Ultrasone lysis van biotechnologische cellen in de industriële productie

Biotechnologisch gemanipuleerde bacteriesoorten zoals E. coli en genetisch gemodificeerde zoogdier- en plantenceltypes worden op grote schaal in de biotechnologie gebruikt om moleculen tot expressie te brengen. Om deze gesynthetiseerde biomoleculen vrij te maken, is een betrouwbare techniek voor celdisruptie vereist. Hoogwaardige ultrasoonbehandeling is een beproefde methode voor efficiënte en betrouwbare cellysis – gemakkelijk schaalbaar tot grote doorvoerhoeveelheden. Hielscher Ultrasonics biedt u hoogwaardige ultrasoonapparatuur voor een efficiënte cellysis om grote hoeveelheden hoogwaardige biomoleculen te produceren.

Extractie van moleculen uit celfabrieken

Voor de productie van een breed scala van biomoleculen kunnen diverse gemanipuleerde microben en plantencellen worden gebruikt als microbiële celfabriek, waaronder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana en algen, naast vele andere. Deze celfabrieken kunnen eiwitten, lipiden, biochemicaliën, polymeren, biobrandstoffen en oleochemicaliën produceren, die worden gebruikt als voedingsmiddel of als grondstof voor industriële toepassingen. Cellen die als celfabriek worden gebruikt, worden gekweekt in gesloten bioreactoren, waar zij een hoge efficiëntie, specificiteit en lage energiebehoefte kunnen bereiken.
Om de doelmoleculen uit de biotechnologische celculturen te isoleren, moeten de cellen worden ontregeld zodat het intracellulaire materiaal vrijkomt. Ultrasone celdisruptoren hebben zich bewezen als uiterst betrouwbare en efficiënte techniek voor celdisintegratie en het vrijkomen van verbindingen.

Microbiële celfabrieken zijn metabolisch gemanipuleerde cellen die worden gebruikt voor de synthese van diverse waardevolle verbindingen. Ultrasone celdisruptie is een efficiënte en betrouwbare methode om de waardevolle verbindingen uit het celinterieur vrij te maken.
studie en grafiek: ©Villaverde, 2010.

Voordelen van ultrasone cel onderbrekers

Als niet-thermische, milde en toch zeer efficiënte technologie worden ultrasone disruptoren in het laboratorium en de industrie gebruikt om cellen te lyseren en extracten van hoge kwaliteit te produceren, b.v. gebruikt voor de isolatie van moleculen uit celfabrieken.

Power-Ultrasound voor efficiënte ontwrichting van microbiële celfabrieken

Mechanisme en effecten van ultrasone cel onderbrekers:
Bij ultrasone celdisruptie wordt gebruik gemaakt van de kracht van ultrasone geluidsgolven. De ultrasone homogenisator / celdisruptor is uitgerust met een sonde (ook sonotrode genoemd) van een titaniumlegering die trilt met een hoge frequentie van ongeveer 20 kHz. Dit betekent dat de ultrasone sonde 20.000 trillingen per seconde in de gesoniseerde vloeistof brengt. De in de vloeistof gekoppelde ultrasone golven worden gekenmerkt door afwisselend hoge-druk/lage-druk cycli. Tijdens een lagedrukcyclus zet de vloeistof uit en ontstaan minuscule vacuümbelletjes. Deze zeer kleine belletjes groeien gedurende een aantal wisselende drukcycli totdat zij geen energie meer kunnen opnemen. Op dat ogenblik imploderen de cavitatiebelletjes met geweld en creëren zij plaatselijk een buitengewoon energiedichte omgeving. Dit verschijnsel staat bekend als akoestische cavitatie en wordt gekenmerkt door plaatselijk zeer hoge temperaturen, zeer hoge drukken en afschuifkrachten. Deze afschuifspanningen breken efficiënt celwanden en verhogen de massaoverdracht tussen het celinterieur en het omringende oplosmiddel. Als zuiver mechanische techniek worden ultrasone afschuifkrachten op grote schaal gebruikt en zijn zij de aanbevolen procedure voor het ontleden van bacteriële cellen en het isoleren van eiwitten. Als eenvoudige en snelle methode voor celdisruptie is sonicatie ideaal voor de isolatie van kleine, middelgrote en grote volumes. Hielscher's digitale ultrasoonapparaten zijn uitgerust met een duidelijk menu van instellingen voor nauwkeurige sonicatiecontrole. Alle sonicatiegegevens worden automatisch opgeslagen op een ingebouwde SD-kaart en zijn eenvoudig toegankelijk. Geavanceerde opties voor warmteafvoer, zoals externe koeling, sonicatie in pulsmodus, enz. tijdens het ultrasone desintegratieproces zorgen voor het behoud van de ideale procestemperatuur en daarmee de intactheid van geëxtraheerde warmtegevoelige verbindingen.

