Peptidesynthese op vaste fase – efficiënter met sonicatie
Peptidesynthese op vaste fase (SPPS) is de gebruikelijke methode voor peptidesynthese. Ultrasone behandeling is een betrouwbaar hulpmiddel om peptidesynthese op vaste fase te intensiveren, wat resulteert in hogere opbrengsten, verbeterde zuiverheid, geen racemisatie en een aanzienlijk hogere reactiesnelheid. Hielscher Ultrasonics biedt diverse ultrasone oplossingen voor peptidesynthese, afsplitsing en oplossen.
Ultrasone peptidesynthese op vaste fase
Ultrasone behandeling wordt al op grote schaal toegepast als intensiveringsmethode bij organische synthese en staat bekend om voordelen zoals drastisch verkorte reactietijden, hogere opbrengsten, minder bijproducten, het initiëren van reactieroutes die op andere manieren niet konden worden gerealiseerd, en/of een betere selectiviteit. Ook wanneer sonicatie wordt toegepast bij peptidesynthesereacties kunnen grote voordelen worden behaald. Onderzoeksresultaten hebben aangetoond dat ultrasoon ondersteunde peptidesynthese binnen een korte reactietijd een geoptimaliseerde opbrengst aan peptiden met hoge zuiverheid oplevert, zonder racemisatie.
- Hoge peptideopbrengsten
- Aanzienlijk snellere synthese
- Hogere peptidezuiverheid
- Geen racemisatie
- Parallelle synthese van verschillende peptiden
- Schaalbaar naar elk volume
Ultrasone cuphorn voor de gelijkmatige sonicatie van meerdere reactorvaten voor verbeterde peptidesynthese.
Afbeelding die de Merrifield-peptidesynthese op vaste fase weergeeft. Ultrasone behandeling wordt gebruikt om de synthesereactie te bevorderen en te versterken, en om de gesynthetiseerde peptiden van de hars af te splitsen.
Afbeelding: ©Conejos-Sanchez et al., 2014)
| Onderzoek | Onderzochte peptide(n) | Reactietijd (klassiek versus US-SPPS) | Zuiverheid van het ruwe product (klassiek versus US-SPPS) | Racemisatie en nevenreacties | Belangrijkste bevindingen |
|---|---|---|---|---|---|
| Wołczański et al. (2019) | Met-enkefaline, UB33-43-OCam, TAT48-60-NH2, B2m58-69-NH2, ACP65-74-NH2, β-endorfine | 600–1920 min → 48–284 min | 24,2–71,3% → 60,6–89,9% | Geen waargenomen voor Cys/His, zelfs niet bij 70°C | ~7–12x snellere synthese; grote verbeteringen in zuiverheid, vooral voor sequenties die gevoelig zijn voor aggregatie, zoals TAT. |
| Silva et al. (2021) | Pep1 (12-meer), Pep2 (9-meer), Pep3 (25-meer) | >3515/365 min → ~250/85 min (Pep1/Pep2); Pep3: 347 min (alleen US) | 73–84% → 72–82% (Pep1/Pep2) | Niet getest; lichte daling van de zuiverheid bij Pep2 opgemerkt | 14x kortere tijd voor Pep1; opbrengsten aan ruw product aanzienlijk verhoogd. |
| Merlino et al. (2019) | Modelpentapeptiden, peptiden tot 44-meren, “moeilijke sequenties” (Aβ 1-42, ACP 65-74) | 60 min → 30 min (model) | 84% → 93% (model); aanzienlijk hoger dan bij thermische verwarming (~45°C) | Geen significante toename voor Cys/His-enantiomeren | Zeer effectief voor moeilijke sequenties en sequenties die gevoelig zijn voor aggregatie; maakt een kleinere overmaat aan reagentia mogelijk met behoud van hoge zuiverheid. |
Peptidesynthese op vaste fase verbeterd met ultrageluid
Peptidesynthese op vaste fase (SPPS) is een chemische reactie waarmee een peptideketen kan worden opgebouwd door opeenvolgende reacties van aminozuurderivaten op een onoplosbare poreuze drager. De traditionele peptidesynthese op vaste fase is echter een relatief inefficiënt en langzaam proces. Daarom is ultrasone intensivering van peptidesynthese een hoog aangeschreven hulpmiddel voor een doeltreffendere en snellere synthese van peptiden.
