Biosynthetische productie van menselijke melk Oligosacchariden
De biosynthese van menselijke melk-oligosacchariden (HMO's) via fermentatie of enzymatische reacties is een complex, consumerend en vaak laagproductief proces. Ultrasonicatie verhoogt de massatransfer tussen het substraat en de celfabrieken en stimuleert de celgroei en -stofwisseling. Hierdoor intensiveert sonicatie de fermentatie en de biochemische processen met als resultaat een versnelde en efficiëntere productie van HMO's.
Menselijke melk Oligosacchariden
Menselijke melkoligosacchariden (HMO's), ook wel menselijke melkglycanen genoemd, zijn suikermoleculen, die deel uitmaken van de groep van de oligosacchariden. Prominente voorbeelden van HMO's zijn 2'-fucosyllactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3'-galactosyllactose (3′-GL), en difucosyllactose (DFL).
Terwijl menselijke moedermelk is samengesteld uit meer dan verschillende 150 HMO-structuren, worden momenteel slechts 2′-fucosyllactose (2′-FL) en lacto-N-neotetraose (LNnT) op commercieel niveau geproduceerd en gebruikt als voedingsadditieven in zuigelingenvoeding.
Menselijke melk-oligosachariden (HMO's) staan bekend om hun betekenis in de babyvoeding. Menselijke melkoligosacchariden zijn een uniek type voedingsstoffen, die fungeren als prebiotica, anti-kleefstoffen en immunomodulatoren in de darm van het kind en die substantieel bijdragen aan de ontwikkeling van de hersenen. HMO's komen uitsluitend voor in moedermelk; andere zoogdierenmelk (bv. koe, geit, schaap, kameel enz.) heeft deze specifieke vorm van oligosacchariden niet.
Menselijke melk-oligosachariden zijn de derde meest voorkomende vaste stof in menselijke melk, die zowel in opgeloste als in geëmulgeerde of gesuspendeerde vorm in water aanwezig kan zijn. Lactose en vetzuren zijn de meest voorkomende vaste stoffen in menselijke melk. HMO's zijn aanwezig in een concentratie van 0,35-0,88 ounces (9,9-24,9 g)/L. Er zijn ongeveer 200 structureel verschillende oligosacchariden voor menselijke melk bekend. De dominante oligosaccharide in 80% van alle vrouwen is 2′-fucosyllactose, die in de moedermelk van de mens aanwezig is in een concentratie van ongeveer 2,5 g/l.
Omdat HMO's niet worden verteerd, dragen ze niet calorisch bij aan de voeding. Omdat ze onverteerbaar zijn, functioneren ze als prebiotica en worden ze selectief gefermenteerd door de gewenste darmflora, met name bifidobacteriën.
- de ontwikkeling van baby's te bevorderen
- zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen
- heeft anti-inflammatoire en
- anti-kleef-effecten in het maag-darmkanaal
- ondersteunt het immuunsysteem bij volwassenen
De Ultrasone Bewerker UIP2000hdT verhoogt de massatransfer en activeert de cellenfabrieken voor een hogere opbrengst van biosynthetiseerde biologische moleculen zoals HMO's
Biosynthese van menselijke melk Oligosacchariden
Celfabrieken en enzymatische / chemo-enzymatische systemen zijn de huidige technologieën die gebruikt worden voor de synthese van HMO's. Voor HMO-productie op industriële schaal zijn de fermentatie van microbiële celfabrieken, biochemische synthese en verschillende enzymatische reacties haalbare manieren van HMO-bio-productie. Om economische redenen is de bio-synthese via microbiële cel-fabrieken momenteel de enige techniek die wordt gebruikt op het niveau van de industriële productie van HMO.
Fermentatie van HMO's met behulp van Microbiële Cel Fabrieken
E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis zijn veelgebruikte celfabrieken die gebruikt worden voor de bioproductie van biologische moleculen zoals HMOs. Fermentatie is een biochemisch proces waarbij gebruik wordt gemaakt van micro-organismen om een substraat om te zetten in gerichte biologische moleculen. Microbiële celfabrieken gebruiken eenvoudige suikers als substraat, die ze omzetten in HMO's. Omdat eenvoudige suikers (bv. lactose) een overvloedig en goedkoop substraat zijn, houdt dit het bio-syntheseproces kostenefficiënt.
De groei en de bioconversiesnelheid worden vooral beïnvloed door de massatransfer van voedingsstoffen (substraat) naar de micro-organismen. De massatransfersnelheid is een belangrijke factor die de productsynthese tijdens de fermentatie beïnvloedt. Het is bekend dat ultrasoonbehandeling de massatransfer bevordert.
Tijdens de fermentatie moeten de omstandigheden in de bioreactor voortdurend worden gecontroleerd en gereguleerd, zodat de cellen zo snel mogelijk kunnen groeien om vervolgens de beoogde biomoleculen te produceren (bijv. oligosacchariden zoals HMO's; insuline; recombinante eiwitten). Theoretisch begint de productvorming zodra de celcultuur begint te groeien. Maar vooral in genetisch gemodificeerde cellen zoals gemanipuleerde micro-organismen wordt het meestal later geïnduceerd door het toevoegen van een chemische stof aan het substraat, die de expressie van het doelbiomolecuul regelt. Ultrasone bioreactoren (sono-bioreactor) kunnen nauwkeurig worden gecontroleerd en zorgen voor de specifieke stimulatie van microben. Dit resulteert in een versnelde biosynthese en hogere opbrengsten.
Ultrasone lyse en extractie: Fermentatie van complexe HMO's kan worden beperkt door lage fermentatietiters en producten die intracellulair blijven. Ultrasone lyse en extractie wordt gebruikt om intracellulair materiaal vrij te geven voor de zuivering en de downstream processen.
Ultrasonisch gepromoot Fermentatie
De groeisnelheid van microben zoals Escherichia coli, gemanipuleerde E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis kan worden versneld door de massatransfersnelheid en de doorlaatbaarheid van de celwand te verhogen door het toepassen van gecontroleerde laagfrequente ultrasoon ultrasoon. Als een milde, niet-thermische verwerkingstechniek, past ultrasonicatie zuiver mechanische krachten toe in de fermentatiebouillon.
Akoestische cavitatie: Het werkingsprincipe van sonicatie is gebaseerd op akoestische cavitatie. De ultrasone sonde (sonotrode) brengt ultrasone golven met lage frequentie in het medium. De ultrasone golven reizen door de vloeistof en creëren afwisselend hoge druk (compressie) / lage druk (rarefactie) cycli. Door de vloeistof in afwisselende cycli samen te persen en uit te rekken, ontstaan minuscule vacuümbelletjes. Deze kleine vacuümbelletjes groeien gedurende verscheidene cycli tot zij een grootte bereiken waarbij zij geen energie meer kunnen opnemen. Op dit punt van maximale groei implodeert de vacuümbel met geweld en genereert plaatselijk extreme omstandigheden, bekend als het fenomeen van cavitatie. In de cavitatie-"hot-spot" kunnen hoge druk- en temperatuurverschillen en intense afschuifkrachten met vloeistofstralen tot 280 m/sec worden waargenomen. Door deze cavitatie-effecten wordt een grondige massaoverdracht en sonoporatie (het perforeren van celwanden en celmembranen) bereikt. De voedingsstoffen van het substraat worden naar en in de levende volledige cellen gedreven, zodat de celfabrieken optimaal worden gevoed en zowel de groei als de omzettingssnelheid worden versneld. Ultrasone bioreactoren zijn een eenvoudige, maar zeer doeltreffende strategie om biomassa te verwerken in een eenpotig biosyntheseproces.
Een nauwkeurig gecontroleerde, milde sonicatie is bekend om de fermentatieprocessen te intensiveren.
Sonicatie verbetert "de productiviteit van veel bioprocessen waarbij levende cellen betrokken zijn via de verbetering van de substraatopname, de verbeterde productie of groei door de verhoging van de celporeusheid, en de mogelijk verbeterde afgifte van celbestanddelen". (Naveena et al. 2015)
Lees meer over ultrasonisch geassisteerde fermentatie!
- verhoogde opbrengst
- Versnelde vergisting
- Cellulaire stimulatie
- Verbeterde Substraatopname
- Verhoogde celporeusheid
- eenvoudig te bedienen
- veilig
- Eenvoudige Retro-Fitting
- lineaire opschaling
- Batch- of InIine-verwerking
- snelle RoI
Naveena et al. (2015) vonden dat ultrasone intensivering verschillende voordelen biedt tijdens de bioprocessing, waaronder lage operationele kosten in vergelijking met andere verbeterende behandelingsopties, eenvoud van bediening en bescheiden vermogensbehoefte.
De MultiSonoReactor MSR-4 is een industriële inline-homogenisator die geschikt is voor de verbeterde biosynthese van menselijke melkoligosachariden (HMO).
Hoogwaardige Ultrasone Gistingsreactoren
Bij fermentatieprocessen zijn levende micro-organismen betrokken, zoals bacteriën of gist, die als celfabrieken functioneren. Terwijl sonicatie wordt toegepast om de massatransfer te bevorderen en de groei en de conversiesnelheid van micro-organismen te verhogen, is het van cruciaal belang om de ultrasone intensiteit precies te controleren om de vernietiging van de celfabrieken te voorkomen.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerpen, produceren en distribueren van hoogwaardige ultrasoon generatoren, die nauwkeurig gecontroleerd en bewaakt kunnen worden om superieure fermentatieopbrengsten te garanderen.
Procesbeheersing is niet alleen essentieel voor een hoge opbrengst en superieure kwaliteit, maar maakt het ook mogelijk om resultaten te herhalen en te reproduceren. Vooral als het gaat om de stimulering van de celfabrieken is de celspecifieke aanpassing van de sonicatieparameters essentieel om een hoge opbrengst te bereiken en om celafbraak te voorkomen. Daarom zijn alle digitale modellen van Hielscher ultrasonicatoren uitgerust met intelligente software, waarmee u de geluidsparameters kunt aanpassen, controleren en herzien. Ultrasone procesparameters zoals amplitude, temperatuur, druk, sonische duur, bedrijfscycli en energie-input zijn essentieel om de HMO-productie via fermentatie te bevorderen.
De slimme software van Hielscher ultrasonicators legt automatisch alle belangrijke procesparameters vast op de geïntegreerde SD-kaart. De automatische gegevensregistratie van het sonicatieproces vormt de basis voor de processtandaardisatie en reproduceerbaarheid / herhaalbaarheid, die nodig zijn voor Good Manufacturing Practices (GMP).
Ultrasone Rectoren voor Fermentatie
Hielscher biedt ultrasone sondes van verschillende grootte, lengte en geometrieën, die zowel voor batch- als continu doorstroombehandelingen kunnen worden gebruikt. Ultrasone reactoren, ook wel sonobioreactoren genoemd, zijn beschikbaar voor elk volume dat de ultrasone bioprocessing omvat, van kleine laboratoriummonsters tot piloot- en volledig commercieel productieniveau.
Het is bekend dat de locatie van de ultrasone sonotrode in het reactievat van invloed is op de verdeling van cavitatie en microstroming binnen het medium. Sonotrode en ultrasone reactor moeten worden gekozen in overeenstemming met het verwerkingsvolume van de celbouillon. Terwijl de sonotrode zowel in batch als in continue modus kan worden uitgevoerd, wordt voor hoge productievolumes het gebruik van een continustroominstallatie aanbevolen. Door een ultrasone flowcel te passeren, krijgt alle celmedia exact dezelfde blootstelling aan sonicatie, waardoor de meest effectieve behandeling wordt gegarandeerd. Hielscher Ultrasonics breed scala aan ultrasone sondes en flowcel reactoren maakt het mogelijk om de ideale ultrasone bioprocessing setup te monteren.
Hielscher Ultrasonics – Van Lab tot Piloot tot Productie
Hielscher Ultrasonics bestrijkt het volledige spectrum van ultrasone apparatuur en biedt compacte ultrasone ultrasone homogenisatoren voor monstervoorbereiding tot bench-top- en pilotsystemen en krachtige industriële ultrasone eenheden die gemakkelijk vrachtwagenladingen per uur kunnen verwerken. Door de veelzijdige en flexibele installatie- en montagemogelijkheden kunnen Hielscher ultrasoonapparaten eenvoudig worden geïntegreerd in alle soorten batchreactoren, feed-batches of doorstroomopstellingen.
Verschillende accessoires en aangepaste onderdelen zorgen voor de ideale aanpassing van uw ultrasone opstelling aan uw procesvereisten.
De ultrasone processoren van Hielscher zijn gebouwd voor 24 uur per dag, 7 dagen per week, onder volledige belasting en zware omstandigheden. Ze zijn betrouwbaar en vereisen slechts weinig onderhoud.
Onderstaande tabel geeft een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasonicators:
| batch Volume | Stroomsnelheid | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml / min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml / min | Uf200 ः t, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L / min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100L | 2 tot 10 l / min | UIP4000hdT |
| na | 10 tot 100 l / min | UIP16000 |
| na | grotere | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op! / Vraag ons!
Krachtige ultrasone homogenisatoren van Laboratorium naar piloot en industrieel schaal.
Literatuur / Referenties
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Feiten die de moeite waard zijn om te weten
Biosynthese met behulp van Cel Fabrieken
Een microbiële cellenfabriek is een methode van bio-engineering, die gebruik maakt van microbiële cellen als productiefaciliteit. Door de genetische manipulatie van microben wordt het DNA van micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels, zoogdiercellen of algen gemodificeerd en worden de microben omgezet in celfabrieken. Celfabrieken worden gebruikt om substraten om te zetten in waardevolle biologische moleculen, die bijvoorbeeld worden gebruikt in de voedsel-, farma-, chemie- en brandstofproductie. Verschillende strategieën van de biosynthese in de cellenfabriek zijn gericht op de productie van inheemse metabolieten, expressie van heterologe biosynthetische paden, of eiwitexpressie.
Celfabrieken kunnen worden gebruikt om ofwel inheemse metabolieten te synthetiseren, om heterologe biosynthetische paden uit te drukken, of om proteïnen tot expressie te brengen.
Biosynthese van inheemse metabolieten
Inheemse metabolieten worden gedefinieerd als biologische moleculen, die door de cellen die als celfabriek worden gebruikt, op natuurlijke wijze worden geproduceerd. Celfabrieken produceren deze biologische moleculen ofwel intracellulair ofwel een afgescheiden stof. Dit laatste heeft de voorkeur omdat het de afscheiding en zuivering van de beoogde verbindingen vergemakkelijkt. Voorbeelden van inheemse metabolieten zijn amino- en nucleïnezuren, antibiotica, vitaminen, enzymen, bioactieve verbindingen en eiwitten die geproduceerd worden via anabole routes van de cel.
Heterologus Biosynthetische paden
Wanneer men probeert een interessante verbinding te produceren, is een van de belangrijkste beslissingen de keuze van de productie in de inheemse gastheer, en het optimaliseren van deze gastheer, of het overbrengen van het pad naar een andere bekende gastheer. Als de oorspronkelijke gastheer kan worden aangepast aan een industrieel fermentatieproces en er daarbij geen gezondheidsrisico's zijn (bv. productie van toxische bijproducten), kan dit een voorkeurstrategie zijn (zoals bijvoorbeeld het geval was voor penicilline). In veel moderne gevallen weegt het potentieel van het gebruik van een industrieel geprefereerde celfabriek en gerelateerde platformprocessen echter zwaarder dan de moeilijkheid om het traject over te brengen.
Eiwituitdrukking
De expressie van eiwitten kan worden bereikt via homologe en heterologe manieren. Bij homologe expressie wordt een gen dat van nature in een organisme aanwezig is, overgedrukt. Door deze over-expressie kan een hogere opbrengst van een bepaalde biologische molecule worden geproduceerd. Bij heterologe expressie wordt een specifiek gen overgebracht naar een gastheercel omdat het gen van nature niet aanwezig is. Met behulp van celtechniek en recombinant-DNA-technologie wordt het gen in het DNA van de gastheer ingevoegd, zodat de gastheercel (grote) hoeveelheden van een eiwit produceert die hij niet van nature zou produceren. Eiwituitdrukking gebeurt in verschillende gastheren van bacteriën, bijvoorbeeld E. coli en Bacillis subtilis, gisten, bijvoorbeeld Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamenteuze schimmels, bijvoorbeeld als A. niger, en cellen afkomstig van multicellulaire organismen zoals zoogdieren en insecten. Innumereuze eiwitten zijn van groot commercieel belang, onder meer uit bulk-enzymen, complexe biofarmaceutica, diagnostische en onderzoeksreagentia. (zie A.M. Davy et al. 2017).