Hielscher Echografietechniek

Protocol voor SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivatie met Sonication

De Hielscher VialTweeter is een unieke ultrasone multi-sample preparatie-eenheid, die wordt gebruikt om het coronavirus SARS-COV-2 te inactiveren. De VialTweeter maakt het mogelijk om tot 10 monsterflacons tegelijkertijd te prepareren en is daarmee de ideale eenheid voor massamonsterverwerking.

Inactivering van het SARS-CoV-2 Coronavirus met de VialTweeter

Na het verwijderen van het fixeermiddel, werden de monolagen drie keer gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het schrapen van cellen in 1 ml MEM/5% FBS en sonisch (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) met behulp van de Hielscher ultrasone processor. UP200St met VialTweeter bevestiging. Supernatanten werden verduidelijkt door te centrifugeren bij 3000 × g gedurende 10 minuten. Lees hier het volledige protocol voor de SARS-CoV-2 coronavirusinactivering door Welch et al. (2020) hieronder:

Cellen en Virus

Vero E6 cellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) werden gekweekt in gemodificeerde Eagle's minimum essentiële medium (MEM) aangevuld met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS). Het gebruikte virus was SARS-CoV-2 stam hCOV-19/England/2/2020, geïsoleerd door PHE uit de eerste patiëntencluster in het Verenigd Koninkrijk op 29/01/2020. Dit virus werd verkregen bij passage 1 en gebruikt voor inactivatiestudies bij passage 2 of 3.
Voor reagentia en chemicaliën die gebruikt worden voor SARS-CoV-2 inactivatie en de verwijdering van de reagenscytotoxiciteit wordt verwezen naar het wetenschappelijke rapport van Welch et al. (2020).

The ultrasonic sample preparation unit VialTweeter is used for the inactivation of SARS-CoV-2 coronavirus

Virusinactivering door reinigingsmiddelen – SARS-CoV-2 Coronavirus Inactivatieprotocol door Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 Inactivering

Voor commerciële producten, viruspreparaten (weefselkweekvloeistof, titers variërend van 1 × 106 tot 1 × 108 PFU/ml) werden in drievoud behandeld met reagentia in concentraties en voor contacttijden die worden aanbevolen in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant, indien beschikbaar, of voor concentraties en tijden die specifiek door de testlaboratoria worden gevraagd. Wanneer een reeks concentraties door de fabrikant werd opgegeven, werd de laagste verhouding tussen product en monster getest (d.w.z. de laagste aanbevolen concentratie van het testproduct). Reagentia voor monstertransportbuizen werden getest met een verhouding van één volume weefselkweekvloeistof tot tien volumes reagens, tenzij de fabrikant een volumeverhouding van monstervloeistof tot reagens had opgegeven. Detergenten, fixeermiddelen en oplosmiddelen werden getest in de aangegeven concentraties voor de aangegeven tijdstippen. Alle inactivatiestappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (18 - 25°C). Voor het testen van alternatieve monstertypen werd het virus in de aangegeven monstermatrix gespijkerd in een verhouding van 1:9 en vervolgens behandeld met testreagentia zoals hierboven beschreven. Alle experimenten omvatten driedubbele controle mock-treated monsters met een gelijkwaardig volume van PBS in plaats van testreagens. Onmiddellijk na de vereiste contacttijd werd 1 ml behandeld monster verwerkt met behulp van de juiste geselecteerde filtratiematrix. Reagens verwijdering voor inactivatie testen werd uitgevoerd in een grotere spin kolom formaat met Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), of door het vullen van lege Pierce 10mL capaciteit centrifugekolommen (Thermo Fisher) met SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR of Sephadex LH-20 om 4mL verpakte kralen / hars te geven. Voor de zuivering met behulp van Amiconfilters werden 2 × 500μl monsters gezuiverd met behulp van twee centrifugaalfilters volgens de eerder beschreven methode en vervolgens samengevoegd. Voor formaldehyde en formaldehyde met glutaraldehydeverwijdering werd een filter gebruikt met 1 × 500 μl monstervolume, geresuspendeerd na verwerking in 500 μl PBS, en toegevoegd aan 400ul MEM/5% FBS. Voor inactivering van geïnfecteerde VialTweeter at the ultrasonic processor UP200STmonolagen, 12,5 cm2 kolven van Vero E6-cellen (2,5 × 106 cellen/kolf in 2,5 ml MEM/5% FBS) werden geïnfecteerd bij MOI 0,001 en geïncubeerd bij 37°C/5% CO2 voor 24 uur. Supernatant werd verwijderd, en cellen gefixeerd met 5mL formaldehyde, of formaldehyde en glutaraldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 of 60 minuten. Het fixeermiddel werd verwijderd, en monolagen gewassen drie keer met PBS voor het schrapen van cellen in 1mL MEM / 5% FBS en gesoneerd (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) met behulp van een UP200St met VialTweeter bevestiging (Hielscher Ultrasound Technologie). Supernatanten werden verduidelijkt door te centrifugeren bij 3000 × g gedurende 10 minuten.

VialTweeter voor de intensieve sonische weergave van gesloten flacons

VialTweeter voor de Intense Sonication of Closed Vials

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Various reagents have been tested for the inactivation of the SARS-CoV-2 coronavirus using the ultrasonic sample prep unit VialTweeter.

Details van het reagens dat gebruikt wordt voor SARS-CoV-2 coronavirusinactivatie met de ultrasone VialTweeter volgens het protocol van Welch et al. 2020.

Het volledige protocol inclusief het gebruik van de Hielscher VialTweeter vindt u hier:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

The multi-sample ultrasonicator VialTweeter allows for simultaneous sample preparation of up to 10 vials under same process conditions. The VialTweeter is an established ultrasonic device used for the inactivation of corona virus SARS-CoV-2 (Click to enlarge!)

VialTweeter voor ultrasone virusinactivatie

De voordelen van de VialTweeter in een oogopslag

  • Sonicatie van maximaal 10 flesjes tegelijk
  • Geen kruisbesmetting
  • Geen monsterverlies
  • Automatische gegevensregistratie
  • Gemakkelijk en veilig te bedienen
De VialTweeter wordt ook gebruikt voor

  • Cel Lyse
  • Virale deeltjesverstoring
  • Nucleïnezuurextractie: DNA/RNA-isolatie
  • DNA/RNA-fragmentatie
  • Lysate solubilisatie
  • Geavanceerde Ultrasone Ontmantelaars en Celverstoorders

    De multi-sample ultrasonicator VialTweeter is slechts één van de vele ultrasone oplossingen voor monstervoorbereiding in biologische, biochemische en klinische laboratoria. Hielscher Ultrasonics biedt de ideale ultrasone dismembrator voor uw toepassing, bijv. cellyse, celextractie, weefselhomogenisatie, lysate solubilisatie, oplossen, monsterontgassing enz.
    Laat ons weten hoeveel monsters u per uur en per dag moet verwerken, of u de voorkeur geeft aan directe of indirecte sonicatie en wat het doel is van de ultrasone monsterbehandeling. Wij adviseren u de meest geschikte ultrasone eenheid voor uw dagelijkse werkroutine!
    De digitale ultrasone processoren van Hielscher Ultrasonics zijn uitgerust met slimme software, automatische gegevensregistratie, eenvoudige voorinstelmogelijkheden voor temperatuurregeling, sonische duur, cyclus-/pulsmodus, evenals monsterverlichting en browserafstandsbediening. Wij streven ernaar om onze ultrasone apparaten zo slim mogelijk te maken, zodat uw onderzoeks- en werkroutine zo handig en succesvol mogelijk wordt.
    Klik hier, om meer toepassingen te vinden, waaronder protocollen van ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter!

    Neem contact met ons op! / Vraag ons!

    Vraag voor meer informatie

    Gebruik het onderstaande formulier om aanvullende informatie aan te vragen over ultrasone processoren, toepassingen en prijs. Wij bespreken graag uw proces met u en bieden u een ultrasoon systeem aan dat aan uw eisen voldoet!









    Let op onze Privacybeleid.


    Ultrasonic high-shear homogenizers are used in lab, bench-top, pilot and industrial processing.

    Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren voor mengtoepassingen, dispersie, emulsificatie en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.

    Literatuur / Referenties



    Feiten die de moeite waard zijn om te weten

    Wat zijn Vero Cellen?

    Vero E6, ook bekend als Vero C1008 (ATCC No. CRL-1586) is een klooncellenlijn uit Vero 76 en wordt gebruikt in het onderzoek naar SARS-CoV en SARS-CoV-2 coronavirussen. Verocellen zijn een lijn van cellen die gebruikt worden in celculturen. De 'Vero’ De stam werd geïsoleerd uit nierepitheelcellen van een Afrikaanse groene aap (Chlorocebus sp.).
    Vero E6 cellen vertonen enige contactremming, en zijn dus geschikt voor het verspreiden van virussen die zich langzaam vermeerderen. Vero E6 cellijnen worden vaak gebruikt om de cytopathologie van coronavirussen SARS-CoV en SARS-CoV-2 te onderzoeken omdat Vero cellen (Afrikaanse groene apenniercellen) een overvloedige expressie van angiotensine-converterende enzym 2 (ACE2) receptoren vertonen. ACE2-receptoren zijn een belangrijke aanlegplaats voor het SARS-CoV-2 coronavirus.
    Zo vonden Ogando et al. (2020) dat SARS-CoV-2 – in vergelijking met SARS-CoV – genereerde hogere niveaus van intracellulaire virale RNA, maar opvallend genoeg werd ongeveer 50-voudige minder besmettelijke virale nakomelingen hersteld van het kweekmedium. Bovendien stelden ze vast dat de gevoeligheid van de twee virussen voor drie vastgestelde remmers van coronavirusreplicatie (Remdesivir, Alisporivir en chloroquine) zeer vergelijkbaar is, maar dat SARS-CoV-2-infectie aanzienlijk gevoeliger was voor de voorbehandeling van cellen met gepegyleerde interferon-alfa. Een belangrijk verschil tussen de twee virussen is het feit dat – bij het doorgeven in Vero E6-cellen – SARS-CoV-2 staat blijkbaar onder sterke selectiedruk om adaptieve mutaties in zijn piek eiwitgen te verwerven. Deze mutaties veranderen of verwijderen een vermeende 'furine-achtige splitsingsplaats' in het gebied dat de S1- en S2-domeinen verbindt en resulteren in een zeer prominente fenotypische verandering in plaque-tests.