Silva et al. (2021) vergeleken “klassieke” peptidesynthese op vaste fase (SPPS) met fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) met door ultrageluid (US) ondersteunde SPPS aan de hand van de bereiding van drie peptiden, namelijk het voor fibroblastgroeifactorreceptor 3(FGFR3) specifieke peptide Pep1 (VSPPLTLGQLLS-NH2) en de nieuwe peptiden Pep2 (RQMATADEA-NH2) en Pep3 (AAVALLPAVLLALLAPRQMATADEA-NH2).
Door US ondersteunde SPPS leidde tot een 14-voudige (Pep1) en 4-voudige tijdsverkorting (Pep2) bij de opbouw van peptiden ten opzichte van de “klassieke” methode. Interessant genoeg leverde door ultrageluid ondersteunde SPPS Pep1 met een hogere zuiverheid (82%) op dan de “klassieke” SPPS (73%). De aanzienlijke tijdsverkorting in combinatie met de bereikte hoge zuiverheid van het ruwe peptide bracht het onderzoeksteam ertoe om door US ondersteunde SPPS toe te passen op het grote peptide Pep3, dat een groot aantal hydrofobe aminozuren en homooligomere sequenties bevat. Opmerkelijk genoeg werd de synthese van dit peptide van 25 aminozuren binnen minder dan 6 uur (347 min) gerealiseerd met een matige zuiverheid (ongeveer 49%).
Snellere peptidesynthese via peptidesynthese op vaste fase met ultrasone agitatie.
(Onderzoek en analyse: Wołczański et al., 2019)
Merlino et al. (2019) voerden eveneens een uitgebreid onderzoek uit naar de effecten van ultrageluid op peptidesynthese op vaste fase op basis van Fmoc. Hiermee konden verschillende biologisch actieve peptiden (tot 44-meren) worden gesynthetiseerd, met een opmerkelijke besparing op materiaal en reactietijd. Ze toonden aan dat ultrasone behandeling de belangrijkste nevenreacties niet verergerde en de synthese van peptiden met “moeilijke sequenties” verbeterde, waardoor ultrasoon bevorderde peptidesynthese op vaste fase (US-SPPS) tot de huidige zeer efficiënte strategieën voor peptidesynthese behoort.
De beschikbaarheid van systemen met hoge prestaties voor de ultrasone (sonische) synthese van peptiden maakt aanzienlijk hogere synthesesnelheden en een hogere zuiverheid van ruwe producten mogelijk. (vgl. Wołczański et al., 2019)
Onderzoek naar racemisatie. Vergelijking van relevante 1H-NMR-spectra van modelpeptiden die handmatig zijn gesynthetiseerd met de klassieke aanpak bij kamertemperatuur versus de ultrasone methode bij verhoogde temperatuur. De chemische verschuivingen van de α-protonen van His en Cys en de methyleengroep van Acm (linkerpanelen), en van de ɣ-methylprotonen van Val (rechterpanelen) laten zien dat sonicatie bij 70°C geen racemisatie veroorzaakt.
(Onderzoek en analyse: Wołczański et al., 2019)
Ultrasone afsplitsing van peptiden
Na peptidesynthese op vaste fase (SPPS) moeten de gesynthetiseerde peptiden van de polymere harsen worden afgesplitst. Deze stap wordt ook deprotectie genoemd. Bij een vergelijking van gangbaar schudden en ultrasone behandeling voor het afsplitsen van peptiden van hars vergt de schudmethode ongeveer 1 uur, terwijl ultrasone afsplitsing in 15 tot 20 min kan worden uitgevoerd. Ultrasone peptideafsplitsing kan worden toegepast voor het afsplitsen van beschermde aminozuren en peptiden die via benzylesterbindingen aan polystyreenharsen zijn gebonden.
Ultrasone afsplitsing van peptiden van polystyreenhars levert via een snelle procedure hoge opbrengsten aan peptiden met hoge zuiverheid op, zonder racemisatie.
