Protocol voor inactivatie van het SARS-CoV-2-coronavirus met sonicatie

De Hielscher VialTweeter is een unieke ultrasone eenheid voor de voorbereiding van meerdere monsters, die wordt gebruikt om het coronavirus SARS-COV-2 te inactiveren. Met de VialTweeter kunnen tot 10 monsterflacons tegelijkertijd worden voorbereid, waardoor het de ideale eenheid is voor grootschalige monsterverwerking.

Inactivatie van het SARS-CoV-2-coronavirus met de VialTweeter

Na verwijdering van het fixatief werden de monolagen driemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), waarna de cellen werden afgeschraapt in 1mL MEM/5% FBS en gesoniceerd (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) met de Hielscher ultrasone processor UP200St met VialTweeter als opzetstuk. De supernatanten werden geklaard door centrifugatie bij 3000 × g gedurende 10 minuten. 

Lees hieronder het volledige protocol van Welch et al. (2020) voor de inactivatie van het SARS-CoV-2-coronavirus:

Cellen en virus

Vero E6-cellen (Vero C1008; ATCC CRL-1586) werden gekweekt in gemodificeerd minimaal essentieel medium van Eagle (MEM), aangevuld met 10% (v/v) foetaal kalfsserum (FCS). Het gebruikte virus was de SARS-CoV-2-stam hCOV-19/England/2/2020, die op 29/01/2020 door PHE werd geïsoleerd uit het eerste patiëntencluster in het Verenigd Koninkrijk. Dit virus werd verkregen bij passage 1 en gebruikt voor inactivatiestudies bij passage 2 of 3.
Raadpleeg het wetenschappelijke rapport van Welch et al. (2020) voor de reagentia en chemicaliën die voor de inactivatie van SARS-CoV-2 werden gebruikt, evenals voor de verwijdering van de cytotoxiciteit van reagentia.

Virusinactivatie door detergentia – protocol voor inactivatie van het SARS-CoV-2-coronavirus van Welch et al. 2020

Inactivatie van SARS-CoV-2


Voor commerciële producten werden viruspreparaten (weefselkweekvloeistof, met titers variërend van 1 × 10⁶ tot 1 × 10⁸ PFU/ml) in drievoud behandeld met reagentia bij de concentraties en gedurende de contacttijden die in de gebruiksaanwijzingen van de fabrikant werden aanbevolen, indien beschikbaar, of bij concentraties en gedurende tijden die specifiek door testlaboratoria waren aangevraagd. Wanneer de fabrikant een concentratiebereik opgaf, werd de laagste verhouding van product tot monster getest (d.w.z. de laagste aanbevolen concentratie van het testproduct). Reagentia voor monstertransportbuizen werden getest met een verhouding van één volume weefselkweekvloeistof tot tien volumes reagens, tenzij de fabrikant een volumeverhouding van monstervloeistof tot reagens had opgegeven. Detergentia, fixatieven en oplosmiddelen werden getest bij de aangegeven concentraties gedurende de aangegeven tijden. Alle inactivatiestappen werden uitgevoerd bij de heersende kamertemperatuur (18 – 25°C). Voor het testen van alternatieve monstertypen werd virus in een verhouding van 1:9 aan de aangegeven monstermatrix toegevoegd, waarna deze zoals hierboven met testreagentia werd behandeld. Alle experimenten omvatten in drievoud uitgevoerde controlemonsters die een schijnbehandeling ondergingen met een gelijkwaardig volume PBS in plaats van het testreagens. Onmiddellijk na de vereiste contacttijd werd 1mL behandeld monster verwerkt met de daarvoor geselecteerde filtratiematrix. Voor inactivatietests werden reagentia verwijderd met grotere centrifugekolommen, waarbij Pierce 4mL Detergent Removal Spin Columns (Thermo Fisher) werden gebruikt, of door lege Pierce-centrifugekolommen met een capaciteit van 10mL (Thermo Fisher) te vullen met SM2 Bio-Beads, Sephacryl S-400HR of Sephadex LH-20, zodat 4mL gepakte korrels/hars werd verkregen. Voor zuivering met Amicon-filters werden 2 × 500μl monsters met twee centrifugaalfilters volgens de eerder beschreven methode gezuiverd en vervolgens samengevoegd. Voor de verwijdering van formaldehyde en van formaldehyde met glutaaraldehyde werd één filter gebruikt met 1× 500μl monstervolume; het verwerkte monster werd na verwerking opnieuw gesuspendeerd in 500μl PBS en toegevoegd aan 400ul MEM/5% FBS. Voor inactivatie van geïnfecteerde monolagen werden kolven van 12,5 cm² met Vero E6-cellen (2,5 × 10⁶ cellen/kolf in 2,5mL MEM/5% FBS) geïnfecteerd bij MOI 0,001 en geïncubeerd bij 37°C/5% CO₂ gedurende 24 uur. Het supernatant werd verwijderd en de cellen werden gefixeerd met 5mL formaldehyde, of formaldehyde en glutaaraldehyde, bij kamertemperatuur gedurende 15 of 60 minuten. Het fixatief werd verwijderd en de monolagen werden driemaal gewassen met PBS, waarna de cellen werden afgeschraapt in 1mL MEM/5% FBS en gesoniceerd (3 × 10 seconden aan, 10 seconden uit bij 100% vermogen en amplitude) met een UP200St met een VialTweeter als opzetstuk (Hielscher Ultrasound Technology). De supernatanten werden geklaard door centrifugatie bij 3000 × g gedurende 10 minuten.