Onderzoek onderstreept de sterke punten van ultrasone celdisruptie en extractie

Prof. Chemat et al. (2017) resumeren in hun studie dat "ultrageluid-geassisteerde extractie een groen en economisch haalbaar alternatief is voor conventionele technieken voor voedingsmiddelen en natuurlijke producten. De belangrijkste voordelen zijn afname van de extractie- en verwerkingstijd, de hoeveelheid gebruikte energie en oplosmiddelen, unit operations, en CO₂ uitstoot."
Gabig-Ciminska et al. (2014) gebruikten in hun studie een hoge druk homogenisator en een ultrasone cel dsintegrator voor de lysis van sporen om DNA vrij te maken. Het onderzoeksteam vergelijkt beide celdisruptiemethoden en concludeert dat met betrekking tot de cellysis voor sporen-DNA, "analyse is gedaan door cellysaten te gebruiken van de hogedrukhomogenisatie. Nadien realiseerden we ons dat ultrasone celdisruptie voor dit doel uitstekende voordelen biedt. Het is vrij snel en kan worden verwerkt voor kleine monstervolumes." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleculen uit celfabrieken voor de productie van levensmiddelen

Microbiële celfabrieken zijn een levensvatbare en efficiënte productiemethode waarbij microbiële organismen worden gebruikt om een hoge opbrengst aan inheemse en uitheemse metabolieten te produceren door metabole bio-engineering van microbiële micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels, enz. Bulkenzymen worden bijvoorbeeld geproduceerd met behulp van micro-organismen zoals Aspergillus oryzae, schimmels en bacteriën. Deze bulkenzymen worden gebruikt voor de productie van levensmiddelen en dranken, alsook in de landbouw, de bio-energiesector en de huishoudelijke verzorging.
Bepaalde bacteriën zoals Acetobacter xylinum en Gluconacetobacter xylinus produceren cellulose tijdens het fermentatieproces, waarbij nanovezels worden gesynthetiseerd in een bottom-up proces. Bacteriële cellulose (ook microbiële cellulose genoemd) is chemisch gelijkwaardig aan plantaardige cellulose, maar heeft een hoge kristalliniteitsgraad en een hoge zuiverheidsgraad (vrij van lignine, hemicellulose, pectine en andere biogene bestanddelen), alsmede een unieke structuur van cellulose-nanovezels geweven driedimensionaal (3D) gereticuleerd netwerk. (cf. Zhong, 2020) In vergelijking met plantaardige cellulose is bacteriële cellulose duurzamer en de geproduceerde cellulose is zuiver, zonder dat complexe zuiveringsstappen nodig zijn. Ultrasoonbehandeling en vloeistofextractie met NaOH of SDS (natriumdodecylsulfaat) zijn zeer doeltreffend voor het isoleren van bacteriële cellulose uit de bacteriële cellen.

Biomoleculen uit celfabrieken voor de productie van geneesmiddelen en vaccins

Een van de meest in het oog springende farmaceutische producten die uit celfabrieken worden verkregen is menselijke insuline. Voor de biotechnologische productie van insuline worden voornamelijk E. coli en Saccharomyces cerevisiae gebruikt. Aangezien biologisch gesynthetiseerde nano-moleculen een hoge biocompatibiliteit bieden, zijn biologische nanodeeltjes zoals ferritine voordelig voor talrijke biofabricagetoepassingen. Bovendien is de productie in metabolisch gemanipuleerde microben vaak aanzienlijk efficiënter wat de verkregen opbrengsten betreft. Zo is de productie van artemisinezuur, resveratrol en lycopeen vertienvoudigd tot meerdere honderdvoudigd, en is zij reeds op industriële schaal geproduceerd of in ontwikkeling. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Zo zijn op eiwitten gebaseerde biomoleculen ter grootte van nano's met zelfassemblerende eigenschappen, zoals ferritine en virusachtige deeltjes, bijzonder interessant voor de ontwikkeling van vaccins, omdat zij zowel de grootte als de structuur van ziekteverwekkers nabootsen en geschikt zijn voor oppervlakteconjugatie van antigenen om de interactie met immuuncellen te bevorderen. Dergelijke moleculen worden tot expressie gebracht in zogenaamde celfabrieken (b.v. gemanipuleerde E. coli-stammen), die een bepaald doelmolecuul produceren.

Protocol voor ultrasone lysis en van E. coli BL21 voor het vrijgeven van ferritine

Ferritine is een eiwit met als voornaamste functie de opslag van ijzer. Ferritine vertoont veelbelovende mogelijkheden als zelfassemblerende nanodeeltjes in vaccins, waar het wordt gebruikt als vehikel voor de toediening van vaccins (b.v. SARS-Cov-2 spike-eiwitten). Het wetenschappelijk onderzoek van Sun et. al. (2016) laat zien dat recombinant ferritine als oplosbare vorm uit Escherichia coli kan vrijkomen bij lage NaCl-concentraties (≤50 mmol/L). Om ferritine tot expressie te brengen in E. coli BL21 en het ferritine vrij te maken, werd het volgende protocol met succes toegepast. De recombinante pET-28a/ferritine plasmide werd getransformeerd in de E. coli BL21 (DE3) stam. De ferritine E coli BL21 (DE3) cellen werden gekweekt in LB-groeimedia met 0,5% kanamycine bij 37°C en geïnduceerd bij een OD600 van 0,6 met 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside gedurende 3 uur bij 37°C. De uiteindelijke cultuur werd vervolgens geoogst door centrifugatie bij 8000g gedurende 10 minuten bij 4°C, waarna de pellet werd verzameld. Vervolgens werd de pellet geresuspendeerd in LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% gistextract)/lysebuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) en verschillende concentraties NaCl-oplossing (0, 50, 100, 170, en 300 mmol/L), respectievelijk. Voor de lysis van bacteriële cellen werd sonicatie toegepast in pulsmode: bv. met behulp van de ultrasonicator UP400St bij 100% amplitude met een duty cycle van 5 seconden ON, 10 seconden OFF, gedurende 40 cycli) en vervolgens bij 10 000g gedurende 15 minuten bij 4°C gecentrifugeerd. Het supernatant en het neerslag werden geanalyseerd met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). Alle met natriumdodecylsulfaat gekleurde gels werden gescand met een hoge-resolutiescanner. Gel beelden werden geanalyseerd met Magic Chemi 1D software. Voor optimale helderheid werden eiwitbanden gedetecteerd door de parameters aan te passen. De gegevens voor de banden werden gegenereerd uit technische triplicaten. (cf. Sun et al., 2016)

Ultrasone celdisruptoren voor industriële lysis van celfabrieken

Ultrasone lysis en extractie is een betrouwbare en comfortabele methode om metabolieten uit celfabrieken vrij te maken en zo bij te dragen tot een efficiënte productie van doelmoleculen. Ultrasone celdisruptoren zijn beschikbaar van laboratorium- tot industriële grootte en de processen kunnen volledig lineair worden geschaald.
Hielscher Ultrasonics is uw competente partner voor hoogwaardige ultrasone disruptoren en heeft jarenlange ervaring op het gebied van het implanteren van ultrasone systemen in bench-top en industriële omgevingen.
Als het gaat om geavanceerde hardware en software, voldoen Hielscher ultrasoon celdisruptie systemen aan alle eisen voor optimale procesbeheersing, eenvoudige bediening en gebruiksvriendelijkheid. Klanten en gebruikers van Hielscher ultrasoonapparaten waarderen het voordeel dat Hielscher ultrasone celdisruptoren en extractoren het mogelijk maken het proces nauwkeurig te bewaken en te controleren – via digitaal touch-display en browser-afstandsbediening. Alle belangrijke sonicatiegegevens (bv. netto energie, totale energie, amplitude, duur, temperatuur, druk) worden automatisch opgeslagen als CSV-bestand op een geïntegreerde SD-kaart. Dit helpt bij het verkrijgen van reproduceerbare en herhaalbare resultaten en vergemakkelijkt de standaardisatie van het proces en de naleving van de Good Manufacturing Practices (cGMP).
Natuurlijk zijn de Hielscher ultrasoonprocessoren gebouwd voor 24/7-bedrijf onder volledige belasting en kunnen ze daarom betrouwbaar worden ingezet in industriële productieomgevingen. Dankzij de hoge robuustheid en het geringe onderhoud is de uitvaltijd van de ultrasoonapparatuur zeer laag. Dankzij de CIP- (clean-in-place) en SIP-functies (sterilize-in-place) is het reinigen tot een minimum beperkt, vooral omdat alle natte delen gladde metalen oppervlakken hebben (geen verborgen openingen of mondstukken).

Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators: