Biosynthetische productie van oligosachariden uit moedermelk

De biosynthese van oligosachariden uit moedermelk (HMO’s) via fermentatie of enzymatische reacties is een complex proces dat middelen vergt en vaak een lage opbrengst heeft. Ultrasone behandeling verhoogt de massaoverdracht tussen het substraat en de celfabrieken en stimuleert de celgroei en het metabolisme. Daardoor intensiveert sonicatie fermentatie en biochemische processen, wat leidt tot een versnelde en efficiëntere productie van HMO’s.

Oligosachariden uit moedermelk

Oligosachariden uit moedermelk (HMO’s), ook bekend als glycanen uit moedermelk, zijn suikermoleculen die tot de groep van oligosachariden behoren. Belangrijke voorbeelden van HMO’s zijn 2’-fucosyllactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3’-galactosyllactose (3′-GL) en difucosyllactose (DFL).
Hoewel menselijke moedermelk meer dan 150 verschillende HMO-structuren bevat, worden momenteel alleen 2′-fucosyllactose (2′-FL) en lacto-N-neotetraose (LNnT) op commerciële schaal geproduceerd en als voedingsadditieven in zuigelingenvoeding gebruikt.
Oligosachariden uit moedermelk (HMO’s) staan bekend om hun belang voor de voeding van baby’s. Oligosachariden uit moedermelk zijn een uniek type voedingsstoffen die in de darmen van de zuigeling als prebiotica, anti-adhesieve antimicrobiële stoffen en immunomodulatoren werken en aanzienlijk bijdragen aan de hersenontwikkeling. HMO’s komen uitsluitend voor in menselijke moedermelk; de melk van andere zoogdieren (bijv. koeien, geiten, schapen, kamelen enz.) bevat deze specifieke vormen van oligosachariden niet.
Oligosachariden uit moedermelk zijn de op twee na meest voorkomende vaste component in menselijke melk en kunnen in opgeloste, geëmulgeerde of gesuspendeerde vorm in water aanwezig zijn. Lactose en vetzuren zijn de meest voorkomende vaste stoffen in menselijke melk. HMO’s zijn aanwezig in een concentratie van 0,35–0,88 ounces (9,9–24,9 g)/ L. Er zijn ongeveer 200 structureel verschillende oligosachariden uit moedermelk bekend. Bij 80% van alle vrouwen is 2′-fucosyllactose de dominante oligosacharide; deze is in menselijke moedermelk aanwezig in een concentratie van ongeveer 2,5 g/ L.
Omdat HMO’s niet worden verteerd, leveren ze geen calorieën aan de voeding. Als onverteerbare koolhydraten functioneren ze als prebiotica en worden ze selectief gefermenteerd door de gewenste darmmicroflora, vooral bifidobacteriën.

Biosynthese van oligosachariden uit moedermelk

Celfabrieken en enzymatische / chemo-enzymatische systemen zijn huidige technologieën voor de synthese van HMO’s. Voor HMO-productie op industriële schaal zijn fermentatie met microbiële celfabrieken, biochemische synthese en verschillende enzymatische reacties haalbare manieren om HMO’s biologisch te produceren. Om economische redenen is biosynthese via microbiële celfabrieken momenteel de enige techniek die voor de productie van HMO’s op industriële schaal wordt gebruikt.

Fermentatie van HMO’s met microbiële celfabrieken

E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis zijn veelgebruikte celfabrieken voor de biologische productie van biologische moleculen zoals HMO’s. Fermentatie is een biochemisch proces waarbij micro-organismen een substraat omzetten in de beoogde biologische moleculen. Microbiële celfabrieken gebruiken eenvoudige suikers als substraat, die ze omzetten in HMO’s. Omdat eenvoudige suikers (bijv. lactose) een ruim beschikbaar, goedkoop substraat zijn, blijft het biosyntheseproces kostenefficiënt.
De groei- en bioconversiesnelheid worden voornamelijk beïnvloed door de massaoverdracht van voedingsstoffen (substraat) naar de micro-organismen. De snelheid van de massaoverdracht is een belangrijke factor die de productsynthese tijdens fermentatie beïnvloedt. Het is algemeen bekend dat ultrasone behandeling de massaoverdracht bevordert.
Tijdens de fermentatie moeten de omstandigheden in de bioreactor voortdurend worden bewaakt en geregeld, zodat de cellen zo snel mogelijk kunnen groeien om vervolgens de beoogde biomoleculen te produceren (bijv. oligosachariden zoals HMO’s; insuline; recombinante eiwitten). Theoretisch begint de productvorming zodra de celcultuur begint te groeien. Vooral bij genetisch gemodificeerde cellen, zoals gemodificeerde micro-organismen, wordt deze echter meestal pas later geïnduceerd door een chemische stof aan het substraat toe te voegen die de expressie van het beoogde biomolecuul verhoogt. Ultrasone bioreactoren (sono-bioreactoren) kunnen nauwkeurig worden geregeld en maken specifieke stimulatie van microben mogelijk. Dit resulteert in een versnelde biosynthese en hogere opbrengsten.
Ultrasone lysis en extractie: de fermentatie van complexe HMO’s kan worden beperkt door lage fermentatietiters en producten die intracellulair blijven. Ultrasone lysis en extractie worden gebruikt om intracellulair materiaal vrij te maken vóór zuivering en verdere verwerkingsprocessen.

Door ultrasoon geluid bevorderde fermentatie

De groeisnelheid van microben zoals Escherichia coli, gemodificeerde E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis kan worden verhoogd door met gecontroleerde laagfrequente ultrasone behandeling de snelheid van de massaoverdracht en de doorlaatbaarheid van de celwand te vergroten. Als milde, niet-thermische verwerkingstechniek oefent ultrasone behandeling uitsluitend mechanische krachten uit op de fermentatiebouillon.
Akoestische cavitatie: het werkingsprincipe van sonicatie is gebaseerd op akoestische cavitatie. De ultrasone sonde (sonotrode) koppelt laagfrequente ultrasone golven in het medium. De ultrasone golven bewegen door de vloeistof en creëren afwisselende cycli van hoge druk (compressie) / lage druk (verdunning). Door de vloeistof in afwisselende cycli samen te drukken en uit te rekken, ontstaan minuscule vacuümbelletjes. Deze kleine vacuümbelletjes groeien gedurende meerdere cycli totdat ze een grootte bereiken waarbij ze geen verdere energie kunnen opnemen. Op dit punt van maximale groei implodeert de vacuümbel heftig en ontstaan lokaal extreme omstandigheden, bekend als het verschijnsel cavitatie. In de cavitatie-“hotspot” kunnen hoge druk- en temperatuurverschillen en intense afschuifkrachten met vloeistofstralen van tot wel 280m/sec worden waargenomen. Door deze cavitatie-effecten worden grondige massaoverdracht en sonoporatie (de perforatie van celwanden en celmembranen) bereikt. De voedingsstoffen van het substraat worden naar en in de levende, intacte cellen gevoerd, zodat de celfabrieken optimaal worden gevoed en zowel de groei- als de omzettingssnelheid worden verhoogd. Ultrasone bioreactoren vormen een eenvoudige, maar zeer effectieve strategie om biomassa in een eenpotsbiosyntheseproces te verwerken.
Het is algemeen bekend dat nauwkeurig gecontroleerde, milde sonicatie fermentatieprocessen intensiveert.
Sonicatie verbetert “de productiviteit van veel bioprocessen met levende cellen door verbetering van de substraatopname, verhoogde productie of groei door vergroting van de celporositeit, en mogelijk verhoogde afgifte van celcomponenten.” (Naveena et al. 2015)
Lees meer over ultrasoon ondersteunde fermentatie!

Naveena et al. (2015) stelden vast dat ultrasone intensivering verschillende voordelen biedt bij bioverwerking, waaronder lage bedrijfskosten in vergelijking met andere behandelingsopties voor procesverbetering, eenvoudige bediening en een bescheiden vermogensbehoefte.

Ultrasone fermentatiereactoren met hoge prestaties

Bij fermentatieprocessen worden levende micro-organismen zoals bacteriën of gisten gebruikt die als celfabrieken functioneren. Wanneer sonicatie wordt toegepast om de massaoverdracht te bevorderen en de groei- en omzettingssnelheid van micro-organismen te verhogen, is het cruciaal om de ultrasone intensiteit nauwkeurig te regelen om vernietiging van de celfabrieken te voorkomen.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerpen, produceren en distribueren van sonicators met hoge prestaties die nauwkeurig kunnen worden geregeld en bewaakt om superieure fermentatieopbrengsten te garanderen.

Procesbeheersing is niet alleen essentieel voor hoge opbrengsten en superieure kwaliteit, maar maakt het ook mogelijk om resultaten te herhalen en te reproduceren. Vooral bij de stimulatie van celfabrieken is de celspecifieke aanpassing van de sonicatieparameters essentieel om hoge opbrengsten te bereiken en celafbraak te voorkomen. Daarom zijn alle digitale modellen van sonicators van Hielscher uitgerust met intelligente software waarmee u sonicatieparameters kunt aanpassen, bewaken en bijstellen. Ultrasone procesparameters zoals amplitude, temperatuur, druk, sonicatieduur, inschakelduur en energietoevoer zijn essentieel om de HMO-productie via fermentatie te bevorderen.
De slimme software van sonicators van Hielscher registreert automatisch alle belangrijke procesparameters op de geïntegreerde SD-kaart. De automatische gegevensregistratie van het sonicatieproces vormt de basis voor processtandaardisatie en reproduceerbaarheid / herhaalbaarheid, die vereist zijn voor goede productiepraktijken (GMP).

Ultrasone reactoren voor fermentatie

Hielscher biedt ultrasone sondes in verschillende afmetingen, lengtes en geometrieën, die zowel voor batchbehandelingen als voor behandelingen met continue doorstroming kunnen worden gebruikt. Ultrasone reactoren, ook bekend als sono-bioreactoren, zijn beschikbaar voor elk volume en bestrijken de ultrasone bioverwerking van kleine laboratoriummonsters tot pilotschaal en volledig commerciële productie.
Het is algemeen bekend dat de positie van de ultrasone sonotrode in het reactievat de verdeling van cavitatie en microstromingen in het medium beïnvloedt. De sonotrode en ultrasone reactor moeten worden gekozen op basis van het te verwerken volume van de celbouillon. Hoewel sonicatie zowel in batchmodus als in continue modus kan worden uitgevoerd, wordt voor hoge productievolumes het gebruik van een installatie met continue doorstroming aanbevolen. Bij het passeren van een ultrasone doorstroomcel wordt het volledige celmedium aan exact dezelfde sonicatie blootgesteld, wat de meest effectieve behandeling garandeert. Het brede assortiment ultrasone sondes en doorstroomcelreactoren van Hielscher Ultrasonics maakt het mogelijk om de ideale opstelling voor ultrasone bioverwerking samen te stellen.

Hielscher Ultrasonics – Van laboratorium via pilot naar productie

Hielscher Ultrasonics bestrijkt het volledige spectrum van ultrasone apparatuur, van compacte, in de hand te houden ultrasone homogenisatoren voor monstervoorbereiding tot tafelmodellen en pilotsystemen, evenals krachtige industriële ultrasone apparaten die moeiteloos vrachtwagenladingen per uur verwerken. Dankzij hun veelzijdige en flexibele installatie- en montagemogelijkheden kunnen sonicators van Hielscher eenvoudig worden geïntegreerd in allerlei batchreactoren, fed-batchsystemen of opstellingen met continue doorstroming.
Verschillende accessoires en op maat gemaakte onderdelen maken een ideale aanpassing van uw ultrasone opstelling aan uw procesvereisten mogelijk.
Hielscher ultrasone processors zijn gebouwd voor 24/7-bedrijf onder volledige belasting en intensief gebruik onder veeleisende omstandigheden, zijn betrouwbaar en vergen slechts weinig onderhoud.
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze sonicators: