Peptidesynthese in vaste fase – Efficiënter dankzij ultrasone behandeling

Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) is de gebruikelijke methode voor peptidesynthese. Ultrasoon is een betrouwbaar hulpmiddel om vaste fase peptidensynthese te intensiveren, wat resulteert in een hogere opbrengst, verbeterde zuiverheid, geen racemisatie en een aanzienlijk versnelde reactiesnelheid. Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone oplossingen voor de synthese, splitsing en oplossing van peptiden.

Ultrasone peptide-synthese in vaste fase

Ultrasoontechniek wordt al op grote schaal toegepast als intensiveringsmethode in de organische synthese en staat bekend om zijn voordelen zoals drastisch kortere reactietijden, hogere opbrengsten, minder bijproducten, het initiëren van trajecten die niet op andere manieren kunnen worden bereikt en/of betere selectiviteit. Grote voordelen kunnen ook worden verkregen wanneer sonicatie wordt gekoppeld aan reacties voor de synthese van peptiden. Onderzoeksresultaten hebben aangetoond dat ultrasoon geassisteerde peptidesynthese een optimale opbrengst van peptiden met een hoge zuiverheid oplevert, zonder racemisatie binnen een korte reactietijd.

Vaste fase peptidesynthese verbeterd met ultrageluid

Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS) is een chemische reactie die de assemblage van een peptideketen mogelijk maakt door opeenvolgende reacties van aminozuurderivaten op een onoplosbare poreuze drager. De traditionele vaste-fase peptidesynthese is echter een relatief inefficiënt en langzaam proces. Daarom is ultrasone intensivering van peptidesynthese een zeer gewaardeerd hulpmiddel voor een efficiëntere en snellere synthese van peptiden.
Silva et al. (2021) hebben een vergelijking gemaakt tussen “klassiek” fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc)-peptidesynthese in vaste fase (SPPS) met behulp van ultrasone golven (US)-ondersteunde SPPS op basis van de bereiding van drie peptiden, namelijk het fibroblastgroeifactorreceptor 3 (FGFR3)-specifieke peptide Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) en de nieuwe peptiden Pep2 (RQMATADEA-NH2) en Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
De door de VS ondersteunde SPPS leidde tot een 14-voudige (Pep1) en 4-voudige verkorting van de tijd (Pep2) die nodig is voor de assemblage van het peptide, in vergelijking met de “klassiek” methode. Interessant genoeg leverde de ultrasone SPPS-methode Pep1 op met een hogere zuiverheid (82%) dan de “klassiek” SPPS (73%). De aanzienlijke tijdwinst in combinatie met de bereikte hoge zuiverheid van het ruwe peptide was voor het onderzoeksteam aanleiding om US-ondersteunde SPPS toe te passen op het grote peptide Pep3, dat een groot aantal hydrofobe aminozuren en homooligosequenties bevat. Opmerkelijk genoeg werd de synthese van dit 25-mer-peptide in minder dan 6 uur (347 min) voltooid met een matige zuiverheid (ca. 49%).

Snellere peptidensynthese via vaste fase peptidensynthese met ultrasone agitatie.
(Studie en analyse: Wołczański et al., 2019)

Merlino et al. (2019) hebben eveneens een uitgebreid onderzoek uitgevoerd naar de effecten van ultrasone trillingen op de Fmoc-gebaseerde vaste-fase-peptidesynthese, waardoor de synthese van verschillende biologisch actieve peptiden (tot 44-mer) mogelijk werd, met een opmerkelijke besparing op materiaal en reactietijd. Zij toonden aan dat ultrasone behandeling de belangrijkste nevenreacties niet versterkte en de synthese verbeterde van peptiden die voorzien zijn van “moeilijke sequenties”Hiermee wordt de ultrasonisch-gestimuleerde vaste fase peptidesynthese (US-SPPS) een van de huidige zeer efficiënte peptidesynthesestrategieën.

De beschikbaarheid van krachtige systemen voor de ultrasone (sonische) synthese van peptiden maakt aanzienlijk verbeterde synthesesnelheden en een toename van de zuiverheid van ruwe producten mogelijk. (cf. Wołczański et al., 2019)

Het onderzoek naar racemisatie. Vergelijking van significante 1H NMR spectra van modellen peptiden handmatig gesynthetiseerd met behulp van de klassieke aanpak bij kamertemperatuur vs ultrasone methode bij verhoogde temperatuur. Chemische verschuivingen van His en Cys α-protonen en methyleengroep van Acm (linker panelen), ɣ-methylprotonen van Val (rechter panelen) laten zien dat sonicatie bij 70°C geen racemisatie veroorzaakt.
(Studie en analyse: Wołczański et al., 2019)

Ultrasone splitsing van peptiden

Na vaste-fase peptidesynthese (SPPS) moeten de gesynthetiseerde peptiden worden losgemaakt van de polymere harsen. Deze stap wordt ook wel deprotectie genoemd. Als de gebruikelijke schudmethode en ultrasone methode voor het klieven van peptiden uit hars worden vergeleken, dan vereist de schudmethode ongeveer 1 uur, terwijl ultrasone klaring in 15 tot 20 minuten kan worden uitgevoerd. De ultrasone peptide splitsing kan worden toegepast op de splitsing van beschermde aminozuren en peptiden die via benzylic ester bindingen aan polystyreenharsen zijn gekoppeld.

Ultrasone splitsing van peptiden uit polystyreenhars geeft een hoge opbrengst aan peptiden in hoge zuiverheid, zonder racemisatie, binnen een snelle procedure.
(studie en grafiek: ©Anuradha en Ravindranath, 1995)

Ultrasone apparatuur met hoge prestaties voor synthese van peptiden

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasoonoplossingen voor directe en indirecte sonificatie. Krachtige en nauwkeurig regelbare ultrasoonprocessoren leveren precies de juiste hoeveelheid ultrasone energie aan het reactievat. Of u nu spuiten, buizen, multi-well platen of glazen reactoren gebruikt als synthesevat, Hielscher Ultrasonics biedt de meest geschikte ultrasoonprocessor voor uw peptidetoepassing.

Veel peptidesyntheses worden uitgevoerd in spuiten (bijv. reactoren met gekartelde spuiten). Hielscher's ultrasone spuitagitator soniseert de peptideoplossing door de ultrasone geluidsgolven door de wand van de spuit in de vloeistof te laten dringen. De ultrasone spuitroerder is een van de populairste ultrasone oplossingen voor de ultrasoon ondersteunde synthese van peptiden.
De ultrasone cuphorn is een geschikt instrument om maximaal 5 reactorvaten te sonificeren, terwijl de VialTweeter maximaal tien reageerbuizen kan bevatten plus nog eens vijf grotere vaten via clamp-on accessoire.
Voor andere reactortypen, zoals de Merrifield- of Kamysz-vaste-fase-reactor en andere vaten en reactoren van polypropyleen of borosilicaat, biedt Hielscher sonicatoren aan voor indirecte en directe ultrasone behandeling, met op maat gemaakte klembevestiging of flens.

Natuurlijk kunnen grotere glazen reactoren met roerwerk, bijvoorbeeld voor synthese in de oplossingsfase, eenvoudig worden uitgerust met ultrasone sondes (ook wel sonotroden of ultrasone hoorns genoemd) van elke gewenste grootte.

Voor peptide-synthese in vaste fase in multi-well-/microtiterplaten is de UIP400MTP het ideale apparaat. Ultrasone cavitatie wordt indirect en gelijkmatig in de talrijke monsterputjes gekoppeld, wat zorgt voor een superieure massaoverdracht en synthesereactie. Bekijk de onderstaande video om te zien hoe de De microplaat-sonicator UIP400MTP in actie!