Ultrasone lysis van bio-engineered cellen in industriële productie

Biotechnologische bacteriesoorten zoals E. coli en genetisch gemodificeerde zoogdier- en plantenceltypes worden veel gebruikt in de biotech om moleculen tot expressie te brengen. Om deze gesynthetiseerde biomoleculen vrij te maken, is een betrouwbare celdisruptietechniek nodig. Ultrasoon ultrasoon is een beproefde methode voor efficiënte en betrouwbare cellyse. – eenvoudig schaalbaar tot grote verwerkingscapaciteiten. Hielscher Ultrasonics biedt u hoogwaardige ultrasone apparatuur voor efficiënte cellyse om grote volumes biomoleculen van hoge kwaliteit te produceren.

Extractie van moleculen uit celfabrieken

Voor de productie van een breed scala aan biomoleculen kunnen verschillende gemanipuleerde microben en plantencellen worden gebruikt als microbiële celfabrieken, waaronder Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Streptomyces, Corynebacterium glutamicum, Lactococcus lacti, Cyanobacteriën, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Nicotiana benthamiana en algen, naast vele andere. Deze celfabrieken kunnen eiwitten, lipiden, biochemicaliën, polymeren, biobrandstoffen en oleochemicaliën produceren, die worden gebruikt als voedsel of als grondstof voor industriële toepassingen. Cellen die gebruikt worden als celfabrieken worden gekweekt in gesloten bioreactoren, waar ze een hoge efficiëntie, specificiteit en lage energiebehoefte kunnen bereiken.
Om de doelmoleculen uit de bio-engineered celculturen te isoleren, moeten de cellen worden verstoord zodat het intracellulaire materiaal vrijkomt. Ultrasone celdisruptors hebben zich bewezen als zeer betrouwbare en efficiënte technieken voor celdesintegratie en het vrijkomen van verbindingen.

Microbiële celfabrieken zijn metabolisch gemanipuleerde cellen die gebruikt worden voor de synthese van verschillende waardevolle verbindingen. Ultrasone celdisruptie is een efficiënte en betrouwbare methode om de waardevolle verbindingen uit het inwendige van de cel vrij te maken.
studie en grafiek: ©Villaverde, 2010.

Voordelen van ultrasone celverstoorders

Als niet-thermische, milde maar zeer efficiënte technologie worden ultrasone disruptoren in laboratoria en de industrie gebruikt om cellen te lyseren en extracten van hoge kwaliteit te produceren, bijvoorbeeld voor de isolatie van moleculen uit celfabrieken.

Krachtig ultrageluid voor efficiënte onderbreking van microbiële celfabrieken

Mechanisme en effecten van ultrasone celverstoorders:
Ultrasone celdisruptie maakt gebruik van de kracht van ultrasone geluidsgolven. De ultrasone homogenisator/celverstoorder is uitgerust met een sonde (ook wel sonotrode genoemd) van een titaniumlegering die trilt met een hoge frequentie van ongeveer 20 kHz. Dit betekent dat de ultrasone sonde 20.000 trillingen per seconde in de gesoniseerde vloeistof koppelt. De ultrasone golven die in de vloeistof worden gekoppeld, worden gekenmerkt door afwisselend hoge druk / lage druk cycli. Tijdens een lagedrukcyclus zet de vloeistof uit en ontstaan minuscule vacuümbelletjes. Deze zeer kleine belletjes groeien gedurende verschillende afwisselende drukcycli totdat ze geen energie meer kunnen absorberen. Op dat moment imploderen de cavitatiebelletjes heftig en creëren plaatselijk een buitengewoon energiedicht milieu. Dit fenomeen staat bekend als akoestische cavitatie en wordt gekenmerkt door plaatselijk zeer hoge temperaturen, zeer hoge drukken en schuifkrachten. Deze schuifspanningen breken efficiënt celwanden en verhogen de massaoverdracht tussen de celinhoud en het omringende oplosmiddel. Als puur mechanische techniek worden ultrasoon gegenereerde schuifkrachten veel gebruikt en is dit de aanbevolen procedure voor bacteriële celdisruptie en voor eiwitisolatie. Als eenvoudige en snelle celdisruptiemethode is sonicatie ideaal voor de isolatie van kleine, middelgrote en grote volumes. Hielscher's digitale ultrasoonapparaten zijn uitgerust met een duidelijk menu met instellingen voor een nauwkeurige sonicatiecontrole. Alle sonicatiegegevens worden automatisch opgeslagen op een ingebouwde SD-kaart en zijn eenvoudig toegankelijk. Geavanceerde opties voor warmteafvoer zoals externe koeling, sonificatie in pulsmodus enz. tijdens het ultrasone desintegratieproces zorgen voor het behoud van de ideale procestemperatuur en daarmee voor de intactheid van geëxtraheerde warmtegevoelige verbindingen.

