Biosynthetische productie van humane melkoligosachariden
De biosynthese van humane melkoligosachariden (HMO's) via fermentatie of enzymatische reacties is een complex, kostbaar en vaak laagproductief proces. Ultrasoon geluid verhoogt de massaoverdracht tussen substraat en celfabrieken en stimuleert celgroei en metabolisme. Hierdoor intensiveert ultrasone trillingen de fermentatie en biochemische processen, wat resulteert in een snellere en efficiëntere productie van HMO's.
oligosachariden van menselijke melk
Oligosacchariden in moedermelk (HMO's), ook wel moedermelkglycanen genoemd, zijn suikermoleculen die deel uitmaken van de oligosacharidengroep. Prominente voorbeelden van HMO's zijn onder meer: 2′-fucosyllactose (2′-FL), lacto-N-neotetraose (LNnT), 3′-galactosyllactose (3′-GL) en difucosyllactose (DFL).
Menselijke moedermelk bestaat uit meer dan 150 verschillende HMO-structuren, maar momenteel worden alleen 2′-fucosyllactose (2′-FL) en lacto-N-neotetraose (LNnT) op commercieel niveau geproduceerd en gebruikt als voedingsadditieven in zuigelingenvoeding.
Oligosacchariden in moedermelk (HMO's) staan bekend om hun betekenis in babyvoeding. Oligosacchariden in moedermelk zijn een uniek type voedingsstoffen, die fungeren als prebiotica, anti-adhesieve antimicrobiële middelen en immunomodulatoren in de darm van het kind en aanzienlijk bijdragen aan de ontwikkeling van de hersenen. HMO's worden uitsluitend aangetroffen in menselijke moedermelk; Andere melk van zoogdieren (bijv. koe, geit, schaap, kameel enz.) heeft deze specifieke vorm van oligosacchariden niet.
Oligosachariden in moedermelk zijn het op twee na meest voorkomende vaste bestanddeel in moedermelk, die zowel opgelost als geëmulgeerd of gesuspendeerd in water aanwezig kunnen zijn. Lactose en vetzuren zijn de meest voorkomende vaste stoffen in moedermelk. HMO's zijn aanwezig in een concentratie van 0,35-0,88 ounces (9,9-24,9 g)/L. Er zijn ongeveer 200 structureel verschillende humane melkoligosachariden bekend. De dominante oligosacharide in 80% van alle vrouwen is 2′-fucosyllactose, dat aanwezig is in moedermelk met een concentratie van ongeveer 2,5 g/l.
Aangezien HMO's niet verteerd worden, leveren ze geen calorische bijdrage aan de voeding. Omdat het onverteerbare koolhydraten zijn, fungeren ze als prebiotica en worden ze selectief gefermenteerd door de gewenste darmmicroflora, vooral bifidobacteriën.
- de ontwikkeling van baby's bevorderen
- zijn belangrijk voor de ontwikkeling van de hersenen
- heeft ontstekingsremmende en
- anti-adhesieve effecten in het maag-darmkanaal
- ondersteunt het immuunsysteem bij volwassenen
De ultrasone processor UIP2000hdT verhoogt de massaoverdracht en activeert celfabrieken voor een hogere opbrengst aan biosynthetische biologische moleculen zoals HMO's
Biosynthese van humane melkoligosachariden
Celfabrieken en enzymatische? chemo-enzymatische systemen zijn de huidige technologieën die gebruikt worden voor de synthese van HMO's. Voor HMO productie op industriële schaal zijn de fermentatie van microbiële celfabrieken, biochemische synthese en verschillende enzymatische reacties haalbare manieren van HMO bioproductie. Om economische redenen is de biosynthese via microbiële celfabrieken momenteel de enige techniek die gebruikt wordt voor de industriële productie van HMO's.
Fermentatie van HMO's met behulp van microbiële celfabrieken
E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis zijn veelgebruikte celfabrieken voor de bioproductie van biologische moleculen zoals HMO's. Fermentatie is een biochemisch proces waarbij micro-organismen een substraat omzetten in doelgerichte biologische moleculen. Microbiële celfabrieken gebruiken eenvoudige suikers als substraat, die ze omzetten in HMO's. Aangezien eenvoudige suikers (bijv. lactose) een overvloedig en goedkoop substraat zijn, houdt dit het biosyntheseproces kostenefficiënt.
Groei en bioconversiesnelheid worden voornamelijk beïnvloed door de massaoverdracht van voedingsstoffen (substraat) naar de micro-organismen. De massatransfersnelheid is een belangrijke factor die de productsynthese tijdens fermentatie beïnvloedt. Het is bekend dat ultrasoonbehandeling de massaoverdracht bevordert.
