Ultrasone lysis van biotechnologisch aangepaste cellen in industriële productie

Biotechnologisch aangepaste bacteriesoorten zoals E. coli en genetisch gemodificeerde zoogdier- en plantenceltypen worden in de biotechnologie veelvuldig gebruikt om moleculen tot expressie te brengen. Om deze gesynthetiseerde biomoleculen vrij te maken, is een betrouwbare techniek voor celontsluiting vereist. Ultrasoonbehandeling met hoge prestaties is een beproefde methode voor efficiënte en betrouwbare cellysis – eenvoudig op te schalen naar grote verwerkingscapaciteiten. Hielscher Ultrasonics biedt u ultrasone apparatuur met hoge prestaties voor doeltreffende cellysis om grote hoeveelheden hoogwaardige biomoleculen te produceren.

Extractie van moleculen uit celfabrieken

Voor de productie van een breed scala aan biomoleculen kunnen diverse aangepaste microben en plantencellen worden gebruikt als microbiële celfabrieken, waaronder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteria, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana en algen, naast vele andere. Deze celfabrieken kunnen eiwitten, lipiden, biochemicaliën, polymeren, biobrandstoffen en oleochemicaliën produceren, die worden gebruikt als voedsel of als grondstof voor industriële toepassingen. Cellen die als celfabrieken worden gebruikt, worden gekweekt in gesloten bioreactoren, waar ze een hoge efficiëntie, hoge specificiteit en een lage energiebehoefte kunnen bereiken.
Om de doelmoleculen uit de biotechnologisch aangepaste celculturen te isoleren, moeten de cellen worden ontsloten zodat het intracellulaire materiaal vrijkomt. Ultrasone celontsluiters zijn een gevestigde, zeer betrouwbare en efficiënte techniek voor celdesintegratie en het vrijmaken van verbindingen.

Microbiële celfabrieken zijn metabool aangepaste cellen die worden gebruikt voor de synthese van diverse waardevolle verbindingen. Ultrasone celontsluiting is een efficiënte en betrouwbare methode om de waardevolle verbindingen uit het celinterieur vrij te maken.
onderzoek en afbeelding: ©Villaverde, 2010.

Voordelen van ultrasone celontsluiters

Als niet-thermische, milde en toch zeer efficiënte technologie worden ultrasone celontsluiters in laboratoria en de industrie gebruikt om cellen te lyseren en hoogwaardige extracten te produceren, die bijvoorbeeld worden gebruikt voor de isolatie van moleculen uit celfabrieken.

Krachtig ultrageluid voor efficiënte ontsluiting van microbiële celfabrieken

Werkingsmechanisme en effecten van ultrasone celontsluiters:
Ultrasone celontsluiting maakt gebruik van de kracht van ultrasone golven. De ultrasone homogenisator / celontsluiter is uitgerust met een sonde (ook wel sonotrode genoemd) van een titaniumlegering, die oscilleert met een hoge frequentie van ongeveer 20 kHz. Dit betekent dat de ultrasone sonde 20.000 trillingen per seconde in de aan sonicatie onderworpen vloeistof koppelt. De ultrasone golven die in de vloeistof worden gekoppeld, worden gekenmerkt door afwisselende hogedruk- en lagedrukcycli. Tijdens een lagedrukcyclus zet de vloeistof uit en ontstaan minuscule vacuümbellen. Deze zeer kleine bellen groeien gedurende meerdere afwisselende drukcycli totdat ze geen verdere energie meer kunnen opnemen. Op dat moment imploderen de cavitatiebellen met grote kracht en creëren ze plaatselijk een omgeving met een uitzonderlijk hoge energiedichtheid. Dit verschijnsel staat bekend als akoestische cavitatie en wordt gekenmerkt door plaatselijk zeer hoge temperaturen, zeer hoge drukken en afschuifkrachten. Deze afschuifspanningen breken celwanden efficiënt open en verhogen de massaoverdracht tussen het celinterieur en het omringende oplosmiddel. Als zuiver mechanische techniek worden ultrasoon opgewekte afschuifkrachten veelvuldig gebruikt en vormen ze de aanbevolen procedure voor bacteriële celontsluiting en voor eiwitisolatie. Als eenvoudige en snelle methode voor celontsluiting is sonicatie ideaal voor isolatie uit kleine, middelgrote en grote volumes. De digitale sonicatoren van Hielscher zijn uitgerust met een overzichtelijk instellingenmenu voor nauwkeurige regeling van de sonicatie. Alle sonicatiegegevens worden automatisch opgeslagen op een ingebouwde SD-kaart en zijn eenvoudig toegankelijk. Geavanceerde mogelijkheden voor warmteafvoer, zoals externe koeling, sonicatie in pulsmodus enz., zorgen tijdens het ultrasone desintegratieproces voor het behoud van de ideale procestemperatuur en daarmee voor de integriteit van de geëxtraheerde warmtegevoelige verbindingen.