Onderzoek onderstreept de sterke punten van ultrasone celdisruptie en -extractie

Prof. Chemat et al. (2017) stellen in hun studie dat "extractie met behulp van ultrasone trillingen een groen en economisch haalbaar alternatief is voor conventionele technieken voor voedingsmiddelen en natuurlijke producten. De belangrijkste voordelen zijn de vermindering van de extractie- en verwerkingstijd, de hoeveelheid gebruikte energie en oplosmiddelen, de bewerkingen per eenheid en de CO₂ uitstoot."
Gabig-Ciminska et al. (2014) gebruikten in hun studie een hogedrukhomogenisator en een ultrasone celdesintegrator voor de lysis van sporen om DNA vrij te maken. Bij het vergelijken van beide celdisruptiemethoden concludeert het onderzoeksteam dat met betrekking tot de cellyse voor sporen-DNA, "analyse is gedaan door cellysaten van de hogedrukhomogenisatie te gebruiken. Daarna realiseerden we ons dat een ultrasone celdisruptie uitstekende voordelen heeft voor dit doel. Het is vrij snel en kan worden verwerkt voor kleine monstervolumes." (Gabig-Ciminska et al., 2014)

Biomoleculen uit celfabrieken voor voedselproductie

Microbiële celfabrieken zijn een levensvatbare en efficiënte productiemethode waarbij microbiële organismen worden gebruikt om hoge opbrengsten aan inheemse en niet-inheemse metabolieten te produceren door metabolische bio-engineering van microbiële micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels enz. Bulkenzymen worden bijvoorbeeld geproduceerd met behulp van micro-organismen zoals Aspergillus oryzae, schimmels en bacteriën. Deze bulkenzymen worden gebruikt voor de productie van voedsel en dranken, maar ook in de landbouw, bio-energie en huishoudelijke verzorging.
Bepaalde bacteriën zoals Acetobacter xylinum en Gluconacetobacter xylinus produceren cellulose tijdens fermentatieprocessen, waarbij nanovezels worden gesynthetiseerd in een bottom-up proces. Bacteriële cellulose (ook wel microbiële cellulose genoemd) is chemisch equivalent aan plantaardige cellulose, maar het heeft een hoge mate van kristalliniteit en hoge zuiverheid (vrij van lignine, hemicellulose, pectine en andere biogene componenten), evenals een unieke structuur van cellulose-nanovezel-geweven driedimensionaal (3D) gereticuleerd netwerk. (vgl. Zhong, 2020) In vergelijking met plantaardige cellulose is bacteriële cellulose duurzamer en de geproduceerde cellulose is zuiver en vereist geen complexe zuiveringsstappen. Ultrasoonbehandeling en oplosmiddelextractie met NaOH of SDS (natriumdodecylsulfaat) zijn zeer effectief voor het isoleren van bacteriële cellulose uit de bacteriecellen.

Biomoleculen uit celfabrieken voor de productie van geneesmiddelen en vaccins

Een van de meest prominente farmaceutische producten afkomstig van celfabrieken is menselijke insuline. Voor de biotechnologische productie van insuline worden voornamelijk E. coli en Saccharomyces cerevisiae gebruikt. Aangezien biogesynthetiseerde moleculen van nanogrootte een hoge biocompatibiliteit bieden, zijn biologische nanodeeltjes zoals ferritine voordelig voor talrijke toepassingen in de biofabricage. Bovendien is de productie in metabolisch gemanipuleerde microben vaak aanzienlijk efficiënter wat betreft de verkregen opbrengsten. De productie van artemisinezuur, resveratrol en lycopeen is bijvoorbeeld vertienvoudigd tot enkele honderden keren en is al gevestigd of in ontwikkeling tot productie op industriële schaal. (cf. Liu et al.; Microb. Cell Fact. 2017)
Op eiwit gebaseerde biomoleculen van nanogrootte met zelfassemblerende eigenschappen, zoals ferritine en virusachtige deeltjes, zijn bijvoorbeeld bijzonder interessant voor de ontwikkeling van vaccins, omdat ze zowel de grootte als de structuur van ziekteverwekkers nabootsen en geschikt zijn voor oppervlakteconjugering van antigenen om de interactie met immuuncellen te bevorderen. Dergelijke moleculen worden tot expressie gebracht in zogenaamde celfabrieken (bijvoorbeeld gemanipuleerde E. coli-stammen), die een bepaalde doelmolecule produceren.