Tijdens de fermentatie moeten de omstandigheden in de bioreactor constant bewaakt en geregeld worden zodat de cellen zo snel mogelijk kunnen groeien om vervolgens de beoogde biomoleculen te produceren (bijv. oligosacchariden zoals HMO's; insuline; recombinante eiwitten). Theoretisch begint de productvorming zodra de celcultuur begint te groeien. Maar vooral bij genetisch gemodificeerde cellen zoals gemanipuleerde micro-organismen wordt de vorming meestal later geïnduceerd door een chemische stof aan het substraat toe te voegen die de expressie van de beoogde biomolecule verhoogt. Ultrasone bioreactoren (sono-bioreactor) kunnen nauwkeurig worden geregeld en maken de specifieke stimulatie van microben mogelijk. Dit resulteert in een versnelde biosynthese en hogere opbrengsten.
Ultrasone lysis en extractie: Fermentatie van complexe HMO's kan beperkt worden door lage fermentatietiters en producten die intracellulair blijven. Ultrasone lysis en extractie wordt gebruikt om intracellulair materiaal vrij te maken voor zuivering en downstream processen.
Ultrasoon gestimuleerde fermentatie
De groeisnelheid van microben zoals Escherichia coli, gemanipuleerde E.coli, Saccharomyces cerevisiae en Lactococcus lactis kan worden versneld door de massatransfersnelheid en de permeabiliteit van de celwand te verhogen door gecontroleerde ultrasone behandeling met lage frequentie. Ultrasoonbehandeling is een milde, niet-thermische verwerkingstechniek waarbij zuiver mechanische krachten worden toegepast op de fermentatiebouillon.
Akoestische cavitatie: Het werkingsprincipe van sonicatie is gebaseerd op akoestische cavitatie. De ultrasone sonde (sonotrode) koppelt laagfrequente ultrasone golven aan het medium. De ultrasone golven reizen door de vloeistof en creëren afwisselend hoge druk (compressie)? lagedruk (verdunning) cycli. Door de vloeistof in afwisselende cycli samen te drukken en uit te rekken, ontstaan minuscule vacuümbelletjes. Deze kleine vacuümbelletjes groeien over verschillende cycli totdat ze een grootte bereiken waarin ze geen energie meer kunnen absorberen. Op dit punt van maximale groei implodeert de vacuümbel gewelddadig en genereert lokaal extreme omstandigheden, bekend als het fenomeen van cavitatie. In de cavitationele “hotspot”, hoge druk- en temperatuurverschillen en intense afschuifkrachten met vloeistofstralen tot 280 m/sec kunnen worden waargenomen. Door deze cavitationele effecten wordt een grondige massaoverdracht en sonoporatie (het perforeren van celwanden en celmembranen) bereikt. De voedingsstoffen van het substraat worden naar en in de levende hele cellen gedreven, zodat de celfabrieken optimaal worden gevoed en de groei en omzettingssnelheden worden versneld. Ultrasone bioreactoren zijn een eenvoudige, maar zeer effectieve strategie om biomassa te verwerken in een eenpots biosyntheseproces.
Een nauwkeurig gecontroleerde, milde sonicatie staat bekend om de intensivering van fermentatieprocessen.
Sonificatie verbetert “de productiviteit van veel bioprocessen waarbij levende cellen betrokken zijn via de verbetering van de opname van substraat, verbeterde productie of groei door verhoging van de celporositeit en mogelijk verbeterde afgifte van celcomponenten.” (Naveena et al. 2015)
Lees meer over ultrasoon ondersteunde fermentatie!
- Verhoogde opbrengst
- Versnelde gisting
- Celspecifieke stimulatie
- Verbeterde substraatopname
- Verhoogde porositeit van de cel
- Eenvoudig te bedienen
- Veilig
- Eenvoudige installatie achteraf
- Lineaire schaalvergroting
- Batch- of InIine-verwerking
- Snelle ROI
Naveena et al. (2015) ontdekten dat ultrasone intensivering verschillende voordelen biedt tijdens bioprocessen, waaronder lage operationele kosten in vergelijking met andere versterkende behandelingsopties, eenvoud van bediening en bescheiden stroomvereisten.
De MultiSonoReactor MSR-4 is een industriële inline homogenisator die geschikt is voor de verbeterde biosynthese van humane melkoligosachariden (HMO).
Ultrasone fermentatiereactoren met hoge prestaties
Bij fermentatieprocessen zijn levende micro-organismen zoals bacteriën of gisten betrokken, die functioneren als celfabrieken. Hoewel sonicatie wordt toegepast om massaoverdracht te bevorderen en de groei en conversiesnelheid van micro-organismen te verhogen, is het van cruciaal belang om de ultrasone intensiteit nauwkeurig te regelen om de vernietiging van de celfabrieken te voorkomen.
Hielscher Ultrasonics is gespecialiseerd in het ontwerpen, produceren en distribueren van hoogwaardige ultrasone apparaten die nauwkeurig kunnen worden geregeld en bewaakt om superieure fermentatierendementen te garanderen.
Procesbesturing is niet alleen essentieel voor een hoge opbrengst en superieure kwaliteit, maar maakt het ook mogelijk om resultaten te herhalen en te reproduceren. Vooral als het gaat om het stimuleren van celfabrieken is de celspecifieke aanpassing van de sonicatieparameters essentieel om een hoge opbrengst te behalen en celdegradatie te voorkomen. Daarom zijn alle digitale modellen van Hielscher ultrasone machines uitgerust met intelligente software, waarmee de sonicatieparameters kunnen worden aangepast, bewaakt en herzien. Ultrasone procesparameters zoals amplitude, temperatuur, druk, sonicatieduur, bedrijfscycli en energie-input zijn essentieel om de HMO-productie via fermentatie te bevorderen.
De slimme software van Hielscher ultrasoonapparaten registreert automatisch alle belangrijke procesparameters op de geïntegreerde SD-kaart. De automatische gegevensregistratie van het sonicatieproces vormt de basis voor processtandaardisatie en reproduceerbaarheid/herhaalbaarheid, die vereist zijn voor Good Manufacturing Practices (GMP).
Ultrasone Rectoren voor Fermentatie
Hielscher biedt ultrasone sondes van verschillende grootte, lengte en geometrie, die zowel voor batch- als continue doorstroombehandelingen kunnen worden gebruikt. Ultrasone reactoren, ook bekend als sono-bioreactoren, zijn beschikbaar voor elk volume voor ultrasone bioprocessing, van kleine laboratoriummonsters tot pilot- en volledig commercieel productieniveau.
Het is bekend dat de locatie van de ultrasone sonotrode in het reactievat van invloed is op de verdeling van cavitatie en microstroming in het medium. De sonotrode en ultrasone reactor moeten worden gekozen in overeenstemming met het verwerkingsvolume van de celbouillon. Hoewel sonicatie zowel in batch als in continue modus kan worden uitgevoerd, wordt voor hoge productievolumes het gebruik van een continue flowinstallatie aanbevolen. Door een ultrasone flowcel te doorlopen, wordt al het celmedium in exact dezelfde mate blootgesteld aan sonicatie, waardoor de meest effectieve behandeling wordt gegarandeerd. Hielscher Ultrasonics heeft een breed assortiment aan ultrasone sondes en doorstroomcelreactoren waarmee de ideale ultrasone bioprocessingsinstallatie kan worden samengesteld.
Hielscher Ultrasonics – Van lab naar pilot naar productie
Hielscher Ultrasonics biedt het volledige spectrum aan ultrasone apparatuur, van compacte handbediende ultrasone homogenisatoren voor monstervoorbereiding tot laboratorium- en pilotsystemen en krachtige industriële ultrasone eenheden die met gemak vrachtwagenladingen per uur verwerken. Hielscher ultrasone apparaten zijn veelzijdig en flexibel in installatie- en montagemogelijkheden en kunnen eenvoudig worden geïntegreerd in allerlei soorten batchreactoren, fed-batches of continue doorstroomopstellingen.
Diverse accessoires en op maat gemaakte onderdelen zorgen voor de ideale aanpassing van uw ultrasone opstelling aan uw procesvereisten.
Hielscher ultrasone processors zijn gebouwd voor 24/7 werking onder volledige belasting en zware belasting in veeleisende omstandigheden, zijn betrouwbaar en vereisen slechts weinig onderhoud.
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone machines:
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
| 0.1 tot 20L | 0.2 tot 4L/min | UIP2000hdT |
| 10 tot 100 liter | 2 tot 10 l/min | UIP4000hdT |
| n.v.t. | 10 tot 100 l/min | UIP16000 |
| n.v.t. | groter | cluster van UIP16000 |
Neem contact met ons op!? Vraag het ons!
Krachtige ultrasone homogenisatoren van lab naar piloot en industrieel schaal.
Literatuur? Referenties
- Muschiol, Jan; Meyer, Anne S. (2019): A chemo-enzymatic approach for the synthesis of human milk oligosaccharide backbone structures. Zeitschrift für Naturforschung C, Volume 74: Issue 3-4, 2019. 85-89.
- Birgitte Zeuner, David Teze, Jan Muschiol, Anne S. Meyer (2019): Synthesis of Human Milk Oligosaccharides: Protein Engineering Strategies for Improved Enzymatic Transglycosylation. Molecules 24, 2019.
- Yun Hee Choi, Bum Seok Park, Joo‐Hyun Seo, Byung‐Gee Ki (2019): Biosynthesis of the human milk oligosaccharide 3‐fucosyllactose in metabolically engineered Escherichia coli via the salvage pathway through increasing GTP synthesis and β‐galactosidase modification. Biotechnology and Bioengineering Volume 116, Issue 12. December 2019.
- Balakrishnan Naveena, Patricia Armshaw, J. Tony Pembroke (2015): Ultrasonic intensification as a tool for enhanced microbial biofuel yields. Biotechnology of Biofuels 8:140, 2015.
- Shweta Pawar, Virendra K. Rathod (2020): Role of ultrasound in assisted fermentation technologies for process enhancements. Preparative Biochemistry & Biotechnology 50(6), 2020. 1-8.
Wetenswaardigheden
Biosynthese met behulp van celfabrieken
Een microbiële celfabriek is een methode van bio-engineering die microbiële cellen gebruikt als productiefaciliteit. Door microben genetisch te manipuleren, wordt het DNA van micro-organismen zoals bacteriën, gisten, schimmels, zoogdiercellen of algen gemodificeerd, waardoor microben celfabrieken worden. Celfabrieken worden gebruikt om substraten om te zetten in waardevolle biologische moleculen, die bijvoorbeeld worden gebruikt in de voedingsmiddelen-, farmaceutische, chemische en brandstofproductie. Verschillende strategieën voor biosynthese op basis van celfabrieken zijn gericht op de productie van inheemse metabolieten, expressie van heterologe biosynthetische routes of eiwitexpressie.
Celfabrieken kunnen worden gebruikt om eigen metabolieten te synthetiseren, om heterologe biosynthetische routes tot expressie te brengen of om eiwitten tot expressie te brengen.
Biosynthese van inheemse metabolieten
Inheemse metabolieten worden gedefinieerd als biologische moleculen die de cellen die als celfabriek worden gebruikt op natuurlijke wijze produceren. Celfabrieken produceren deze biologische moleculen intracellulair of als uitgescheiden stof. Dit laatste heeft de voorkeur omdat het de scheiding en zuivering van de doelverbindingen vergemakkelijkt. Voorbeelden van lichaamseigen metabolieten zijn aminozuren en nucleïnezuren, antibiotica, vitaminen, enzymen, bioactieve verbindingen en eiwitten die geproduceerd worden via de anabole routes van de cel.
Heterologus biosynthetische routes
Wanneer men een interessante verbinding wil produceren, is een van de belangrijkste beslissingen de keuze tussen productie in de oorspronkelijke gastheer en deze gastheer optimaliseren, of de pathway overbrengen naar een andere bekende gastheer. Als de oorspronkelijke gastheer kan worden aangepast aan een industrieel fermentatieproces en dit geen gezondheidsrisico's met zich meebrengt (bijv. de productie van giftige bijproducten), kan dit de voorkeursstrategie zijn (zoals bijvoorbeeld het geval was voor penicilline). In veel moderne gevallen weegt het potentieel van het gebruik van een industrieel geprefereerde celfabriek en gerelateerde platformprocessen echter zwaarder dan de moeilijkheid om de pathway over te dragen.
Eiwit expressie
De expressie van eiwitten kan worden bereikt via homologe en heterologe manieren. Bij homologe expressie wordt een gen dat van nature in een organisme aanwezig is, tot overexpressie gebracht. Door deze overexpressie kan een hogere opbrengst van een bepaald biologisch molecuul worden geproduceerd. Voor heterologe expressie wordt een specifiek gen overgebracht naar een gastheercel in die zin dat het gen niet van nature aanwezig is. Met behulp van celengineering en recombinant-DNA-technologie wordt het gen in het DNA van de gastheer ingebracht, zodat de gastheercel (grote) hoeveelheden van een eiwit produceert dat hij van nature niet zou produceren. Eiwitexpressie vindt plaats in verschillende gastheren van bacteriën, b.v. E. coli en Bacillis subtilis, gisten, b.v. Klyuveromyces lactis, Pichia pastoris, S. cerevisiae, filamenteuze schimmels, b.v. als A. niger, en cellen afkomstig van meercellige organismen zoals zoogdieren en insecten. Talloze eiwitten zijn van groot commercieel belang, onder meer uit bulkenzymen, complexe biofarmaceutica, diagnostiek en onderzoeksreagentia. (cf. A.M. Davy et al. 2017)