(onderzoek en afbeelding: ©Anuradha en Ravindranath, 1995)
Ultrasoon geagiteerde reactor voor verbeterde en versnelde peptidesynthese. De afbeelding toont de sonicator UP200St in een geroerde glazen reactor.
Sonicators met hoge prestaties voor peptidesynthese
Hielscher Ultrasonics biedt diverse ultrasone oplossingen voor directe en indirecte sonicatie. Krachtige en nauwkeurig regelbare ultrasone processoren leveren precies de juiste hoeveelheid ultrasone energie aan het reactievat. Of u nu spuiten, buizen, multiwellplaten of glazen reactoren als synthesevat gebruikt, Hielscher Ultrasonics biedt de meest geschikte sonicator voor uw peptidetoepassing.
- peptiden op maat
- grootschalige peptideproductie
- peptidebibliotheken
Veel peptidesyntheses worden uitgevoerd in spuiten (bijv. spuitreactoren met een frit). De ultrasone spuitagitator van Hielscher soniceert de peptideoplossing door de ultrasone golven via de spuitwand in de vloeistof te koppelen. De ultrasone spuitagitator is een van de populairste ultrasone oplossingen voor de ultrasoon ondersteunde synthese van peptiden.
De ultrasone cuphorn is een geschikt hulpmiddel om tot 5 reactorvaten te soniceren, terwijl de VialTweeter tot tien reactiebuizen kan bevatten plus vijf extra grotere vaten via een opklembaar accessoire.
Voor andere reactortypen, zoals de Merrifield- of Kamysz-reactor voor synthese op vaste fase en andere vaten en reactoren van polypropyleen of borosilicaat, biedt Hielscher sonicators voor indirecte en directe sonicatie met een op maat gemaakte klembevestiging of flens.
Grotere geroerde glazen reactoren, bijvoorbeeld voor synthese in de oplossingsfase, kunnen uiteraard eenvoudig worden uitgerust met ultrasone sondes (ook sonotroden of ultrasone hoorns genoemd) van elk formaat.
- verschillende typen sonicators
- directe en indirecte sonicatie
- nauwkeurige intensiteitsregeling
- nauwkeurige temperatuurregeling
- continu of gepulst ultrageluid
- slimme functies, programmeerbare apparaten
- beschikbaar voor elk volume
- lineaire schaalbaarheid
Voor peptidesynthese op vaste fase in multiwell-/microtiterplaten is de UIP400MTP het ideale apparaat. Ultrasone cavitatie wordt indirect en gelijkmatig in de talrijke monsterputjes gekoppeld voor superieure massaoverdracht en een superieure synthesereactie. Bekijk in de onderstaande video de microplaatsonicator UIP400MTP in actie!
Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!
Hielscher Ultrasonics produceert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties voor mengtoepassingen, dispersie, emulgering en extractie op laboratorium-, pilot- en industriële schaal.
Wetenswaardigheden over ultrasone peptidesynthese
Wat zijn peptiden?
Peptiden zijn verbindingen waarin meerdere aminozuren via amidebindingen, de zogenoemde peptidebindingen, met elkaar zijn verbonden. Wanneer ze in complexe structuren zijn gebonden – doorgaans bestaande uit 50 of meer aminozuren – worden deze grote peptidestructuren eiwitten genoemd. Peptiden zijn een essentiële bouwsteen van het leven en vervullen talrijke functies in het lichaam.
Hoe werkt peptidesynthese?
In de organische chemie, moleculaire biologie en levenswetenschappen is peptidesynthese het proces waarbij peptiden worden geproduceerd. Peptiden worden chemisch gesynthetiseerd via een condensatiereactie van de carboxylgroep van het ene aminozuur met de aminogroep van een ander aminozuur. Gewoonlijk worden strategieën met beschermgroepen gebruikt om ongewenste nevenreacties met de verschillende aminozuurzijketens te voorkomen.
Chemische (in-vitro) peptidesynthese begint meestal met het koppelen van de carboxylgroep van het inkomende aminozuur (C-terminus) aan de N-terminus van de groeiende peptideketen. In tegenstelling tot deze C-naar-N-synthese verloopt de natuurlijke biosynthese van eiwitten met lange peptideketens in levende organismen in de tegenovergestelde richting. Dit betekent dat bij biosynthese de N-terminus van het inkomende aminozuur aan de C-terminus van de eiwitketen wordt gekoppeld (N-naar-C).
De meeste onderzoeks- en ontwikkelingsprotocollen voor peptidesynthese zijn gebaseerd op methoden op vaste fase, terwijl synthesemethoden in de oplossingsfase worden gebruikt bij grootschalige industriële productie van peptiden.
Wat is de huidige stand van de techniek in peptidesynthese?
SUS-SPPS (duurzame, door ultrageluid ondersteunde SPPS) blijkt het proces terug te brengen tot slechts twee stappen per cyclus (gecombineerde koppeling/capping/deprotectie + één wasstap), waardoor het oplosmiddelverbruik en de benodigde tijd aanzienlijk afnemen. (vgl. Mottola et al., 2025)
Ultrasoon ondersteunde TAPS is een opkomende combinatie met aangetoond succes bij totaalsyntheses (bijv. lipobactin) en wordt door CDMO’s onderzocht voor de productie van API’s.
Ontdek de voordelen van ultrasoon ondersteunde peptidesynthese met TAGGING!
Continue verwerking wordt onderzocht als verdere verbetering – er zijn platforms beschreven voor continue eenpotsynthese met gesilyleerde tags.
Het vakgebied ontwikkelt zich richting de principes van groene chemie, waarbij zowel ultrageluid als TAPS bijdragen aan een lager oplosmiddelverbruik, een kleinere hoeveelheid reagentia en een verbeterde duurzaamheid.
Literatuur / Referenties
- Merlino, F., Tomassi, S., Yousif, A. M., Messere, A., Marinelli, L., Grieco, P., Novellino, E., Cosconati, S., Di Maro, S. (2019): Boosting Fmoc Solid-Phase Peptide Synthesis by Ultrasonication. Organic Letters, 21(16), 2019. 6378–6382.
- Andrew M. Bray; Liana M. Lagniton; Robert M. Valerio; N.Joe Maeji (1994): Sonication-assisted cleavage of hydrophobic peptides. Application in multipin peptide synthesis. Tetrahedron Letters 35(48), 1994. 9079–9082.
- Silva, R., Franco Machado, J., Gonçalves, K., Lucas, F. M., Batista, S., Melo, R., Morais, T. S., & Correia, J. (2021): Ultrasonication Improves Solid Phase Synthesis of Peptides Specific for Fibroblast Growth Factor Receptor and for the Protein-Protein Interface RANK-TRAF6. Molecules (Basel, Switzerland), 26(23), 7349.
- Conejos-Sanchez, Inmaculada; Duro Castaño, Aroa; Vicent, María (2014): Peptide-Based Polymer Therapeutics. Polymers. 6. 515-551.
- Raheem, Shvan J; Schmidt, Benjamin W; Solomon, Viswas Raja; Salih, Akam K; Price, Eric W (2020): Ultrasonic-Assisted Solid-Phase Peptide Synthesis of DOTA-TATE and DOTA-linker-TATE Derivatives as a Simple and Low-Cost Method for the Facile Synthesis of Chelator-Peptide Conjugates. ACS Bioconjugate Chemistry, 2020.
- Salvatore Mottola, Alessandra Del Bene, Vincenzo Mazzarella, Roberto Cutolo, Ida Boccino, Francesco Merlino, Sandro Cosconati, Salvatore Di Maro, Anna Messere (2015): Sustainable Ultrasound-Assisted Solid-Phase peptide synthesis (SUS-SPPS): Less Waste, more efficiency. Ultrasonics Sonochemistry, Volume 114, 2025.
- M.V. Anuradha, B. Ravindranath (1995): Ultrasound in peptide synthesis. 4: Rapid cleavage of polymer-bound protected peptides by alkali and alkanolamines. Tetrahedron Volume 51, Issue 19, 1995. 5675-5680.
- Wołczański, G., Płóciennik, H., Lisowski, M., Stefanowicz, P. (2019): The faster peptide synthesis on the solid phase using ultrasonic agitation. Tetrahedron Letters, 2019.
Hielscher Ultrasonics produceert ultrasone homogenisatoren met hoge prestaties van laboratoriumformaat tot industrieel formaat.