Celanalyse van BL21 cellen door middel van ultrasoontechniek
BL21 Cellen voor Eiwituitdrukking
BL21 cel is een chemisch competente E. coli bacteriestam die geschikt is voor transformatie en hoogwaardige eiwitexpressie met behulp van een T7 RNA polymerase-IPTG inductiesysteem. BL21 cellen laten hoog-efficiënte eiwitexpressie toe van elk gen dat onder de controle is van een T7 promotor. De E. coli stam BL21(DE3) is een T7 RNA polymerase-gebaseerde eiwitproductie stam in combinatie met T7 promotor-gebaseerde expressievectoren en wordt op grote schaal toegepast in laboratoria en de industrie om recombinante eiwitten te produceren. In BL21(DE3) wordt de expressie van het gen dat codeert voor het recombinante eiwit getranscribeerd door het chromosomaal gecodeerde T7 RNA polymerase (T7 RNAP), dat acht keer sneller transcribeert dan conventionele E. coli RNAP. Dit maakt de stam BL21(DE3) zeer efficiënt en maakt het een van de meest geprefereerde eiwitexpressiecelsystemen.
Protocol voor ultrasone lyse en eiwitextractie uit BL21-cellen
Cellyse van BL21 cellen wordt meestal uitgevoerd met behulp van ultrasonicatie in combinatie met natrium lauroyl sarcosinaat (ook bekend als sarkosyl) als lysisbuffer. De voordelen van ultrasone celverstoring en eiwitextractie liggen in de betrouwbaarheid, de reproduceerbaarheid en de eenvoudige, veilige en snelle werking van ultrasonicators. Het onderstaande protocol geeft een stap-voor-stap richting voor ultrasone BL21 cellyse:
Ultrasone celverstoorder UP200St met micro-tip S26d2 voor lysis en eiwitextractie
- Om de chaperoneiwitten te verwijderen werden de BL21 bacteriepellets geresuspendeerd in 50 ml ijskoude Sodium Tris-EDTA (STE) buffer (bestaande uit 10 mM Tris-HCL, pH 8,0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl aangevuld met 100 mM PMSF).
- De, 500 ul lysozyme (10 mg/ ml) worden toegevoegd en de cellen worden gedurende 15 min. op ijs geïncubeerd.
- Daarna wordt 500 ul DTT en 7 ml sarkosyl (10% (m/V) in STE-buffer) toegevoegd.
- Het is essentieel om alle zuiveringsbuffers ijskoud te houden en de monsters altijd op ijs te houden. Alle zuiveringsstappen moeten indien mogelijk in de koelruimte worden uitgevoerd.
- Voor ultrasone lyse en eiwitextractie worden de monsters gesoniseerd in de VialTweeter MultiSample Ultrasonicator gedurende 4 x 30 sec. bij 100% amplitude met een interval van 2 min. tussen elke sonicatie. Een alternatief is een ultrasone homogenisator van het sonde-type met microtip, bijv, Uf200 ः t met S26d2 (3 x 30 sec, 2 min. pauze tussen ultrasone cycli, 80% amplitude) kan worden gebruikt.
- Voor verdere zuiveringsstappen moeten de monsters op ijs worden bewaard of anders bij -80°C worden bewaard tot verdere verwerking.
Ultrasone Lyse onder nauwkeurige temperatuurregeling
De nauwkeurige en betrouwbare temperatuurregeling is van cruciaal belang bij de behandeling van biologische monsters. Hoge temperaturen initiëren thermisch geïnduceerde eiwitafbraak in monsters.
Zoals alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken, creëert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden gecontroleerd bij gebruik van de VialTweeter. We presenteren u verschillende opties om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te controleren terwijl u ze met de VialTweeter en VialPress voorbereidt op de analyse.
- Bewaking van de monstertemperatuur: De ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aandrijft, is uitgerust met een intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via een digitaal gekleurd touch-display kunt u in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik voor uw monstername-sonicatie instellen. De ultrasonicator zal automatisch stoppen wanneer de maximale temperatuur is bereikt en pauzeren totdat de temperatuur van het monster is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Daarna begint de ultrasone meting weer automatisch. Deze slimme functie voorkomt warmte-inducerende degradatie.
- Het VialTweeter blok kan voorgekoeld worden. Plaats het VialTweeter-blokje (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblokje voor te koelen en zo de temperatuurstijging van het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan het monster zelf ook voorgekoeld worden.
- Gebruik droogijs om af te koelen tijdens de sonicatie. Gebruik een ondiepe bak gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het ijs zodat de warmte snel kan worden afgevoerd.