Protocol voor ultrasone lysis en van E. coli BL21 voor ferritine-vrijgave

Ferritine is een eiwit met als primaire functie de opslag van ijzer. Ferritine laat veelbelovende mogelijkheden zien als zelfassemblerende nanodeeltjes in vaccins, waarbij het wordt gebruikt als transportmiddel voor vaccins (bijv. SARS-Cov-2 spike-eiwitten). Het wetenschappelijk onderzoek van Sun et. al. (2016) toont aan dat recombinant ferritine als oplosbare vorm kan vrijkomen uit Escherichia coli bij lage NaCl-concentraties (≤50 mmol/L). Om ferritine tot expressie te brengen in E. coli BL21 en de ferrtine vrij te geven, werd het volgende protocol met succes toegepast. Het recombinante pET-28a/ferritineplasmide werd getransformeerd in de E coli BL21 (DE3)-stam. De ferritine E coli BL21 (DE3) cellen werden gekweekt in LB groeimedia met 0,5% kanamycine bij 37°C en geïnduceerd bij een OD600 van 0,6 met 0,4% isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside gedurende 3 uur bij 37°C. De uiteindelijke cultuur werd vervolgens geoogst door te centrifugeren bij 8000g gedurende 10 minuten bij 4°C en de pellet werd verzameld. Vervolgens werd de pellet geresuspendeerd in LB-medium (1% NaCl, 1% Typone, 0,5% gistextract)/lysebuffer (20 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7,6) en verschillende concentraties NaCl-oplossing (respectievelijk 0, 50, 100, 170 en 300 mmol/L). Voor bacteriële cellyse werd sonicatie toegepast in pulsmodus: bv. met de Ultrasone UP400St bij 100% amplitude met een duty cycle van 5 seconden AAN, 10 seconden UIT, gedurende 40 cycli) en vervolgens gecentrifugeerd bij 10 000 g gedurende 15 minuten bij 4°C. Het supernatant en het neerslag werden geanalyseerd door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelectroforese (SDS-PAGE). Alle met natriumdodecylsulfaat gekleurde gels werden gescand met een hoge-resolutiescanner. De gelbeelden werden geanalyseerd met Magic Chemi 1D software. Voor optimale helderheid werden eiwitbanden gedetecteerd door de parameters aan te passen. De gegevens voor de banden werden gegenereerd uit technische triplo's. (vgl. Sun et al., 2016)

Ultrasone celverstoorders voor industriële lyse van celfabrieken

Ultrasone lysis en extractie is een betrouwbare en comfortabele methode om metabolieten uit celfabrieken vrij te maken en zo te helpen bij een efficiënte productie van doelmoleculen. Ultrasone celdisruptoren zijn verkrijgbaar van laboratorium- tot industrieel formaat en processen kunnen volledig lineair worden geschaald.
Hielscher Ultrasonics is uw competente partner voor hoogwaardige ultrasone disruptoren en heeft jarenlange ervaring op het gebied van implanteren van ultrasone systemen in bench-top en industriële omgevingen.
Als het gaat om geavanceerde hardware en software, voldoen de Hielscher ultrasoon celverstoringssystemen aan alle eisen voor optimale procesbesturing, eenvoudige bediening en gebruiksvriendelijkheid. Klanten en gebruikers van Hielscher ultrasoonapparatuur waarderen het voordeel dat Hielscher ultrasone celonderbrekers en -extractors een nauwkeurige procesbewaking en -regeling mogelijk maken. – via een digitaal touchdisplay en browserafstandsbediening. Alle belangrijke sonicatiegegevens (bijv. netto-energie, totale energie, amplitude, duur, temperatuur, druk) worden automatisch opgeslagen als CSV-bestand op een geïntegreerde SD-kaart. Dit helpt bij het verkrijgen van reproduceerbare en herhaalbare resultaten en vergemakkelijkt processtandaardisatie en het voldoen aan Good Manufacturing Practices (cGMP).
Uiteraard zijn Hielscher ultrasoonprocessoren gebouwd voor 24/7-bedrijf onder volledige belasting en kunnen ze daarom betrouwbaar worden gebruikt in industriële productieomgevingen. Dankzij de hoge robuustheid en het weinige onderhoud is de uitvaltijd van de ultrasoonapparatuur echt laag. CIP (clean-in-place) en SIP (sterilize-in-place) functies minimaliseren arbeidsintensieve reiniging, vooral omdat alle natte onderdelen gladde metalen oppervlakken zijn (geen verborgen openingen of mondstukken).

De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone machines: