Hielscher Echografietechniek

Ultrasone lysis van E. Coli

  • E. coli bacteriën zijn de meest gebruikte bacteriën in de microbiologie en biotechnologie.
  • Ultrasone cel verstoorders bieden betrouwbare en reproduceerbare resultaten voor de lysis van E. coli.
  • Intense en nauwkeurig controleerbare cavitatie en afschuifkrachten leiden tot volledige verstoring en hoge extractieopbrengsten (bijvoorbeeld proteïnen, DNA).

Cell Verstoring door cavitatie

Escherichia coli bacteriën betrouwbaar gelyseerd in een ultrasone weefselhomogenisers.Ultrasone probe-type homogenisatoren werken met ca. 20.000 cyclussen per seconde (bij 20 kHz) en veroorzaakt cavitatie in vloeistoffen of supsensions. Akoestische cavitatie microscopische gebieden van vacuüm-achtige drukken en hoge temperaturen dat cellen scheuren. Hoewel de temperaturen enkele duizenden graden Celsius kan oplopen, cavitatie volumes zijn zo klein dat ze het proces niet significant te verwarmen. De ultrasone gegenereerde akoestische cavitatie en afschuifkrachten perforeren of breken de celmembraan van E.coli – Afhankelijk van de instelinrichting van de ultrasone homogenisator.

Voordelen van Ultrasonic Lysis

  • nauwkeurige controle lysis (intensiteit, amplitude, temperatuur)
  • optimale aanpassing aan specifieke samples
  • temperatuurregeling
  • voor zeer kleine tot zeer grote monsters (pi naar liters)
  • pure mechanische behandeling
  • lineaire schaal-up van lab naar productie
De ultrasone inrichting VialTweeter toelaten om gelijktijdig monstervoorbereiding tot 10 flesjes onder dezelfde procesomstandigheden. (Klik om te vergroten!)

VialTweeter voor ultrasoon lyseren

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Terwijl chemische en enzymtic lysis kan problematisch zijn – aangezien chemische lysis eiwitstructuren kunnen veranderen en zuiveringsproblemen en enzymatische lysis introduceren vereist lange incubatietijden en is niet reproduceerbaar – ultrasone verstoring is een geavanceerde, snelle cel ontwrichting methode.
Ultrasone lysis is alleen gebaseerd op mechanische krachten. Er worden geen chemicaliën toegevoegd, sonicatie breekt de celwand door schuifkrachten. Chemische lyse kan de eiwitstructuur veranderen en zuiveringsproblemen veroorzaken. Enzymatische verstoring vereist lange incubatietijden en is niet reproduceerbaar. Ultrasone celverstoring van E.coli-bacteriën is snel, eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar. Daarom worden Hielscher ultrasonicatoren in biologische en biochemische laboratoria over de hele wereld gebruikt voor monstervoorbereiding, pre-anananlytica, in-vitrodiagnostiek en manifold assays.

Algemene aanbevelingen

UP400St ultrasonicator met stromingsreactorSonicatie is de meest populaire techniek voor het lyseren van zeer kleine, middelgrote en grote hoeveelheden celsuspensies – van pico-liter tot 100 liter / uur (met een ultrasonische stromingscel). De cellen worden gelyseerd door vloeistof afschuiving en cavitatie. DNA wordt ook afgeschoven tijdens sonicatie, dus is het niet nodig om DNAse aan de celsuspensie.
Temperatuurregeling:
Door vooraf afkoelen van het monster en het houden van het monster tijdens sonicatie op ijs proeven thermische afbraak van het monster kan eenvoudig voorkomen.
Idealiter worden de monsters tijdens de lysis ijskoud bewaard, maar voor de meeste monsters is het voldoende als de temperatuur niet boven de temperatuur van de kweek of weefselbron stijgt. Daarom is het aan te bevelen om de suspensie op het ijs te houden en om met enkele korte ultrasone pulsen van 5-10 sec. en pauzes van 10-30 sec. te sonificeren. Tijdens de pauzes kan de warmte worden afgevoerd om opnieuw een lage temperatuur te bereiken. Voor grotere celmonsters zijn verschillende stroomcelreactoren met koelmantels beschikbaar.

Protocollen voor de bereiding van E. coli lysaten

Expressie analyse en zuivering van recombinant eiwit

De E. coli pellet werd gesoniceerd met een ultrasoon systeem UP100H (Hielscher). Voor dit doel werd de celpellet opnieuw gesuspendeerd in gekoelde lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH = 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) en 10 minuten afgekoeld op ijs. Vervolgens werd de celsuspensie gesonificeerd met 10 korte uitbarstingen van 10 seconden gevolgd door een interval van 30 seconden voor afkoeling. Uiteindelijk werd celafval verwijderd door ultracentrifugatie bij 4 ° C gedurende 15 minuten bij 14000 rpm. Voor bevestiging van rPR-expressie werd het supernatant op 12% polyacrylamidegel gelopen en geanalyseerd met SDS-PAGE en Western-blotting. Zuivering van rPR werd uitgevoerd met behulp van Ni2+-NTA-hars (Invitrogen, USA) volgens de handleiding van de fabrikant. In dit stadium werd natief zuiveringsmethode gebruikt. De zuiverheid van het gezuiverde eiwit werd bepaald onder toepassing van elektroforese op 12% polyacrylamide gel en daaropvolgende Coomassie blauwkleuring. Gezuiverd eiwitconcentratie werd gemeten met Micro BCA eiwitassaykit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Ultrasone cel verbreker UP100H (100W) voor lysis celdisruptie en DNA afschuiving.

ultrasoon homogenisator UP100H (100W)

Celgroei, verknoping en Voorbereiding van de E. coli-cel Extracten

Voor SeqA en RNA polymerase ChIP-chip E. coli MG1655 of MG1655 ΔseqA werd gekweekt bij 37 ° C tot een OD600 van ongeveer 0,15 in 50 ml LB (+ 0,2% glucose) voordat 27 μl formaldehyde (37%) per ml medium werd toegevoegd (eindconcentratie 1%). Verknoping werd uitgevoerd bij langzaam schudden (100 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 20 min gevolgd door blussen met 10 ml 2,5 M glycine (eindconcentratie 0,5 M). Voor heat-shock-experimenten werd E. coli MG1655 gekweekt in 65 ml LB-medium bij 30 ° C tot een OD600 van ongeveer 0,3. Vervolgens werd 30 ml kweek overgebracht naar een voorverwarmde kolf bij 43 ° C en de rest werd op 30 ° C gehouden. Verknoping en uitdoving waren zoals hierboven beschreven, behalve dat de cellen 5 minuten op 30 of 43 ° C werden gehouden voor verder langzaam schudden bij kamertemperatuur. Cellen werden verzameld door centrifugatie en twee keer gewassen met koude TBS (pH 7,5). Na resuspensie in 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg / ml lysozym) en incubatie bij 37 ° C gedurende 30 min gevolgd door toevoeging van 4 ml IP buffer, cellen werden gesonificeerd op ijs met 12 keer 30 sec en 30 sec breekt bij een UP400St ultrasone processor (Hielscher GmbH Ultrasonics) met 100% vermogen. Na centrifugatie gedurende 10 minuten bij 9000 g, werden 800 gl aliquots van het supernatant bewaard bij -20 ° C. (Waldminghaus 2010)

Overproductie en zuivering van enzymen.

Voor overproductie van decahistidine (His10) gemerkte eiwitten, E. coli BL21 (DE3) werd getransformeerd met constructen pET19b. Een overnacht voorkweek werd geoogst door centrifugatie en 1% werd gebruikt om een ​​expressie te inoculeren. PET19mgtB cellen die werden gekweekt bij 22 ° C totdat een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) Van 0,7. De kweek werd naar 17 ° C en geïnduceerd met 100 uM IPTG. Na 16 uur werd de kweek geoogst door centrifugatie bij 7500 xg bij 4 ° C. Cellen werden geresuspendeerd in 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,3 M NaCl bij pH 7,4 en opengebroken door ultrasone trillingen met S2 micro-tip sonotrode op UP200St ultrasonicator (Hielscher, Teltow, Duitsland) bij een cyclus van 0,5 en een amplitude van 75%.
De overproductie van decahistidine-gemerkte GtfC werd geïnduceerd bij 37 ° C bij een OD600 van 0,6 met 100 uM IPTG. Cellen werden vervolgens gedurende 4 uur, geoogst en gelyseerd zoals hierboven voor MgtB vermeld.
Ruwe celextracten werden gecentrifugeerd bij 15.000 xg en 4 ° C om de celresten te sedimenteren. De geklaarde extracten werden op 1 ml HisTrap FF ruwe kolommen met behulp van een ÄKTAprime Plus systeem (GE Healthcare). De enzymen werden gezuiverd volgens het voorschrift van de fabrikant voor gradiëntelutie van His-gemerkte eiwitten. Geëlueerde eiwit oplossingen werden tweemaal gedialyseerd tegen 1000 volumes 50 mM PBS, pH 7,4, 0,3 M NaCl bij 4 ° C. De zuivering werd geanalyseerd met 12% SDS-PAGE. De concentratie van het eiwit werd bepaald door de Bradford methode met behulp van Roti-Quant (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Duitsland). (Rabausch et al. 2013)

Winning van eiwit uit E. coli bacteriën
Een aas eiwit van belang (in casu MTV1 van Arabidopsis thaliana) gefuseerd aan een GST tag tot expressie gebracht in BL21 Escherichia coli (E. coli) cellen.
1. Neem een ​​pellet van GST en GST-MTV1 (overeenkomend met 50 ml bacteriekweek) en resuspendeer elk in 2.5 ml ijskoude extractiebuffer.
2. Gebruik een ultrasonicator UP100H (Uitgerust met MS3 micropunt-sonotrode voor kleine volumes (2-5mL)) om de bacteriële cellen te verstoren totdat zij gelyseerd, wat wordt aangegeven door een verminderde dichtheid en verhoogde viscositeit. Dit heeft op ijs te voeren en het wordt aanbevolen om ultrasone trillingen in intervallen (bijvoorbeeld 10 sec sonicatie gevolgd door 10 sec op ijs etc.). Zorg moet worden genomen niet om ultrasone trillingen met een te hoge intensiteit. Wanneer schuimen of vorming van een wit neerslag wordt gedetecteerd, de intensiteit moet worden verlaagd.
3. Breng de gelyseerde bacteriën oplossing 1,5 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 4 ° C, 16.000 x g gedurende 20 min.

-Allicine gemodificeerde eiwitten in E. coli

De VialTweeter is een comfortabel ultrasonicator voor kleine steekproef homogeniseringBepaling van sulfhydryl Inhoud van 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoëzuur) (DTNB) Assay
Een E. coli MG1655 overnacht kweek gebruikt voor het inoculeren MOPS minimaal medium (1: 100). De cultuur werd aëroob gekweekt tot een A600 van 0,4 werd bereikt. De kweek werd verdeeld in drie 15-ml culturen stressbehandeling. Een onbehandelde cultuur diende als een negatieve controle. 0,79 mM allicine (128 ug ml-1) Of 1 mM diamide werd één van de resterende twee culturen elk toegevoegd. Kweken werden gedurende 15 min. 5 ml van elke kweek werden geoogst door centrifugatie (8525 x g, 4 ° C, 10 min). De cellen werden tweemaal gewassen met 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na wassen2HPO4, 2 mM KH2PO4pH 7,4, anaëroob voorafgaand aan gebruik bewaard) en gecentrifugeerd (13.000 x g, 4 ° C, 10 min). Cellen werden geresuspendeerd in lysisbuffer (PBS met 6 mM guanidinium HCI, pH 7,4) voorafgaand aan verstoring bij 4 ° C door middel van ultrasone trillingen (VialTweeter ultrasonicator, Hielscher GmbH, Duitsland) (3 x 1 min). Celafval werd tot pellet gecentrifugeerd (13.000 x g, 4 ° C, 15 min). De supernatant werd overgebracht naar een 3,5 ml QS-macro cuvette (10 mm) met een magnetische roerstaaf en gemengd met 1 ml lysisbuffer. Uitsterven van de monsters werd bij 412 nm met een Jasco V-650 spectrofotometer uitgerust met PSC-718 temperatuurgecontroleerde celhouder (Jasco) bij kamertemperatuur. 100 pl van een 3 mM dithiobis (2-nitrobenzoëzuur) -oplossing toegevoegd. Uitsterven werd gevolgd tot het verzadigingspunt bereikt. Berekening van thiol concentratie werd uitgevoerd met de extinctiecoëfficiënt ε412 = 13.700 M-1 cm-1 voor thio-2-nitrobenzoëzuur (TNB). Cellulaire thiol concentraties werden berekend op basis van een volume van E. coli-cellen van 6,7 x 10-15 l en een celdichtheid van A600 = 0,5 (overeenkomend met 1 x 108 cellen ml-1 cultuur). (Muller et al. 2016)

In Vivo Glutathion Bepaling

E. coli MG1655 werd gekweekt in MOPS minimaal medium in een totaal volume van 200 ml tot een A600 van 0,5 was bereikt. De kweek werd gesplitst in kweken van 50 ml voor stressbehandeling. Na 15 min incubatie met 0,79 mM allicine, 1 mM diamide of dimethylsulfoxide (controle), werden cellen geoogst bij 4.000 g bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Cellen werden tweemaal gewassen met KPE-buffer voorafgaand aan resuspensie van pellets in 700 μl KPE-buffer. Voor deproteinering werd 300 1 10% (gew./vol.) Sulfosalicylzuur toegevoegd voorafgaand aan verstoring van cellen door middel van ultrasone trillingen (3 x 1 min; VialTweeter ultrasonicator). Supernatanten werden verzameld na centrifugatie (30 min, 13.000 g, 4 ° C). Sulfosalicylzuur concentraties werden verlaagd tot 1% door toevoeging van 3 volumes buffer KPE. Metingen van de totale glutathion en GSSG werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Glutathion concentraties werden berekend op basis van een volume van E. coli cellen van 6,7×10-15 l en een celdichtheid van A600 00,5 (equivalent aan 1×108 cellen ml-1 cultuur). GSH-concentraties werden berekend door aftrekken van 2 [GSSG] van total glutathion. (Muller et al. 2016)

Ultrasone verstoorder voor cellyse en extractie van biologisch materiaal (klik om te vergroten!)

Sonde-type ultrasoonapparaat UP400St

Expressie van menselijke mAspAT in E. coli

Ultrasone cel verbreker UP400St (400W) voor het extraheren van intracellulaire materiaal (bijvoorbeeld eiwitten, organellen, DNA, RNA enz.)De enkele kolonie van E. coli BL21 (DE3) die het op expressievector in 30 ml Luria-Bertani (LB) medium dat 100 ug / ml ampicilline, en vervolgens gecultiveerd bij 37 ° C totdat de optische dichtheid (OD600) 0,6 bereikte. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 4000 x g gedurende 10 min en geresuspendeerd in 3L vers LB-medium dat 100 ug / ml ampicilline.
Vervolgens werd eiwitexpressie geïnduceerd met 1 mM isopropyl-β ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) gedurende 20 uur bij 16 ° C. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 8000 xg gedurende 15 minuten gewassen met buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Benaderd 45 g (natgewicht) cellen werden verkregen van 3 liter kweek. Na centrifugeren werd de celpellets opnieuw gesuspendeerd in 40 ml (1 l kweek) ijskoude extractiebuffer A, en gelyseerd door ultrasone trillingen bij ijskoude temperatuur met behulp van een UP400St instrument (Dr. Hielscher GmbH, Duitsland). De cellysis werd gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 15 min om oplosbare (supernatant) en geprecipiteerd (pellet) fracties te scheiden. (Jiang et al. 2015)

Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators:

batch Volume Stroomsnelheid Aanbevolen apparaten
00,5 tot 1,5 ml na VialTweeter
1 tot 500 ml 10 tot 200 ml / min UP100H
10 tot 2000 ml 20 tot 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St
0.1 tot 20L 0.2 tot 4L / min UIP2000hdT
10 tot 100L 2 tot 10 l / min UIP4000
na 10 tot 100 l / min UIP16000
na grotere cluster van UIP16000

Neem contact met ons op! / Vraag ons!

Gebruik het onderstaande formulier als u aanvullende informatie wilt over ultrasone homogenisatie. We zullen u graag een ultrasoon systeem aanbieden dat aan uw eisen voldoet.









Let op onze Privacybeleid.


Literatuur / Referenties



Feiten die de moeite waard zijn om te weten

E coli

Escherichia coli (E. coli) is een gramnegatieve, facultatief anaërobe, staafvormige, coliforme bacterie van het geslacht Escherichia die gewoonlijk wordt aangetroffen in de lagere darm van warmbloedige organismen (endothermen). Er is een groot aantal E. coli-stammen (of subtypen) met verschillende kenmerken. De meeste E. coli-stammen zijn onschadelijk voor mensen, bijv. B- en K-12-stammen die gewoonlijk worden gebruikt voor onderzoekstoepassingen in laboratoria. Sommige stammen zijn echter schadelijk en kunnen ernstige ziekten veroorzaken.
E. coli speelt een belangrijke rol in de moderne bio-engineering en industriële microbiologie, omdat de bacteriën is gemakkelijk te manipuleren. Gemeenschappelijke lab toepassingen die vaak het gebruik van E. coli, omvatten b.v. recombinant deoxyribonucleïnezuur (DNA) maken of om als modelorganisme.
E. coli is een zeer veelzijdig gastheer voor de productie van heterologe proteïnen en spruitstuk eiwitexpressie zijn verkrijgbaar voor de productie van recombinante eiwitten in E. coli. Plasmiden gebruikt die hoge expressie van eiwit, kunnen genen worden ingebracht in de bacterie, waardoor dergelijke eiwitten in grote hoeveelheden industriële fermentatieprocessen.
E.coli worden gebruikt als celfabrieken voor insuline. Verdere toepassingen omvatten het gebruik van gemodificeerde E. coli-cellen ontwikkelen en produceren van vaccins en geïmmobiliseerde enzymen, productie van biobrandstoffen, en voor zuivering.
De stam K-12 is een gemuteerde vorm van E. coli die overexpressie van het enzym alkalische fosfatase (ALP). Deze mutatie wordt veroorzaakt door een defect in het gen dat continu codeert voor het enzym. Als een gen produceert een product zonder enige remming dit staat bekend als constitutieve activiteit. Deze specifieke gemuteerde vorm wordt gebruikt voor isolatie en zuivering van het enzym ALP.

Ultrasone DNA Shearing

Ultrasone schuifkrachten een gewoonlijk gebruikte methode te scheiden van de cel en DNA-strengen in stukken breken. Akoestische cavitatie breekt de celwanden en membranen extraheren van DNA uit cellen en het genereren van fragmenten van ongeveer 600 – 800 bp in lengte, wat ideaal is voor analyse.
Klik hier voor meer informatie over ultrasone homogenisatoren voor DNA-fragmentatie te leren!