aan uw eisen voldoet!









Let op onze Privacybeleid.


Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren voor mengtoepassingen, dispersie, emulsificatie en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.

Literatuur / Referenties



Feiten die de moeite waard zijn om te weten

Soorten ELISA's

Er zijn verschillende soorten ELISA's, die zich onderscheiden door hun werkingsprincipe. Ze staan bekend als directe ELISA, indirecte ELISA, sandwich ELISA, competitieve ELISA en omgekeerde ELISA. Hieronder geven wij u een overzicht van de verschillende typen ELISA's en hun belangrijkste kenmerken en verschillen.
De ELISA kan in een kwalitatief of kwantitatief formaat worden uitgevoerd. Kwalitatieve resultaten geven een eenvoudig positief of negatief resultaat, terwijl bij kwantitatieve ELISA de optische dichtheid (OD) van het monster wordt vergeleken met een standaardcurve, die typisch een seriële verdunning is van een bekende concentratieoplossing van het doelmolecuul.

Directe ELISA

De directe ELISA is de meest eenvoudige testvorm van Elisa, waarbij alleen een enzymgemarkeerd primair antilichaam wordt gebruikt en secundaire antilichamen niet nodig zijn. Het enzym-gemarkeerde primaire antilichaam bindt direct aan het doelwit, d.w.z. antigeen. De gebufferde antigeenoplossing wordt toegevoegd aan elke put van een microtiterplaat (meestal 96-wellsplaten, ELISA-platen), waar het zich door middel van ladingsinteracties aan het kunststofoppervlak hecht. Wanneer het enzym dat gekoppeld is aan het primaire antilichaam reageert met zijn substraat, produceert het een zichtbaar signaal dat kan worden gemeten via een spectrofotometer, fluorometer of luminometer.

Indirecte ELISA

Voor de indirecte ELISA-test zijn zowel een primair als een secundair antilichaam nodig. In tegenstelling tot de directe ELISA wordt echter niet het primaire antilichaam, maar het secundaire antilichaam gelabeld met een enzym. Het antigeen wordt geïmmobiliseerd aan de putplaat en gebonden aan het primaire antilichaam. Vervolgens bindt het met een enzym gelabelde secundaire antilichaam zich aan het primaire antilichaam. Ten slotte reageert het aan de secundaire antilichaam gekoppelde enzym met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat kan worden gedetecteerd.

Sandwich-ELISA

Bij directe en indirecte ELISA-tests wordt het antigeen geïmmobiliseerd en gecoat op het oppervlak van de putplaat, bij de sandwich-ELISA wordt het antilichaam geïmmobiliseerd op het kunststof oppervlak van de ELISA-plaat. De geïmmobiliseerde antilichamen in de sandwich-ELISA staan bekend als opvangantilichamen. Naast de capture-antilichamen zijn in de sandwich-ELISA ook zogenaamde detectie-antilichamen nodig. Detectie-antilichamen omvatten een ongelabeld primair detectie-antilichaam en een enzym-gelabeld secundair detectie-antilichaam.
Stapsgewijs bindt het antigeen van belang aan het gevangen antilichaam dat aan de plaat vastzit. Vervolgens bindt het primaire detectie-antilichaam zich aan het antigeen. Daarna bindt het secundaire detectieantilichaam zich aan het primaire detectieantilichaam. In de laatste reactiestap reageert het enzym met zijn substraat om een zichtbaar signaal te produceren dat optisch kan worden gedetecteerd.

Concurrerende ELISA

Concurrerende ELISA, ook wel remmende ELISA genoemd, is het meest complexe ELISA-type omdat er een remmend antigeen in wordt gebruikt. Elk van de drie formaten, direct, indirect en sandwich-ELISA, kan worden aangepast aan het concurrerende ELISA-formaat. Bij concurrerende ELISA's concurreren het remmende antigeen en het betrokken antigeen om binding aan het primaire antilichaam.
Bij concurrerende ELISA's wordt een ongelabeld antilichaam geïncubeerd in aanwezigheid van het antigeen, d.w.z. een monster. Deze gebonden antilichaam/antigeencomplexen worden vervolgens toegevoegd aan een antigeenhoudende put.
De plaat wordt gewassen, zodat ongebonden antilichamen worden verwijderd. Concurrerende ELISA heeft zijn naam te danken aan het feit dat hoe meer antigeen er in het monster zit, hoe meer antigeen-antilichaam complexen worden gevormd. Dit betekent dat er minder ongebonden antilichamen beschikbaar zijn om zich te binden aan het antigeen in de put en dat de antigenen moeten concurreren om een beschikbaar antilichaam. Een secundair antilichaam, dat overeenkomt met het primaire antilichaam, wordt toegevoegd. Deze tweede antilichaam is gekoppeld aan het enzym. Wanneer het substraat wordt toegevoegd, produceren de resterende enzymen een chromogeen of fluorescerend signaal.
Op dit punt wordt de reactie gestopt om de uiteindelijke verzadiging van het signaal te voorkomen.
Sommige concurrerende ELISA-kits bevatten een enzymgekoppeld antigeen in plaats van een enzymgekoppeld antilichaam. Het gelabelde antigeen concurreert voor primaire antilichaambindingsplaatsen met het monsterantigeen (ongelabeld). Hoe minder antigeen in het monster, hoe meer geëtiketteerd antigeen in de put blijft en hoe sterker het signaal.

Omgekeerde ELISA

Reverse ELISA gebruikt geen putplaten, maar laat de antigenen in de testvloeistof zweven. De omgekeerde ELISA-test meet de hoeveelheid gebonden antilichaam via antigeen. Deze test is speciaal ontwikkeld om het eiwit van de West-Nijl virus-omhulsel op te sporen en te onderzoeken en hoe het in staat is om virusspecifieke antilichamen te vinden.

Enzymatic Marker Gebruikt voor ELISA

Onderstaande lijst geeft de meest voorkomende enzymatische merkers die in ELISA-tests worden gebruikt en waarmee de resultaten van de test na voltooiing kunnen worden gemeten.

  • OPD (o-fenyleendiamine dihydrochloride) wordt amberkleurig om HRP (mierikswortelperoxidase) op te sporen, dat vaak wordt gebruikt als geconjugeerd eiwit.
  • TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine) wordt blauw bij het opsporen van HRP en wordt geel na toevoeging van zwavel- of fosforzuur.
  • ABTS (2,2′-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur]-diammoniumzout) wordt groen bij het opsporen van HRP.
  • PNPP (p-nitrofenylfosfaat, dinatriumzout) wordt geel bij het opsporen van alkalische fosfatase.