Onderzoek onderstreept de sterke punten van ultrasone celontsluiting en extractie

Prof. Chemat et al. (2017) vatten in hun onderzoek samen dat “ultrasoon ondersteunde extractie een groen en economisch haalbaar alternatief is voor conventionele technieken voor voedingsmiddelen en natuurlijke producten. De belangrijkste voordelen zijn vermindering van de extractie- en verwerkingstijd, de hoeveelheid gebruikte energie en oplosmiddelen, het aantal eenheidsbewerkingen en de uitstoot van CO₂ .”
Gabig-Ciminska et al. (2014) gebruikten in hun onderzoek een hogedrukhomogenisator en een ultrasone celdesintegrator voor de lysis van sporen om DNA vrij te maken. Bij vergelijking van beide methoden voor celontsluiting concludeert het onderzoeksteam over de cellysis voor DNA uit sporen: “de analyse is uitgevoerd met cellysaten afkomstig van hogedrukhomogenisatie. Daarna realiseerden we ons dat ultrasone celontsluiting voor dit doel uitzonderlijke voordelen heeft. Ze is vrij snel en kan worden toegepast op kleine monstervolumes.” (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleculen uit celfabrieken voor voedselproductie

Microbiële celfabrieken vormen een haalbare en efficiënte productiemethode waarbij microbiële organismen worden gebruikt om hoge opbrengsten aan lichaamseigen en lichaamsvreemde metabolieten te produceren door metabole biotechnologische aanpassing van microbiële micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels enz. Bulkhoeveelheden enzymen worden bijvoorbeeld geproduceerd met micro-organismen zoals Aspergillus oryzae, schimmels en bacteriën. Deze in bulk geproduceerde enzymen worden gebruikt voor de productie van voedingsmiddelen en dranken, evenals in de landbouw, bio-energie en huishoudelijke verzorging.
Bepaalde bacteriën zoals Acetobacter xylinum en Gluconacetobacter xylinus produceren cellulose tijdens het fermentatieproces, waarbij nanovezels via een bottom-upproces worden gesynthetiseerd. Bacteriële cellulose (ook bekend als microbiële cellulose) is chemisch gelijkwaardig aan plantaardige cellulose, maar heeft een hoge kristalliniteit en hoge zuiverheid (vrij van lignine, hemicellulose, pectine en andere biogene componenten), evenals een unieke structuur van een driedimensionaal (3D) vernet netwerk dat is geweven uit cellulosenanovezels. (vgl. Zhong, 2020) In vergelijking met cellulose van plantaardige oorsprong is bacteriële cellulose duurzamer en is de geproduceerde cellulose zuiver, waardoor complexe zuiveringsstappen niet nodig zijn. Ultrasoonbehandeling en oplosmiddelextractie met NaOH of SDS (natriumdodecylsulfaat) zijn zeer effectief voor het isoleren van bacteriële cellulose uit de bacteriële cellen.

Biomoleculen uit celfabrieken voor de productie van geneesmiddelen en vaccins

Een van de meest prominente farmaceutische producten uit celfabrieken is humane insuline. Voor biotechnologische insulineproductie worden voornamelijk E. coli en Saccharomyces cerevisiae gebruikt. Omdat door biosynthese geproduceerde moleculen op nanoschaal een hoge biocompatibiliteit bieden, zijn biologische nanodeeltjes zoals ferritine voordelig voor talrijke toepassingen in biologische productie. Bovendien is de productie in metabool aangepaste microben vaak aanzienlijk doeltreffender wat betreft de verkregen opbrengsten. De productie van artemisininezuur, resveratrol en lycopeen is bijvoorbeeld vertienvoudigd tot enkele honderden malen verhoogd en wordt al op industriële schaal toegepast of is daarvoor in ontwikkeling. (vgl. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Zo zijn biomoleculen op nanoschaal op basis van eiwitten met zelfassemblerende eigenschappen, zoals ferritine en virusachtige deeltjes, bijzonder interessant voor vaccinontwikkeling, omdat ze zowel de grootte als de structuur van ziekteverwekkers nabootsen en geschikt zijn voor conjugatie van antigenen aan het oppervlak om de interactie met immuuncellen te bevorderen. Dergelijke moleculen worden tot expressie gebracht in zogenoemde celfabrieken (bijvoorbeeld aangepaste E. coli-stammen), die een bepaald doelmolecuul produceren.

Protocol voor ultrasone lysis van E. coli BL21 voor het vrijmaken van ferritine

Ferritine is een eiwit waarvan de primaire functie de opslag van ijzer is. Ferritine vertoont veelbelovende mogelijkheden als zelfassemblerende nanodeeltjes in vaccins, waarin het wordt gebruikt als drager voor de aflevering van vaccins (bijvoorbeeld SARS-Cov-2-spike-eiwitten). Het wetenschappelijke onderzoek van Sun et al. (2016) laat zien dat recombinant ferritine in oplosbare vorm kan worden vrijgemaakt uit Escherichia coli bij lage NaCl-concentraties (≤50 mmol/L). Om ferritine in E. coli BL21 tot expressie te brengen en het ferritine vrij te maken, werd het volgende protocol met succes toegepast. Het recombinante pET-28a/ferritin-plasmide werd via transformatie ingebracht in de E coli BL21 (DE3)-stam. De ferritineproducerende E coli BL21 (DE3)-cellen werden gekweekt in LB-groeimedia met 0,5% kanamycine bij 37°C en bij een OD600 van 0,6 gedurende 3 uur bij 37°C geïnduceerd met 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside. De uiteindelijke cultuur werd vervolgens geoogst door centrifugatie bij 8000g gedurende 10 minuten bij 4°C, en de pellet werd verzameld. Daarna werd de pellet opnieuw gesuspendeerd in respectievelijk LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% gistextract)/lysisbuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) en NaCl-oplossing met verschillende concentraties (0, 50, 100, 170 en 300 mmol/L). Voor bacteriële cellysis werd sonicatie in pulsmodus toegepast: bijvoorbeeld met de sonicator UP400St bij 100% amplitude met een bedrijfscyclus van 5 seconden AAN, 10 seconden UIT, gedurende 40 cycli), waarna gedurende 15 minuten bij 10 000g en 4°C werd gecentrifugeerd. Het supernatant en het precipitaat werden geanalyseerd met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE). Alle met natriumdodecylsulfaat gekleurde gels werden gescand met een scanner met hoge resolutie. Gelbeelden werden geanalyseerd met Magic Chemi 1D-software. Voor optimale duidelijkheid werden eiwitbanden gedetecteerd door parameters aan te passen. De gegevens voor de banden werden gegenereerd uit technische triplicaten. (vgl. Sun et al., 2016)

Ultrasone celontsluiters voor industriële lysis van celfabrieken

Ultrasone lysis en extractie vormen een betrouwbare en gemakkelijk toepasbare methode om metabolieten uit celfabrieken vrij te maken en zo een doeltreffende productie van doelmoleculen te ondersteunen. Ultrasone celontsluiters zijn verkrijgbaar van laboratoriumformaat tot industrieel formaat en processen kunnen volledig lineair worden opgeschaald.
Hielscher Ultrasonics is uw deskundige partner voor ultrasone celontsluiters met hoge prestaties en heeft jarenlange ervaring met het installeren van ultrasone systemen in tafelopstellingen en industriële omgevingen.
Met geavanceerde hardware en software voldoen de systemen voor celontsluiting van Hielscher Ultrasonics aan alle eisen voor optimale procesregeling, eenvoudige bediening en gebruiksvriendelijkheid. Klanten en gebruikers van sonicatoren van Hielscher waarderen het voordeel dat de ultrasone celontsluiters en extractoren van Hielscher nauwkeurige procesbewaking en procesregeling mogelijk maken – via een digitaal aanraakscherm en afstandsbediening via een browser. Alle belangrijke sonicatiegegevens (bijvoorbeeld netto-energie, totale energie, amplitude, duur, temperatuur en druk) worden automatisch als CSV-bestand opgeslagen op een geïntegreerde SD-kaart. Dit helpt om reproduceerbare en herhaalbare resultaten te verkrijgen en vergemakkelijkt processtandaardisatie en de naleving van goede productiepraktijken (cGMP).
Uiteraard zijn de ultrasone processoren van Hielscher gebouwd voor 24/7-bedrijf onder volledige belasting en kunnen ze daarom betrouwbaar worden gebruikt in industriële productieomgevingen. Dankzij de hoge robuustheid en geringe onderhoudsbehoefte is de stilstandtijd van de ultrasone apparatuur zeer laag. CIP-functies (reinigen ter plaatse) en SIP-functies (steriliseren ter plaatse) beperken arbeidsintensieve reiniging tot een minimum, vooral omdat alle onderdelen die met vloeistof in contact komen gladde metalen oppervlakken hebben (geen verborgen openingen of spuitmonden).

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze sonicatoren: