Ultrasone lysis van E. Coli

E. coli-bacteriën zijn de meest gebruikte bacteriën in de microbiologie en biotechnologie.
Ultrasone celontsluiters leveren betrouwbare en reproduceerbare resultaten voor de lysis van E. coli.
Intense maar nauwkeurig regelbare cavitatie en afschuifkrachten leiden tot volledige ontsluiting en hoge extractieopbrengsten (bijv. eiwitten, DNA).

Waarom is ultrasone celontsluiting van E. coli de voorkeursmethode?

Ultrasone homogenisatoren of sonicators met een sonde bieden verschillende voordelen voor de lysis van E. coli, omdat intens ultrageluid celwanden en membranen efficiënt ontsluit. Sonicators met een sonde worden om de volgende redenen veel gebruikt voor de lysis van E. coli:

Efficiënte ontsluiting van celwanden: E. coli heeft een halfstijve celwand die uit peptidoglycaan bestaat en die met traditionele lysismethoden moeilijk af te breken kan zijn. Een sonicator met een sonde genereert intense ultrasone golven die cavitatiebellen creëren in de vloeistof rondom de cellen. Wanneer deze bellen imploderen, genereren ze vloeistofstralen met hoge snelheid en schokgolven die tot mechanische ontsluiting van de celwanden leiden, waardoor celinhoud zoals biomoleculen effectief vrijkomt.

Verbeterde penetratie: De ultrasone golven die door de sonde / sonotrode worden gegenereerd, kunnen diep in het monster doordringen, een groter aantal E. coli-cellen bereiken en deze gelijkmatig behandelen. Dit helpt ervoor te zorgen dat de lysis in het hele monster gelijkmatiger verloopt, wat tot een hogere efficiëntie van de celontsluiting leidt.

Kortere verwerkingstijd: De energie die door de sonicator met een sonde wordt geleverd, is sterk geconcentreerd en gelokaliseerd, wat tot snelle en efficiënte cellysis leidt. Vergeleken met andere methoden zoals behandeling met parels of enzymatische lysis kan sonicatie binnen minuten of zelfs seconden lysis van E. coli bereiken. Terwijl veel alternatieve technieken, zoals invriezen en ontdooien, meerdere behandelingsrondes vereisen, opent ultrasone lysis de cellen in één processtap.

Temperatuurregeling: Geavanceerde sonicators zijn uitgerust met temperatuursensoren en slimme software waarmee een maximale procestemperatuur kan worden ingesteld. De sonicator pauzeert automatisch wanneer de temperatuurgrens wordt bereikt en start het sonicatieproces wanneer een ingesteld temperatuurpunt wordt bereikt. Het koelen van de monsters in een ijsbad is een eenvoudige methode om de monstertemperatuur laag te houden en door warmte veroorzaakte degradatie van het monster te voorkomen.

Schaalbaarheid: Sonicators met een sonde zijn verkrijgbaar in verschillende formaten, van handapparaten tot grootschalige industriële modellen. Daardoor zijn ze geschikt voor het verwerken van kleine volumes in het laboratorium of voor opschaling naar grotere bioprocesstoepassingen, bijvoorbeeld vaccinproductie of biosynthese van moleculen.

Veelzijdigheid: Sonicators kunnen naast cellysis voor verschillende toepassingen worden gebruikt, zoals afschuiving van DNA, eiwitextractie, weefselhomogenisatie, dispersie van nanodeeltjes en emulgering. Investeren in een sonicator met een sonde biedt daarom veelzijdigheid in onderzoeks- of industriële omgevingen.

Sonicators met een sonde zoals de UP200St zijn betrouwbare weefselhomogenisatoren en celontsluiters en worden daarom veel gebruikt voor monstervoorbereiding in de genetica, bijvoorbeeld voor de lysis van E.coli

Eiwitextractie uit E.coli-cellen wordt efficiënt uitgevoerd met de ultrasone sonde UP200St

Een sonicator met een sonde biedt veel voordelen voor de lysis van E. coli. Dankzij de betrouwbare en nauwkeurige regeling van ultrasone procesparameters kunnen bedrijfsparameters zoals vermogen, duur en monsterbehandeling worden geoptimaliseerd om de gewenste resultaten te bereiken.

Deze instructievideo legt uit welk type sonicator het meest geschikt is voor uw monstervoorbereiding, zoals lyse, celontsluiting, eiwitisolatie en fragmentatie van DNA en RNA in laboratoria, analyse en onderzoek. Kies het ideale type sonicator voor uw toepassing, monstervolume, aantal monsters en verwerkingscapaciteit. Hielscher Ultrasonics heeft de ideale ultrasone homogenisator voor u!

Ultrasone DNA-fragmentatie wordt vaak gebruikt als stap in de monstervoorbereiding voor next-generation sequencing (NGS)

Elektroforetische analyses van genomisch DNA van E. coli EDL933 dat aan 0 – 15 min sonicatie werd onderworpen. L geeft de DNA-ladder aan.
(onderzoek en afbeelding: ©Basselet et al. 2008)

Celontsluiting met ultrasone cavitatie

Ultrasone homogenisatoren met een sonde werken met ongeveer 20.000 cycli per seconde (bij 20kHz) en veroorzaken cavitatie in vloeistoffen of suspensies. Akoestische cavitatie creëert microscopische gebieden met vacuümachtige drukken en hoge temperaturen die cellen uit elkaar scheuren. Hoewel de temperaturen enkele duizenden graden Celsius kunnen bereiken, zijn de cavitatievolumes zo klein dat ze het proces niet aanzienlijk verwarmen. Door ultrageluid gegenereerde akoestische cavitatie en afschuifkrachten perforeren of breken het celmembraan van bacteriële cellen zoals E.coli. Sonicators van Hielscher maken nauwkeurige regeling mogelijk van procesparameters zoals ultrasone intensiteit, amplitude, energietoevoer en temperatuur. Daardoor kan het ultrasone lysisproces optimaal worden afgestemd op het celtype, de celcultuur en het procesdoel.

Voordelen van ultrasone lysis

nauwkeurige regeling van de lysis (intensiteit, amplitude, temperatuur)
betrouwbare, reproduceerbare resultaten
optimale afstemming op specifieke monsters
temperatuurregeling
voor zeer kleine tot zeer grote monsters (µL tot liters)
uitsluitend mechanische behandeling
gebruiksvriendelijke, veilige bediening
lineaire opschaling van laboratorium naar productie

Het ultrasone apparaat VialTweeter maakt gelijktijdige monstervoorbereiding van maximaal 10 monsterflesjes onder dezelfde procesomstandigheden mogelijk. (Klik om te vergroten!)

VialTweeter voor ultrasone lysis

Ultrasone homogenisator versus andere lysistechnieken

Hoewel chemische en enzymatische lysis problematisch kunnen zijn – omdat chemische lysis eiwitstructuren kan veranderen en zuiveringsproblemen kan veroorzaken, en enzymatische lysis lange incubatietijden vereist en niet reproduceerbaar is – is ultrasone ontsluiting een geavanceerde, snelle methode voor celontsluiting.
Ultrasone lysis is uitsluitend gebaseerd op mechanische krachten. Er worden geen chemicaliën toegevoegd; sonicatie breekt de celwand door afschuifkrachten. Chemische lysis kan de eiwitstructuur veranderen en zuiveringsproblemen veroorzaken. Enzymatische ontsluiting vereist lange incubatietijden en is niet reproduceerbaar. Ultrasone celontsluiting van E.coli-bacteriecellen is snel, eenvoudig, betrouwbaar en reproduceerbaar. Daarom worden sonicators van Hielscher wereldwijd in biologische en biochemische laboratoria gebruikt voor monstervoorbereiding, preanalyse, in-vitrodiagnostiek en uiteenlopende assays.

Algemene aanbevelingen voor ultrasone lysis

Sonicatie is de populairste techniek voor het lyseren van zeer kleine, middelgrote en grote hoeveelheden celsuspensies – van picoliters tot maximaal 100L/hr (met een ultrasone doorstroomcel). Cellen worden gelyseerd door afschuiving in de vloeistof en cavitatie. DNA wordt tijdens sonicatie ook door afschuiving gefragmenteerd, zodat het niet nodig is DNase aan de celsuspensie toe te voegen.

Temperatuurregeling tijdens ultrasone lysis van E.coli
Door het monster vooraf te koelen en het tijdens de sonicatie op ijs te houden, kan thermische degradatie van het monster eenvoudig worden voorkomen.
Idealiter moeten monsters tijdens de lysis ijskoud worden gehouden, maar voor de meeste monsters is het voldoende als de temperatuur niet boven de temperatuur van de cultuur of de weefselbron stijgt. Daarom wordt aanbevolen de suspensie op ijs te houden en te soniceren met meerdere korte ultrasone pulsen van 5–10 sec en pauzes van 10–30 sec. Tijdens de pauzes kan de warmte worden afgevoerd om opnieuw een lage temperatuur te bereiken. Voor grotere celmonsters zijn verschillende doorstroomcelreactoren met koelmantels beschikbaar.
Lees hier uitgebreide tips en aanbevelingen voor succesvolle ultrasone lysis!

Protocollen voor de ultrasone bereiding van E. Coli-lysaten

Onderzoekers gebruiken ultrasone homogenisatoren van Hielscher voor celontsluiting van E.coli. Hieronder vindt u verschillende geteste en beproefde protocollen voor de lysis van E.coli met ultrasone homogenisatoren van Hielscher voor uiteenlopende toepassingen met E. coli.

Celgroei, crosslinking en bereiding van celextracten van E. coli met ultrageluid

Voor SeqA- en RNA-polymerase-ChIP-Chip werd E. coli MG1655 of MG1655 ΔseqA bij 37°C gekweekt tot een OD₆₀₀ van ongeveer 0,15 in 50 ml LB (+ 0,2% glucose), waarna 27 μl formaldehyde (37%) per ml medium werd toegevoegd (eindconcentratie 1%). Crosslinking werd gedurende 20 min bij kamertemperatuur uitgevoerd onder langzaam schudden (100 rpm), gevolgd door het stoppen van de reactie met 10 ml 2,5 M glycine (eindconcentratie 0,5 M). Voor hitteschokexperimenten werd E. coli MG1655 in 65 ml LB-medium bij 30°C gekweekt tot een OD₆₀₀ van ongeveer 0,3. Vervolgens werd 30 ml cultuur overgebracht naar een voorverwarmde kolf bij 43°C en werd de rest bij 30°C gehouden. Crosslinking en het stoppen van de reactie werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven, behalve dat de cellen gedurende 5 min bij 30 of 43°C werden gehouden voordat ze verder langzaam werden geschud bij kamertemperatuur. Cellen werden verzameld door centrifugatie en tweemaal gewassen met koude TBS (pH7.5). Na resuspensie in 1 ml lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 20% sucrose, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mg/ml lysozym) en incubatie bij 37°C gedurende 30 min, gevolgd door toevoeging van 4 ml IP-buffer, werden de cellen op ijs gesoniceerd met 12 keer 30 sec en pauzes van 30 sec, met de ultrasone processor UP400St van Hielscher bij een vermogensinstelling van 100%. Na centrifugatie gedurende 10 min bij 9000 g werden aliquots van 800 μl van het supernatant bij -20°C bewaard. (Waldminghaus 2010)

Overproductie en zuivering van enzymen met een ultrasone sonde

Voor overproductie van eiwitten met een decahistidinetag (His10) werd E. coli BL21(DE3) getransformeerd met constructen van pET19b. Een gedurende de nacht gekweekte voorcultuur werd geoogst door centrifugatie en 1% werd gebruikt om een expressiecultuur te enten. Cellen met pET19mgtB werden bij 22°C gekweekt tot een optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,7. De cultuur werd overgebracht naar 17°C en geïnduceerd met 100 μM IPTG. Na 16 h werd de cultuur geoogst door centrifugatie bij 7.500 × g en 4°C. Cellen werden geresuspendeerd in 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,3 M NaCl bij pH 7,4 en ontsloten door sonicatie met een microtipsonotrode S2 op de sonicator UP200St van Hielscher bij een cyclus van 0,5 en een amplitude van 75%.
De overproductie van GtfC met een decahistidinetag werd bij 37°C geïnduceerd bij een OD₆₀₀ van 0,6 met 100 μM IPTG. Vervolgens werden de cellen gedurende 4 h geïncubeerd, geoogst en gelyseerd zoals hierboven beschreven voor MgtB.
Ruwe celextracten werden gecentrifugeerd bij 15.000 × g en 4°C om de celresten te laten sedimenteren. De geklaarde extracten werden met een ÄKTAprime Plus-systeem op 1-ml HisTrap FF Crude-kolommen geladen. De enzymen werden gezuiverd volgens het protocol van de fabrikant voor gradiëntelutie van eiwitten met een His-tag. Geëlueerde eiwitoplossingen werden tweemaal gedialyseerd tegen 1.000 volumes 50 mM PBS, pH 7,4, met 0,3 M NaCl bij 4°C. De zuivering werd geanalyseerd met 12% SDS-PAGE. De eiwitconcentratie werd bepaald met de Bradford-methode met Roti-Quant. (Rabausch et al. 2013)

Ultrasone extractie van eiwit uit E. coli-bacteriën
Een lokaaseiwit van belang (in dit geval MTV1 van Arabidopsis thaliana) wordt gefuseerd met een GST-tag en tot expressie gebracht in BL21 Escherichia coli (E. coli)-cellen.

Neem één pellet van zowel GST-MTV1 als GST (overeenkomend met 50 ml bacteriecultuur) en resuspendeer elk pellet in 2,5 mL ijskoude extractiebuffer.
Gebruik een sonicator UP100H (uitgerust met een microtipsonotrode MS3 voor kleine volumes van ongeveer 2–5mL) om de bacteriecellen te ontsluiten totdat ze gelyseerd zijn, wat wordt aangegeven door verminderde troebelheid en verhoogde viscositeit. Dit moet op ijs worden uitgevoerd en het wordt aanbevolen in intervallen te soniceren (bijv. 10 sec sonicatie gevolgd door 10 sec pauze op ijs, enzovoort). Zorg ervoor dat er niet met een te hoge intensiteit wordt gesoniceerd. Als schuimvorming of de vorming van een wit neerslag wordt waargenomen, moet de intensiteit worden verlaagd.
Breng de oplossing met gelyseerde bacteriën over naar microcentrifugebuisjes van 1,5 mL en centrifugeer bij 4°C, 16.000 x g gedurende 20 min.

Ultrasone sondes gebruiken de krachten van akoestische cavitatie om cellen te ontsluiten en moleculen en DNA uit E.coli te extraheren.

Sonicators met een sonde zoals de UP400St gebruiken het werkingsprincipe van akoestische cavitatie voor efficiënte lysis van E.coli.

Expressieanalyse en zuivering van recombinant eiwit met sonicatie

Het E. coli-pellet werd gesoniceerd met de sonicator UP100H van Hielscher. Hiervoor werd het celpellet geresuspendeerd in gekoelde lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH=7,5, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 1 mM PMSF) en gedurende 10 min op ijs gekoeld. Vervolgens werd de celsuspensie gesoniceerd met 10 korte pulsen van 10 s, gevolgd door een interval van 30 s voor koeling. Ten slotte werden celresten verwijderd door ultracentrifugatie bij 4°C gedurende 15 min bij 14.000 rpm. Ter bevestiging van de expressie van rPR werd het supernatant op een 12% polyacrylamidegel gescheiden en geanalyseerd met SDS-PAGE en westernblotting. Zuivering van rPR werd uitgevoerd met Ni2+-NTA-hars (Invitrogen, USA) volgens de handleiding van de fabrikant. In deze fase werd een natieve zuiveringsmethode gebruikt. De zuiverheid van het gezuiverde eiwit werd beoordeeld met elektroforese op een 12% polyacrylamidegel en daaropvolgende kleuring met Coomassieblauw. De concentratie van het gezuiverde eiwit werd gemeten met de Micro BCA protein assay kit (PIERCE, USA). (Azarnezhad et al. 2016)

Deze video toont de ultrasone cuphorn van 200 watt voor het dispergeren, homogeniseren, extraheren of ontgassen van laboratoriummonsters.

Ultrasone homogenisatoren voor de lysis van E. coli

Hielscher Ultrasonics ontwerpt, produceert en levert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties voor betrouwbare en efficiënte lysis van E. coli-bacteriën en andere celtypen, weefsels en celculturen.
Dankzij het brede assortiment ultrasone sondes en systemen voor indirecte sonicatie kunnen wij u de ideale ultrasone weefselhomogenisator bieden voor uw toepassing voor celontsluiting en extractie.

Ontwerp, productie en advies – kwaliteit uit Duitsland

Sonicators van Hielscher staan bekend om hun hoogste kwaliteits- en ontwerpnormen. Slimme software, een intuïtief menu, programmeerbare instellingen en automatische gegevensregistratie zijn slechts enkele kenmerken van sonicators van Hielscher. Robuustheid en eenvoudige bediening maken een soepele integratie van onze sonicators in onderzoeks- en biotechfaciliteiten mogelijk. Sonicators van Hielscher kunnen zelfs zware omstandigheden en veeleisende omgevingen gemakkelijk aan.

Hielscher Ultrasonics is een ISO-gecertificeerd bedrijf en legt bijzondere nadruk op sonicators met hoge prestaties met geavanceerde technologie en gebruiksvriendelijkheid. Uiteraard zijn sonicators van Hielscher CE-conform en voldoen ze aan de eisen van UL, CSA en RoHs.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze sonicators:

Batchvolume	Debiet	Aanbevolen apparaten
multiwellplaten / microtiterplaten	n.v.t.	UIP400MTP
CupHorn voor monsterflesjes of een bekerglas	n.v.t.	Ultrasone CupHorn
ultrasone microdoorstroomreactor	n.v.t.	GDmini2
tot 10 monsterflesjes met 0,5 tot 1,5mL	n.v.t.	VialTweeter
0,5 tot 1,5mL	n.v.t.	VialTweeter
1 tot 500mL	10 tot 200mL/min	UP100H
10 tot 2000mL	20 tot 400mL/min	UP200Ht, UP400St
0,1 tot 20L	0,2 tot 4L/min	UIP2000hdT
10 tot 100L	2 tot 10L/min	UIP4000
n.v.t.	10 tot 100L/min	UIP16000
n.v.t.	hoger	cluster van UIP16000

Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!

De video toont het ultrasone monstervoorbereidingssysteem UIP400MTP, waarmee alle gangbare multiwellplaten betrouwbaar kunnen worden behandeld met ultrageluid van hoge intensiteit. Typische toepassingen van de UIP400MTP zijn cellyse, fragmentatie van DNA, RNA en chromatine, en eiwitextractie.

Aanvullende protocollen voor ultrasone lysis van E. coli

Met allicine gemodificeerde eiwitten in E. coli met een ultrasone VialTweeter

Bepaling van het sulfhydrylgehalte met een assay met 5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoëzuur) (DTNB)
Een gedurende de nacht gekweekte E. coli MG1655-cultuur werd gebruikt om MOPS-minimaalmedium te enten (1:100). De cultuur werd aeroob gekweekt totdat een A600 van 0,4 werd bereikt. De cultuur werd verdeeld in drie culturen van 15 ml voor stressbehandeling. Een onbehandelde cultuur diende als negatieve controle. Aan de ene resterende cultuur werd 0,79 mM allicine (128 μg ml-1) toegevoegd en aan de andere 1 mM diamide. De culturen werden gedurende 15 min geïncubeerd. Van elke cultuur werd 5 ml geoogst door centrifugatie (8.525 × g, 4°C, 10 min). Cellen werden tweemaal gewassen met 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, vóór gebruik anaeroob bewaard) en gecentrifugeerd (13.000 × g, 4°C, 10 min). Cellen werden geresuspendeerd in lysisbuffer (PBS met 6 mM guanidinium HCl, pH 7,4) vóór ontsluiting bij 4°C door sonicatie (sonicator VialTweeter , Hielscher GmbH, Duitsland) (3 × 1 min). Celresten werden gepelleteerd door centrifugatie (13.000 × g, 4 °C, 15 min). Het supernatant werd overgebracht naar een QS-macrocuvet van 3,5 ml (10 mm) met een magnetisch roerstaafje en gemengd met 1 ml lysisbuffer. De extinctie van de monsters werd bij 412 nm gevolgd met een Jasco V-650-spectrofotometer, uitgerust met de temperatuurgeregelde cuvethouder PSC-718, bij kamertemperatuur. Er werd 100μl van een 3 mM oplossing van dithiobis(2-nitrobenzoëzuur) toegevoegd. De extinctie werd gevolgd totdat deze verzadiging bereikte. De thiolconcentratie werd berekend met de extinctiecoëfficiënt ϵ₄₁₂ = 13.700 M^-1 cm^-1 voor thio-2-nitrobenzoëzuur (TNB). Cellulaire thiolconcentraties werden berekend op basis van een volume van E. coli-cellen van 6,7 × 10^-15 liter en een celdichtheid van A600 = 0,5 (overeenkomend met 1 × 10⁸ cellen ml^-1 cultuur). (Müller et al. 2016)

In-vivobepaling van glutathion met een ultrasone celontsluiter

E.coli MG1655 werd in MOPS-minimaalmedium gekweekt in een totaal volume van 200ml totdat een A600 van 0,5 werd bereikt. De cultuur werd verdeeld in culturen van 50 ml voor stressbehandeling. Na 15 min incubatie met 0,79 mM allicine, 1 mM diamide of dimethylsulfoxide (controle) werden cellen geoogst bij 4.000g en 4°C gedurende 10 min. Cellen werden tweemaal gewassen met KPE-buffer voordat de pellets in 700µl KPE-buffer werden geresuspendeerd. Voor deproteïnisatie werd 300l 10% (w/v) sulfosalicylzuur toegevoegd vóór ontsluiting van de cellen door sonicatie (3 x 1 min; sonicator VialTweeter ). Supernatanten werden verzameld na centrifugatie (30 min, 13.000g, 4°C). De concentraties sulfosalicylzuur werden verlaagd tot 1% door toevoeging van 3 volumes KPE-buffer. Metingen van totaal glutathion en GSSG werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Cellulaire glutathionconcentraties werden berekend op basis van een volume van E. coli-cellen van 6,7×10^-15 liter en een celdichtheid van A600 0,5 (overeenkomend met 1×10⁸ cellen ml^-1 cultuur). GSH-concentraties werden berekend door 2[GSSG] af te trekken van het totale glutathion. (Müller et al. 2016)

Expressie van humaan mAspAT in E. coli met een ultrasone homogenisator

Een enkele kolonie van E. coli BL21 (DE3) met de expressievector werd in 30 mL Luria-Bertani (LB)-medium met 100μg/mL ampicilline gebracht en vervolgens bij 37ºC gekweekt totdat de optische dichtheid (OD₆₀₀) 0,6 bereikte. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 4.000 × g gedurende 10 min en geresuspendeerd in 3L vers LB-medium met 100μg/mL ampicilline.
Vervolgens werd de eiwitexpressie geïnduceerd met 1 mM isopropyl β-ᴅ-1-thiogalactopyranoside (IPTG) gedurende 20 h bij 16ºC. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 8.000 × g gedurende 15 min en gewassen met buffer A (20 mM NaH2PO4, 0,5 M NaCl, pH 7,4). Uit 3 L cultuur werd ongeveer 45g (natgewicht) cellen verkregen. Na centrifugatie werden de celpellets geresuspendeerd in 40 mL (voor 1 L cultuur) ijskoude extractiebuffer A en bij ijskoude temperatuur gelyseerd door sonicatie met de ultrasone celontsluiter UP400St van Hielscher. Het cellysaat werd gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 15 min om oplosbare (supernatant) en neergeslagen (pellet) fracties te scheiden. (Jiang et al. 2015)

Verwante onderwerpen

Wetenswaardigheden

E.coli

Escherichia coli (E. coli) is een gramnegatieve, facultatief anaerobe, staafvormige, coliforme bacterie van het geslacht Escherichia die vaak wordt aangetroffen in het onderste deel van de darm van warmbloedige organismen (endothermen). Er bestaan veel E. coli-stammen (of subtypen) met uiteenlopende eigenschappen. De meeste E. coli-stammen zijn onschadelijk voor mensen, bijvoorbeeld de B- en K-12-stammen die veel worden gebruikt voor onderzoekstoepassingen in laboratoria. Sommige stammen zijn echter schadelijk en kunnen ernstige ziekte veroorzaken.
E. coli speelt een belangrijke rol in de moderne biologische technologie en industriële microbiologie, omdat de bacterie eenvoudig te manipuleren is. Veelvoorkomende laboratoriumtoepassingen waarbij E. coli vaak wordt gebruikt, zijn bijvoorbeeld het maken van recombinant desoxyribonucleïnezuur (DNA) of het gebruik als modelorganisme.
E. coli is een zeer veelzijdige gastheer voor de productie van heterologe eiwitten, en er zijn uiteenlopende eiwitexpressiesystemen beschikbaar om recombinante eiwitten in E. coli te produceren. Met plasmiden die een hoog niveau van eiwitexpressie mogelijk maken, kunnen genen in de bacteriën worden ingebracht, waardoor dergelijke eiwitten in grote hoeveelheden kunnen worden geproduceerd in industriële fermentatieprocessen.
E.coli wordt gebruikt als celfabriek om insuline te produceren. Verdere toepassingen omvatten het gebruik van gemodificeerde E. coli-cellen voor het ontwikkelen en produceren van vaccins en geïmmobiliseerde enzymen, voor het produceren van biobrandstoffen en voor bioremediatie.
De stam K-12 is een mutantvorm van E. coli die het enzym alkalische fosfatase (ALP) tot overexpressie brengt. Deze mutatie ontstaat door een defect in het gen dat voortdurend voor het enzym codeert. Als een gen zonder enige remming een product produceert, wordt dit constitutieve activiteit genoemd. Deze specifieke mutantvorm wordt gebruikt voor isolatie en zuivering van het ALP-enzym.
E. coli-bacteriën worden ook veel gebruikt als celfabrieken. Gemodificeerde microben (bijv. bacteriën) en plantencellen kunnen worden gebruikt als zogenoemde celfabrieken. Deze genetisch gemodificeerde cellen produceren moleculen, chemicaliën, polymeren, eiwitten en andere stoffen die bijvoorbeeld in de farmaceutische industrie, voedingsmiddelenindustrie en chemische industrie worden gebruikt. Om de moleculen vrij te maken die binnen dergelijke biotechnologisch gemodificeerde cellen worden geproduceerd, is ultrasone lysis een veelgebruikte methode om de celwanden te ontsluiten en de doelstoffen naar de omringende vloeistof over te brengen. Lees meer over de lysis van biotechnologisch gemodificeerde cellen!

Ultrasone afschuiving van DNA

Ultrasone afschuifkrachten zijn een veelgebruikte methode om moleculen, organellen en eiwitten uit het celinterieur vrij te maken en om DNA-strengen in stukken te breken. Akoestische cavitatie breekt de celwanden en membranen om DNA uit cellen te extraheren en fragmenten met een lengte van ongeveer 600 – 800 bp te genereren, wat ideaal is voor analyse.
Klik hier voor meer informatie over ultrasone homogenisatoren voor DNA-fragmentatie!

Literatuur / Referenties

Azarnezhad A., Sharifi Z., Seyedabadi R., Hosseini A., Johari B., Sobhani Fard M. (2016): Cloning and Expression of Soluble Recombinant HIV-1 CRF35 Protease-HP Thioredoxin Fusion Protein. Avicenna J Med Biotechnol. 8(4), 2016. 175–181.
Jiang X., Wang J., Chang H.; Zhou Y. (2016): Recombinant expression, purification and crystallographic studies of the mature form of human mitochondrial aspartate aminotransferase. BioScience Trends 2016.
Müller A., Eller J., Albrecht F., Prochnow P., Kuhlmann K., Bandow J.E., Slusarenko A.J., Leichert L.I.O. (2016): Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. Journal of Biological Chemistry Vol. 291, No. 22, 2016. 11477–11490.
Rabausch U., Juergensen J., Ilmberger N., Böhnke S., Fischer S., Schubach B., Schulte M., Streit W. R. (2013): Functional Screening of Metagenome and Genome Libraries for Detection of Novel Flavonoid-Modifying Enzymes. Applied and Environmental Microbiology 79(15), 2013. 4551–4563.
Sauer M. (2014): MTV1 Pull-down Assay in Arabidopsis. bio-protocol Vol 4, Iss 12, Jun 20, 2014.
Waldminghaus T., Skarstad K. (2010): ChIP on Chip: surprising results are often artifacts. BMC Genomics 11, 2010. 414.

Ultrageluid met hoge prestaties! Het productassortiment van Hielscher bestrijkt het volledige spectrum, van de compacte laboratoriumsonicator via tafelmodellen tot volledig industriële ultrasone systemen.

Hielscher Ultrasonics produceert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties van laboratoriumformaat tot industrieel formaat.