Cellyse van BL21-cellen door ultrasoonbehandeling
BL21 cellen zijn een stam van E. coli die veel gebruikt wordt in onderzoekslaboratoria, biotechnologie en industriële productie vanwege hun vermogen om eiwitten zeer efficiënt tot expressie te brengen. Ultrasone celdisruptie, lysis en eiwitextractie is de gebruikelijke methode om de beoogde eiwitten uit het celinterieur van BL21-cellen te isoleren en te verzamelen. Ultrasoon verstoort de cel volledig en maakt alle ingesloten eiwitten vrij, waardoor 100% van het eiwit beschikbaar is.
BL21-cellen voor eiwitexpressie
BL21 cel is een chemisch competente E. coli bacteriestam die geschikt is voor transformatie en eiwitexpressie op hoog niveau met behulp van een T7 RNA polymerase-IPTG inductiesysteem. Met BL21-cellen is eiwitexpressie met hoge efficiëntie mogelijk van elk gen dat onder controle staat van een T7-promotor. De E. coli-stam BL21(DE3) is een op T7 RNA-polymerase gebaseerde eiwitproductiestam in combinatie met T7-promotorgebaseerde expressievectoren en wordt veel toegepast in laboratoria en de industrie om recombinante eiwitten te produceren. In BL21(DE3) wordt expressie van het gen dat codeert voor het recombinante eiwit getranscribeerd door het chromosomaal gecodeerde T7 RNA polymerase (T7 RNAP), dat acht keer sneller transcribeert dan conventioneel E. coli RNAP. Dit maakt de stam BL21(DE3) zeer efficiënt en maakt deze tot een van de meest geprefereerde celsystemen voor eiwitexpressie.
Protocol voor ultrasone lysis en eiwitextractie uit BL21-cellen
Cellyse van BL21 cellen wordt meestal uitgevoerd met behulp van ultrasoon in combinatie met natrium lauroyl sarcosinaat (ook bekend als sarkosyl) als lysisbuffer. De voordelen van ultrasone celdisruptie en eiwitextractie liggen in de betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en eenvoudige, veilige en snelle werking van ultrasone apparaten. Het onderstaande protocol geeft een stapsgewijze instructie voor ultrasone BL21 cellyse:
- Om de chaperone-eiwitten te verwijderen werden de BL21 bacteriële pellets geresuspendeerd in 50 ml ijskoude natriumtris-EDTA (STE) buffer (bestaande uit 10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl aangevuld met 100 mM PMSF).
- Vervolgens wordt 500 ul lysozym (10 mg/ml) toegevoegd en worden de cellen 15 minuten op ijs geïncubeerd.
- Daarna worden 500 ul DTT en 7 ml sarkosyl (10% (w/v) opgemaakt in STE-buffer) toegevoegd.
- Het is essentieel om alle zuiveringsbuffers ijskoud te houden en de monsters de hele tijd in ijs te bewaren. Alle zuiveringsstappen moeten indien mogelijk in de koelruimte worden uitgevoerd.
- Voor ultrasone lysis en eiwitextractie worden de monsters gesonitiseerd in de VialTweeter Ultrasone multi-monsterapparaat gedurende 4 x 30 sec. bij 100% amplitude met een interval van 2 min. tussen elke sonicatie. Als alternatief kan een ultrasone homogenisator van het probe-type met microtip, bijv, UP200Ht met S26d2 (3 x 30 sec., 2 min. pauze tussen ultrasone cycli, 80% amplitude) kan worden gebruikt.
- Voor verdere zuiveringsstappen moeten de monsters op ijs worden bewaard of bij -80 °C tot verdere verwerking.
Ultrasone celdisruptor UP200St met microtip S26d2 voor lysis en eiwitextractie
Ultrasone lysis onder nauwkeurige temperatuurregeling
Een nauwkeurige en betrouwbare temperatuurregeling is cruciaal bij het hanteren van biologische monsters. Hoge temperaturen initiëren thermisch geïnduceerde eiwitafbraak in monsters.
Zoals bij alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken veroorzaakt sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden geregeld bij gebruik van de VialTweeter. We bieden u verschillende opties om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te regelen terwijl u ze prepareert met de VialTweeter en VialPress voor analyse.
- Bewaking van de monstertemperatuur: De ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aanstuurt, is uitgerust met intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via het digitale gekleurde touch-display kun je in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik instellen voor de sonicatie van je monster. De ultrasoon stopt automatisch wanneer de maximumtemperatuur is bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Dan start de sonicatie automatisch opnieuw. Daarna start de sonicatie automatisch opnieuw. Deze slimme functie voorkomt door warmte veroorzaakte degradatie.
- Het VialTweeter-blok kan worden voorgekoeld. Plaats het VialTweeter-blok (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titanium blok voor te koelen om temperatuurstijging in het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan het monster zelf ook worden voorgekoeld.
- Gebruik droogijs om te koelen tijdens sonicatie. Gebruik een ondiep bakje gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het ijs zodat de warmte snel kan afvloeien.
Klanten wereldwijd gebruiken de VialTweeter en VialPress voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Dankzij de intelligente software en temperatuurregeling van de UP200St processor wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt door warmte veroorzaakte degradatie van het monster voorkomen. Ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter en VialPress levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!
Vind de optimale ultrasone disruptor voor uw lysisatietoepassing
Hielscher Ultrasonics is een ervaren fabrikant van hoogwaardige ultrasone celverstoorders en homogenisatoren voor laboratoria, bench-top en industriële systemen. De grootte van uw bacteriële celkweek, uw onderzoeks- of productiedoel en het te verwerken celvolume per uur of dag zijn essentiële factoren om de juiste ultrasone celdisruptor voor uw toepassing te vinden.
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen voor de gelijktijdige sonicatie van multi-samples (tot 10 vials met de VialTweeter) en massamonsters (d.w.z. microtiterplaten / ELISA-platen met de UIP400MTP), naast de klassieke laboratoriumultrasone van het probe-type met verschillende vermogensniveaus van 50 tot 400 watt tot volledig industriële ultrasone processoren met tot 16.000 watt per eenheid voor commerciële celdisruptie en eiwitextractie in grote productie. Alle Hielscher ultrasone processors zijn gebouwd voor 24/7/365 bedrijf onder volledige belasting. Robuustheid en betrouwbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van onze ultrasone apparaten.
Alle digitale ultrasone homogenisatoren zijn uitgerust met slimme software, gekleurd aanraakscherm en automatische gegevensprotocollering, waardoor het ultrasone apparaat een handig werkinstrument wordt in laboratoria en productiefaciliteiten.
Laat ons weten wat voor soort cellen, welk volume, met welke frequentie en met welk doel u uw biologische monsters moet verwerken. Wij zullen u de meest geschikte ultrasone celdisruptor aanbevelen voor uw procesvereisten.
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van compacte handhomogenisatoren en MultiSample Ultrasonicators tot industriële ultrasone processoren voor commerciële toepassingen:
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| 96-well/microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| 10 injectieflacons à 0,5 tot 1,5 mL | n.v.t. | VialTweeter op UP200St |
| 0.01 tot 250 ml | 5 tot 100 ml/min | UP50H |
| 0.01 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100 liter | 2 tot 10 l/min | UIP4000hdT |
| n.v.t. | 10 tot 100 l/min | UIP16000 |
| n.v.t. | groter | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
UIP400MTP platen sonicator voor high-throughput celdisruptie in 96-well platen
Ultrasoon UP200Ht met 2 mm microtip S26d2 voor sonicatie van kleine monsters
Lees meer over hoe u uw ultrasone weefselhomogenisator kunt gebruiken voor de efficiënte en betrouwbare bereiding van bufferoplossingen!
Wetenswaardigheden
Escherichia Coli Bacteriën
Escherichia coli is een bacteriesoort die geen sporen vormt, Gram-negatief is en gekenmerkt wordt door de vorm van een rechte staaf. E.coli-bacteriën komen voor in het milieu, voedsel en de darmen van mensen en dieren. E.coli is meestal beweeglijk door het gebruik van peritrichous flagella, maar er zijn ook niet-beweeglijke types. E.coli zijn zogenaamde facultatief anaerobe chemoorganotrofe organismen, wat betekent dat ze in staat zijn tot zowel ademhalings- als fermentatiemetabolisme. De meeste E.coli-types zijn goedaardig en vervullen nuttige functies in het lichaam, bv. de groei van schadelijke bacteriesoorten onderdrukken, vitaminen synthetiseren enz.