Klanten gebruiken de VialTweeter en VialPress wereldwijd voor hun dagelijkse monstervoorbereiding in biologische, biochemische, medische en klinische laboratoria. Door de intelligente software en temperatuurregeling van de UP200St-processor wordt de temperatuur betrouwbaar geregeld en wordt door warmte veroorzaakte monsterafbraak vermeden. Ultrasone monstervoorbereiding met de VialTweeter en VialPress levert zeer betrouwbare en reproduceerbare resultaten!
Zoek de Optimale Ultrasone Ontregelaar voor uw Lysis-toepassing
Hielscher Ultrasonics is sinds jaar en dag een ervaren fabrikant van hoogwaardige ultrasone celverstoorders en homogenisatoren voor laboratoria, bench-top en industriële schaalsystemen. De grootte van uw bacteriële celkweek, uw onderzoeks- of productiedoel en het te verwerken celvolume per uur of dag zijn essentiële factoren om de juiste ultrasone celverstoorder voor uw toepassing te vinden.
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen voor de gelijktijdige sonicatie van multi-samples (tot 10 flesjes met de VialTweeter) en massamonsters (d.w.z. microtiterplaten / ELISA-platen met de UIP400MTP), evenals de klassieke ultrasone laboratorium ultrasonicator met verschillende vermogensniveaus van 50 tot 400 watt tot volledig industriële ultrasone processoren met tot 16.000 watt per eenheid voor commerciële celverstoring en eiwitextractie in grote productie. Alle Hielscher ultrasoonmachines zijn gebouwd voor de 24/7/365 werking onder volle belasting. Robuustheid en betrouwbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van onze ultrasone apparaten.
Alle digitale ultrasone homogenisatoren zijn uitgerust met slimme software, een gekleurd aanraakscherm en automatische gegevensprotocollering, die van het ultrasone apparaat een handig werkinstrument in het laboratorium en de productiefaciliteiten maken.
Laat ons weten, wat voor soort cellen, welk volume, met welke frequentie en met welk doel je je biologische monsters moet verwerken. Wij zullen u de meest geschikte ultrasone celverstoorder aanbevelen voor uw procesvereisten.
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van compacte handheld homogenisatoren en MultiSample Ultrasonicators tot industriële ultrasone processoren voor commerciële toepassingen:
| batch Volume | Stroomsnelheid | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| 96-wells / microtiterplaten | na | UIP400MTP |
| 10 flesjes à 0,5 tot 1,5mL | na | VialTweeter bij UP200St |
| 0.01 tot 250mL | 5 tot 100mL/min | UP50H |
| 0.01 tot 500mL | 10 tot 200 ml / min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100L | 2 tot 10 l / min | UIP4000hdT |
| na | 10 tot 100 l / min | UIP16000 |
| na | grotere | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Vraag ons!
ultrasonicator Uf200 ः t met 2mm microtip S26d2 voor het soneren van kleine monsters
Literatuur / Referenties
- Cheraghi S.; Akbarzade A.; Farhangi A.; Chiani M.; Saffari Z.; Ghassemi S.; Rastegari H.; Mehrabi M.R. (2010): Improved Production of L-lysine by Over-expression of Meso-diaminopimelate Decarboxylase Enzyme of Corynebacterium glutamicum in Escherichia coli. Pak J Biol Sci. 2010 May 15; 13(10), 2010. 504-508.
- LeThanh, H.; Neubauer, P.; Hoffmann, F. (2005): The small heat-shock proteins IbpA and IbpB reduce the stress load of recombinant Escherichia coli and delay degradation of inclusion bodies. Microb Cell Fact 4, 6; 2005.
- Martínez-Gómez A.I.; Martínez-Rodríguez S.; Clemente-Jiménez J.M.; Pozo-Dengra J.; Rodríguez-Vico F.; Las Heras-Vázquez F.J. (2007): Recombinant polycistronic structure of hydantoinase process genes in Escherichia coli for the production of optically pure D-amino acids. Appl Environ Microbiol. 73(5); 2007. 1525-1531.
- Kotowska M.; Pawlik K.; Smulczyk-Krawczyszyn A.; Bartosz-Bechowski H.; Kuczek K. (2009): Type II Thioesterase ScoT, Associated with Streptomyces coelicolor A3(2) Modular Polyketide Synthase Cpk, Hydrolyzes Acyl Residues and Has a Preference for Propionate. Appl Environ Microbiol. 75(4); 2009. 887-896.
Feiten die de moeite waard zijn om te weten
Escherichia Coli Bacteriën
Escherichia coli is een bacteriesoort, die niet-sportvormend is, gram-negatief en wordt gekenmerkt door de vorm van een rechte staaf. E.coli bacteriën zijn aanwezig in het milieu, in voedsel en in de darmen van mens en dier. E.coli is meestal beweeglijk door het gebruik van peritrichous flagella, maar er zijn ook niet-motiele types. E.coli zijn zogenaamde facultatief anaërobe chemoorganotrofe organismen, wat betekent dat ze in staat zijn om zowel de ademhaling als het fermentatieve metabolisme te beïnvloeden. De meeste E.coli-types zijn goedaardig en vervullen nuttige functies in het lichaam, bijv. het onderdrukken van de groei van schadelijke bacteriesoorten, het synthetiseren van vitaminen enz.
Escherichia coli bacteriecel van het zogenaamde B-type zijn een speciale categorie van E.coli stammen, die veel gebruikt worden in onderzoek naar mechanismen zoals bacteriofaaggevoeligheid of restrictiemodificatiesystemen. Verder worden E.coli-bacteriën gewaardeerd als betrouwbaar werkpaard voor eiwitexpressie in biotechnologische en biowetenschappelijke laboratoria. Zo worden E.coli bijvoorbeeld gebruikt om verbindingen zoals eiwitten en oligosacchariden op industriële schaal te synthetiseren. Door specifieke kenmerken zoals protease-deficiëntie, lage acetaatproductie bij een hoog glucoseniveau en verbeterde permeabiliteit zijn E.coli B-cellen de meest gebruikte gastheercellen voor de productie van genetisch gemanipuleerde eiwitten.
Recombinant Eiwit
Recombinante eiwitten (rProt) worden steeds belangrijker in tal van sectoren, waaronder de chemische productie, de farmaceutische industrie, de cosmetica, de menselijke en dierlijke geneeskunde, de landbouw, de levensmiddelenindustrie en de afvalverwerking.
De productie van recombinant eiwit vereist het gebruik van een expressiesysteem. Als expressiesysteem voor de productie van recombinant-DNA kunnen zowel prokaryote als eukaryote cellen worden gebruikt. Terwijl bacteriële cellen het meest gebruikt worden voor eiwitexpressie vanwege factoren als lage kosten, gemakkelijke schaalbaarheid en eenvoudige mediacondities, zijn zoogdier-, gist-, algen-, insecten- en celvrije systemen gevestigde alternatieven. Het eiwittype, de functionele activiteit en de vereiste opbrengst aan geëxpresseerd eiwit beïnvloeden de selectie van het celsysteem dat gebruikt wordt voor eiwitexpressie.
Om recombinant-eiwit tot expressie te brengen, moet een bepaalde cel getransfecteerd zijn met een DNA-vector die het sjabloon van recombinant-DNA bevat. De cellen die met het sjabloon zijn getransfecteerd, worden vervolgens gekweekt. Als gevolg van het cellulaire mechanisme transcriberen en vertalen de cellen het betreffende eiwit, waardoor het doeleiwit wordt geproduceerd.
Aangezien de uitgedrukte eiwitten in de celmatrix zijn ingesloten, moet de cel worden gelyseerd (ontregeld en gebroken) om de eiwitten vrij te geven. In een volgende zuiveringsstap wordt het eiwit gescheiden en gezuiverd.
Het eerste recombinante eiwit dat in de behandeling werd gebruikt was recombinante menselijke insuline in 1982. Vandaag de dag worden er wereldwijd meer dan 170 soorten recombinante eiwitten geproduceerd voor medische behandelingen. Veel gebruikte recombinante eiwitten in de geneeskunde zijn bijvoorbeeld recombinante hormonen, interferonen, interleukines, groeifactoren, tumornecrosefactoren, bloedstollingsfactoren, trombolytische geneesmiddelen en enzymen voor de behandeling van belangrijke ziekten zoals diabetes, dwerggroei, hartinfarct, congestief hartfalen, cerebrale apoplexie, multiple sclerose, neutropenie, trombocytopenie, bloedarmoede, hepatitis, reumatoïde artritis, astma, de ziekte van Crohn, en kankertherapieën. (zie Phuc V. Pham, in Omics Technologies en Bio-Engineering, 2018).
Hoogwaardige ultrasonica! Het productassortiment van Hielscher bestrijkt het volledige spectrum van de compacte ultrasone labo's over bench-top units tot volledig industriële ultrasone systemen.