Details van het reagens dat wordt gebruikt voor inactivatie van het SARS-CoV-2-coronavirus met de ultrasone VialTweeter volgens het protocol van Welch et al. 2020

Het volledige protocol, inclusief het gebruik van de Hielscher VialTweeter, is hier te vinden:
Welch, Stephen R.; Davies, Katherine A.; Buczkowski, Hubert; Hettiarachchi, Nipunadi; Green, Nicole; Arnold, Ulrike; Jones, Matthew; Hannah, Matthew J.; Evans, Reah; Burton, Christopher; Burton, Jane E.; Guiver, Malcolm; Cane, Patricia A.; Woodford, Neil; Bruce, Christine B.; Roberts, Allen D. G.; Killip, Marian J. (2020): Inactivation analysis of SARS-CoV-2 by specimen transport media, nucleic acid extraction reagents, detergents and fixatives. Journal of Clinical Microbiology. Accepted Manuscript Posted Online 24 August 2020.

Geavanceerde ultrasone desintegratoren en apparaten voor celontsluiting

De sonicator voor meerdere monsters VialTweeter is slechts één van de vele ultrasone oplossingen voor monstervoorbereiding in biologische, biochemische en klinische laboratoria. Hielscher Ultrasonics biedt de ideale ultrasone desintegrator voor uw toepassing, bijvoorbeeld cellyse, celextractie, weefselhomogenisatie, solubilisatie van lysaat, oplossen, ontgassen van monsters enz.
Laat ons weten hoeveel monsters u per uur en per dag moet verwerken, of u de voorkeur geeft aan directe of indirecte sonicatie en wat het doel van de ultrasone monsterbehandeling is. Wij bevelen u de meest geschikte ultrasone eenheid voor uw dagelijkse werkzaamheden aan!
De digitale ultrasone processors van Hielscher Ultrasonics zijn uitgerust met slimme software, automatische gegevensregistratie, eenvoudige opties voor het vooraf instellen van temperatuurregeling, sonicatieduur en cyclus-/pulsmodus, evenals monsterverlichting en afstandsbediening via een browser. Wij streven ernaar onze ultrasone apparaten zo slim mogelijk te maken, zodat uw onderzoek en dagelijkse werkzaamheden zo gemakkelijk en succesvol mogelijk verlopen.
Klik hier voor meer toepassingen, inclusief protocollen voor ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter!