Protocol voor inactivering van het SARS-CoV-2-coronavirus met Sonicatie

De Hielscher VialTweeter is een uniek ultrasoon apparaat voor het prepareren van meerdere monsters, dat wordt gebruikt om het coronavirus SARS-COV-2 te inactiveren. Met de VialTweeter kunnen tot 10 monsterflesjes tegelijk worden geprepareerd en het is daarom de ideale unit voor massale monsterverwerking.

Inactivering van het SARS-CoV-2-coronavirus met de VialTweeter

Na het verwijderen van het fixeermiddel werden de monolagen driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voordat de cellen in 1mL MEM/5% FBS werden geschraapt en met ultrasone trillingen (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) werden behandeld met de Hielscher ultrasone processor. UP200St met VialTweeter bevestiging. De supernatanten werden geklaard door te centrifugeren bij 3000 × g gedurende 10 minuten. Lees hier het volledige protocol voor de SARS-CoV-2 coronavirusinactivatie door Welch et al. (2020) hieronder:

Cellen en virussen

Vero E6-cellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) werden gekweekt in gemodificeerd Eagle's minimaal essentieel medium (MEM) aangevuld met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS). Het gebruikte virus was de SARS-CoV-2-stam hCOV-19/England/2/2020, geïsoleerd door PHE uit het eerste patiëntencluster in het Verenigd Koninkrijk op 29/01/2020. Dit virus werd verkregen bij passage 1 en gebruikt voor inactivatiestudies bij passage 2 of 3.
Zie het wetenschappelijke rapport van Welch et al. (2020) voor reagentia en chemicaliën die worden gebruikt voor inactivering van SARS-CoV-2 en het verwijderen van cytotoxiciteit van reagentia.

Virusinactivatie door detergenten – SARS-CoV-2 coronavirus inactiveringsprotocol door Welch et al. 2020

SARS-CoV-2 inactivering

Voor commerciële producten zijn viruspreparaten (weefselkweekvloeistof, titers variërend van 1 × 10⁶ tot 1 × 10⁸ PFU/ml) werden in drievoud behandeld met reagentia bij concentraties en voor contacttijden die worden aanbevolen in de gebruiksaanwijzing van de fabrikant, indien beschikbaar, of voor concentraties en tijden die specifiek door testlaboratoria worden gevraagd. Wanneer de fabrikant een reeks concentraties opgaf, werd de laagste verhouding van product tot monster getest (d.w.z. de laagste aanbevolen concentratie van het testproduct). Reagentia voor monstertransportbuizen werden getest met een verhouding van één volume weefselkweekvloeistof op tien volumes reagens, tenzij een volumeverhouding van monstervloeistof op reagens werd gespecificeerd door de fabrikant. Detergenten, fixeermiddelen en oplosmiddelen werden getest bij de aangegeven concentraties gedurende de aangegeven tijd. Alle inactivatiestappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (18 - 25 °C). Voor het testen van alternatieve monstertypen werd virus in een verhouding van 1:9 in de aangegeven monstermatrix gespiked en vervolgens met testreagentia behandeld zoals hierboven beschreven. Alle experimenten omvatten drievoudige mock-behandelde controlemonsters met een gelijkwaardig volume PBS in plaats van het testreagens. Onmiddellijk na de vereiste contacttijd werd 1 ml behandeld monster verwerkt met de juiste filtratiematrix. Reagensverwijdering voor inactiveringstests werd uitgevoerd in een grotere centrifugekolom met Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher), of door lege Pierce 10mL centrifugekolommen (Thermo Fisher) te vullen met SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR of Sephadex LH-20 tot 4mL verpakte korrels/hars. Voor zuivering met Amicon-filters werden 2 × 500 μl monsters gezuiverd met twee centrifugaalfilters volgens de eerder beschreven methode en vervolgens samengevoegd. Voor formaldehyde en formaldehyde met glutaaraldehyde verwijdering, werd een filter gebruikt met 1 × 500μl monstervolume, geresuspendeerd na verwerking in 500μl PBS, en toegevoegd aan 400ul MEM / 5% FBS. Voor inactivering van geïnfecteerde monolagen, 12,5 cm² kolven met Vero E6-cellen (2,5 × 10⁶ cellen/kolf in 2,5mL MEM/5% FBS) werden geïnfecteerd bij MOI 0,001 en geïncubeerd bij 37°C/5% CO₂ gedurende 24 uur. Het supernatant werd verwijderd en de cellen werden gefixeerd met 5mL formaldehyde of formaldehyde en glutaaraldehyde bij kamertemperatuur gedurende 15 of 60 minuten. Het fixeermiddel werd verwijderd en de monolagen werden drie keer gewassen met PBS voordat de cellen in 1mL MEM/5% FBS werden geschraapt en gesonitiseerd (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) met een UP200St met VialTweeter-bevestiging (Hielscher Ultrasound Technology). De supernatanten werden geklaard door te centrifugeren bij 3000 × g gedurende 10 minuten.

Details van het reagens dat is gebruikt voor inactivering van het SARS-CoV-2 coronavirus met de ultrasone VialTweeter volgens het protocol van Welch et al. 2020

Het volledige protocol, inclusief het gebruik van de Hielscher VialTweeter, is hier te vinden:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Geavanceerde ultrasone ontmengers en celverstoorders

De multi-sample ultrasoonapparaat VialTweeter is slechts een van de vele ultrasoonoplossingen voor monstervoorbereiding in biologische, biochemische en klinische laboratoria. Hielscher Ultrasonics biedt de ideale ultrasone dismembrator voor uw toepassing, bijv. cellyse, celextractie, weefselhomogenisatie, lysaatoplossen, oplossen, monsterontgassing enz.
Laat ons weten hoeveel monsters u per uur en per dag moet verwerken, of u de voorkeur geeft aan directe of indirecte sonicatie en wat het doel is van de ultrasone monsterbehandeling. Wij zullen u het meest geschikte ultrasone apparaat aanbevelen voor uw dagelijkse werkroutine!
De digitale ultrasoonprocessoren van Hielscher Ultrasonics zijn uitgerust met slimme software, automatische gegevensregistratie, eenvoudige voorinstellingen voor temperatuurregeling, sonicatieduur, cyclus-/pulsmodus en monsterverlichting en browserafstandsbediening. We streven ernaar om onze ultrasone apparaten zo slim mogelijk te maken, zodat uw onderzoeks- en werkroutine zo gemakkelijk en succesvol mogelijk wordt.
Klik hier voor meer toepassingen, waaronder protocollen van ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter!