Cellyse van BL21-cellen door ultrasone behandeling
BL21-cellen behoren tot een E. coli-stam die veel wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria, de biotechnologie en de industriële productie vanwege het vermogen om eiwitten zeer efficiënt tot expressie te brengen. Ultrasone celontsluiting, lyse en eiwitextractie vormen de gangbare methode om de gewenste eiwitten uit het binnenste van BL21-cellen te isoleren en te verzamelen. Ultrasone behandeling ontsluit de cel volledig en maakt alle ingesloten eiwitten vrij, waardoor 100% van het eiwit beschikbaar komt.
BL21-cellen voor eiwitexpressie
BL21 is een chemisch competente E. coli-bacteriestam die geschikt is voor transformatie en eiwitexpressie op hoog niveau met behulp van een T7-RNA-polymerase-IPTG-inductiesysteem. BL21-cellen maken zeer efficiënte eiwitexpressie mogelijk van elk gen dat onder controle van een T7-promotor staat. De E. coli-stam BL21(DE3) is een op T7-RNA-polymerase gebaseerde stam voor eiwitproductie, die wordt gecombineerd met expressievectoren op basis van een T7-promotor en veel wordt toegepast in laboratoria en de industrie om recombinante eiwitten te produceren. In BL21(DE3) wordt de expressie van het gen dat voor het recombinante eiwit codeert, getranscribeerd door het chromosomaal gecodeerde T7-RNA-polymerase (T7 RNAP), dat acht keer sneller transcribeert dan conventioneel E. coli-RNAP. Dit maakt de stam BL21(DE3) zeer efficiënt en tot een van de meest geprefereerde celsystemen voor eiwitexpressie.
Protocol voor ultrasone lyse en eiwitextractie uit BL21-cellen
Cellyse van BL21-cellen wordt meestal uitgevoerd met ultrasone behandeling in combinatie met natriumlauroylsarcosinaat (ook bekend als sarkosyl) als lysebuffer. De voordelen van ultrasone celontsluiting en eiwitextractie liggen in de betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en de eenvoudige, veilige en snelle bediening van ultrasone apparaten. Het onderstaande protocol geeft stapsgewijze aanwijzingen voor ultrasone cellyse van BL21-cellen:
- Om de chaperonne-eiwitten te verwijderen, werden BL21-bacteriepellets geresuspendeerd in 50 ml ijskoude natrium-Tris-EDTA-buffer (STE) (bestaande uit 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, aangevuld met 100 mM PMSF).
- Vervolgens wordt 500 ul lysozym (10 mg/ ml) toegevoegd en worden de cellen gedurende 15 min op ijs geïncubeerd.
- Daarna worden 500 ul DTT en 7 ml sarkosyl (10% (w/v), bereid in STE-buffer) toegevoegd.
- Het is essentieel om alle zuiveringsbuffers ijskoud te houden en de monsters voortdurend op ijs te bewaren. Alle zuiveringsstappen moeten indien mogelijk in de koelruimte worden uitgevoerd.
- Voor ultrasone lyse en eiwitextractie worden de monsters in de VialTweeter MultiSample Ultrasonicator gedurende 4 x 30 sec bij 100% amplitude gesoniceerd, met een interval van 2 min tussen elke sonicatie. Als alternatief kan een ultrasone homogenisator met sonde en microtip, bijvoorbeeld de UP200Ht met S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauze tussen ultrasone cycli, 80% amplitude), worden gebruikt.
- Voor verdere zuiveringsstappen moeten de monsters op ijs worden gehouden of als alternatief bij -80°C worden bewaard tot verdere verwerking.
Ultrasoon celontsluitingsapparaat UP200St met microtip S26d2 voor lyse en eiwitextractie
Ultrasone lyse onder nauwkeurige temperatuurregeling
Nauwkeurige en betrouwbare temperatuurregeling is cruciaal bij het werken met biologische monsters. Hoge temperaturen zetten thermisch geïnduceerde eiwitafbraak in monsters in gang.
Net als alle mechanische technieken voor monstervoorbereiding genereert sonicatie warmte. Bij gebruik van de VialTweeter kan de temperatuur van de monsters echter goed worden geregeld. We presenteren verschillende mogelijkheden om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te regelen terwijl u ze met de VialTweeter en VialPress voorbereidt voor analyse.
- Bewaking van de monstertemperatuur: de ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aandrijft, is uitgerust met intelligente software en een aansluitbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuisjes. Via het digitale kleurenaanraakscherm kunt u in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik voor de sonicatie van uw monsters instellen. Het ultrasone apparaat stopt automatisch wanneer de maximale temperatuur wordt bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de onderste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Vervolgens begint de sonicatie automatisch opnieuw. Deze slimme functie voorkomt door warmte geïnduceerde afbraak.
- Het blok van de VialTweeter kan vooraf worden gekoeld. Plaats het blok van de VialTweeter (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblok vooraf te koelen; dit helpt de temperatuurstijging in het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan ook het monster zelf vooraf worden gekoeld.
- Gebruik droogijs om tijdens de sonicatie te koelen. Gebruik een ondiepe bak gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het ijs, zodat warmte snel kan worden afgevoerd.
Klanten wereldwijd gebruiken de VialTweeter en VialPress voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Dankzij de intelligente software en temperatuurregeling van de processor UP200St wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt door warmte geïnduceerde monsterafbraak voorkomen. Ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter en VialPress levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!
Vind het optimale ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw lysetoepassing
Hielscher Ultrasonics is een fabrikant met jarenlange ervaring in ultrasone celontsluitingsapparaten en homogenisatoren met hoge prestaties voor laboratoria, tafelmodellen en systemen op industriële schaal. De omvang van uw bacteriële celcultuur, uw onderzoeks- of productiedoel en het volume aan cellen dat per uur of dag moet worden verwerkt, zijn essentiële factoren bij het vinden van het juiste ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw toepassing.
Hielscher Ultrasonics biedt diverse oplossingen voor de gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters (tot 10 flacons met de VialTweeter) en grote aantallen monsters (d.w.z. microtiterplaten / ELISA-platen met de UIP400MTP), evenals klassieke ultrasone laboratoriumapparaten met sonde en verschillende vermogens van 50 tot 400 watt tot volledig industriële ultrasone processors met tot 16.000watt per eenheid voor commerciële celontsluiting en eiwitextractie in grootschalige productie. Alle ultrasone apparaten van Hielscher zijn gebouwd voor 24/7/365-bedrijf onder volledige belasting. Robuustheid en betrouwbaarheid zijn kernkenmerken van onze ultrasone apparaten.
Alle digitale ultrasone homogenisatoren zijn uitgerust met slimme software, een kleurenaanraakscherm en automatische gegevensregistratie, waardoor het ultrasone apparaat een handig hulpmiddel is in laboratoria en productiefaciliteiten.
Laat ons weten welk type cellen, welk volume, met welke frequentie en met welk doel u uw biologische monsters moet verwerken. Wij adviseren u het meest geschikte ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw procesvereisten.
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van compacte handhomogenisatoren en MultiSample Ultrasonicators tot industriële ultrasone processors voor commerciële toepassingen:
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| Platen met 96 wells / microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| 10 flacons van elk 0,5 tot 1,5mL | n.v.t. | VialTweeter op UP200St |
| 0,01 tot 250mL | 5 tot 100mL/min | UP50H |
| 0,01 tot 500mL | 10 tot 200mL/min | UP100H |
| 10 tot 2000mL | 20 tot 400mL/min | UP200Ht, UP400St |
| 0,1 tot 20L | 0,2 tot 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100L | 2 tot 10L/min | UIP4000hdT |
| n.v.t. | 10 tot 100L/min | UIP16000 |
| n.v.t. | hoger | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!
UIP400MTP sonicator voor platen voor celontsluiting met hoge verwerkingscapaciteit in platen met 96 wells
Ultrasoon apparaat UP200Ht met microtip S26d2 van 2mm voor de sonicatie van kleine monsters
Lees meer over hoe u uw ultrasone weefselhomogenisator kunt gebruiken voor de efficiënte en betrouwbare bereiding van bufferoplossingen!
Wetenswaardigheden
Escherichia coli-bacteriën
Escherichia coli is een bacteriesoort die geen sporen vormt, gramnegatief is en wordt gekenmerkt door de vorm van een rechte staaf. E.coli-bacteriën komen voor in het milieu, in voedingsmiddelen en in de darmen van mensen en dieren. E. coli is meestal beweeglijk dankzij peritriche flagellen, maar er zijn ook niet-beweeglijke typen. E.coli zijn zogenoemde facultatief anaerobe chemo-organotrofe organismen, wat betekent dat ze zowel tot respiratoir als tot fermentatief metabolisme in staat zijn. De meeste E.coli-typen zijn onschadelijk en vervullen nuttige functies in het lichaam, zoals het onderdrukken van de groei van schadelijke bacteriesoorten, het synthetiseren van vitaminen enz.
Escherichia coli-bacteriecellen van het zogenoemde B-type vormen een speciale categorie E.coli-stammen die veel worden gebruikt in onderzoek naar mechanismen zoals gevoeligheid voor bacteriofagen of restrictie-modificatiesystemen. Daarnaast worden E.coli-bacteriën gewaardeerd als betrouwbaar werkpaard voor eiwitexpressie in laboratoria voor biotechnologie en levenswetenschappen. E.coli worden bijvoorbeeld gebruikt om verbindingen zoals eiwitten en oligosachariden op industriële schaal te synthetiseren. Vanwege specifieke eigenschappen zoals proteasedeficiëntie, lage acetaatproductie bij een hoog glucosegehalte en verhoogde permeabiliteit zijn E. coli B-cellen de meest gebruikte gastheercellen voor de productie van genetisch gemodificeerde eiwitten.
Recombinant eiwit
Recombinante eiwitten (rProt) worden aanzienlijk belangrijker in uiteenlopende sectoren, waaronder de chemische productie, de farmaceutische en cosmetische industrie, de humane en veterinaire geneeskunde, de landbouw, de voedingsmiddelenindustrie en de afvalverwerkingsindustrie.
De productie van recombinant eiwit vereist het gebruik van een expressiesysteem. Als celsystemen voor expressie bij de productie van recombinant DNA kunnen zowel prokaryote als eukaryote cellen worden gebruikt. Hoewel bacteriële cellen het meest worden gebruikt voor eiwitexpressie vanwege factoren zoals lage kosten, eenvoudige schaalbaarheid en eenvoudige kweekmediumcondities, zijn zoogdier-, gist-, algen-, insecten- en celvrije systemen gevestigde alternatieven. Het eiwittype, de functionele activiteit en de vereiste opbrengst aan tot expressie gebracht eiwit beïnvloeden de keuze van het celsysteem dat voor eiwitexpressie wordt gebruikt.
Om recombinant eiwit tot expressie te brengen, moet een bepaalde cel worden getransfecteerd met een DNA-vector die de matrijs van recombinant DNA bevat. De met de matrijs getransfecteerde cellen worden vervolgens gekweekt. Als gevolg van het cellulaire mechanisme transcriberen en vertalen de cellen het eiwit van belang, waardoor ze het gewenste eiwit produceren.
Omdat de tot expressie gebrachte eiwitten in de cellulaire matrix zijn ingesloten, moet de cel worden gelyseerd (ontsloten en opengebroken) om de eiwitten vrij te maken. In een daaropvolgende zuiveringsstap wordt het eiwit afgescheiden en gezuiverd.
Het eerste recombinante eiwit dat voor behandeling werd gebruikt, was recombinante humane insuline in 1982. Tegenwoordig worden wereldwijd meer dan 170 typen recombinante eiwitten geproduceerd voor medische behandelingen. Veelgebruikte recombinante eiwitten in de geneeskunde zijn bijvoorbeeld recombinante hormonen, interferonen, interleukinen, groeifactoren, tumornecrosefactoren, bloedstollingsfactoren, trombolytische geneesmiddelen en enzymen voor de behandeling van ernstige ziekten zoals diabetes, dwerggroei, myocardinfarct, congestief hartfalen, beroerte, multiple sclerose, neutropenie, trombocytopenie, anemie, hepatitis, reumatoïde artritis, astma, de ziekte van Crohn en voor kankertherapieën. (vgl. Phuc V. Pham, in Omics Technologies and Bio-Engineering, 2018)
Literatuur / Referenties
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
VialTweeter sonicator voor de gelijktijdige sonicatie van 10 monsters, bijvoorbeeld om BL21-cellen te ontsluiten
Ultrasone technologie met hoge prestaties! Het productassortiment van Hielscher omvat het volledige spectrum, van het compacte ultrasone laboratoriumapparaat via tafelmodellen tot volledig industriële ultrasone systemen.