Escherichia coli bacteriecellen van het zogenaamde B-type zijn een speciale categorie E.coli-stammen die veel gebruikt worden in onderzoek om mechanismen zoals bacteriofaaggevoeligheid of restrictie-modificatiesystemen te onderzoeken. Bovendien worden E.coli-bacteriën gewaardeerd als betrouwbaar werkpaard voor eiwitexpressie in biotechnologische en biowetenschappelijke laboratoria. E.coli wordt bijvoorbeeld gebruikt om op industriële schaal verbindingen zoals eiwitten en oligosacchariden te synthetiseren. Vanwege specifieke eigenschappen zoals proteasedeficiëntie, lage acetaatproductie bij een hoog glucoseniveau en verbeterde permeabiliteit, zijn E. coli B-cellen de meest gebruikte gastheercellen voor de productie van genetisch gemanipuleerde eiwitten.
Recombinant eiwit
Recombinante eiwitten (rProt) worden steeds belangrijker in allerlei sectoren, waaronder de chemische productie, farmaceutische, cosmetische, menselijke en dierlijke geneeskunde, landbouw, voedingsmiddelenindustrie en afvalverwerking.
De productie van recombinante eiwitten vereist het gebruik van een expressiesysteem. Als expressiecelsystemen voor de productie van recombinant DNA kunnen zowel prokaryote als eukaryote cellen worden gebruikt. Hoewel bacteriële cellen het meest worden gebruikt voor eiwitexpressie vanwege factoren als lage kosten, eenvoudige schaalbaarheid en eenvoudige mediacondities, zijn zoogdier-, gist-, algen-, insecten- en celvrije systemen bekende alternatieven. Het type eiwit, de functionele activiteit en de vereiste opbrengst van het uitgedrukte eiwit beïnvloeden de keuze van het celsysteem dat gebruikt wordt voor eiwitexpressie.
Om recombinant eiwit tot expressie te brengen, moet een bepaalde cel worden getransfecteerd met een DNA-vector die het sjabloon van recombinant DNA bevat. De cellen die getransfecteerd zijn met het sjabloon worden vervolgens gekweekt. Als gevolg van het cellulaire mechanisme transcriberen en vertalen de cellen het gewenste eiwit en produceren zo het beoogde eiwit.
Aangezien de tot expressie gebrachte eiwitten in de celmatrix gevangen zitten, moet de cel worden gelyseerd (verstoord en gebroken) om de eiwitten vrij te maken. In een volgende zuiveringsstap wordt het eiwit gescheiden en gezuiverd.
Het eerste recombinante eiwit dat voor behandeling werd gebruikt, was recombinante menselijke insuline in 1982. Vandaag de dag worden er wereldwijd meer dan 170 soorten recombinante eiwitten geproduceerd voor medische behandelingen. Veel gebruikte recombinante eiwitten in de geneeskunde zijn bijvoorbeeld recombinante hormonen, interferonen, interleukines, groeifactoren, tumornecrosefactoren, bloedstollingsfactoren, trombolytische medicijnen en enzymen voor de behandeling van ernstige ziekten zoals diabetes, dwerggroei, myocardinfarct, congestief hartfalen, cerebrale apoplexie, multiple sclerose, neutropenie, trombocytopenie, bloedarmoede, hepatitis, reumatoïde artritis, astma, ziekte van Crohn en kankertherapieën. (cf. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatuur / Referenties
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator voor de gelijktijdige sonicatie van 10 monsters, bijvoorbeeld om BL21-cellen te verstoren
Hoogwaardige ultrasone klank! Het productassortiment van Hielscher bestrijkt het volledige spectrum, van de compacte ultrasoonmachine voor laboratoria tot bench-top units tot volledig industriële ultrasone systemen.