Ultrasone afschuiving van DNA

Bij afschuiving van DNA en RNA worden lange DNA-moleculen gefragmenteerd tot kleinere stukken, een cruciale stap in de voorbereiding van monsters voor de constructie van bibliotheken voor next-generation sequencing (NGS). Ultrasone afschuiving van DNA maakt gebruik van akoestische cavitatiekrachten om DNA of RNA op te breken in fragmenten van 100 bp tot 5 kb. Deze methode maakt nauwkeurige controle over de fragmentgrootte mogelijk, waardoor de gewenste DNA-lengte kan worden ingesteld voor optimale sequencingresultaten.

Afschuiving van DNA met ultrasone behandeling

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen op basis van ultrasoon geluid voor de afschuiving van DNA, RNA en chromatine. Kies een ultrasoonapparaat met sonde (bijv. UP100H) voor directe sonicatie met een microtip, of gebruik de VialTweeeter of de ultrasone cuphorn voor de gelijktijdige indirecte DNA-preparatie van verschillende monsters. Hielscher biedt het ideale apparaat voor uw behoeften: of u nu 1 monster of maximaal 10 monsters hebt, met volumes van microliters tot liters – de sonicatoren van Hielscher voldoen aan uw eisen voor het bereiden van DNA-, RNA- en chromatinefragmenten met de juiste lengte. Reproduceerbaarheid, eenvoudige bediening en nauwkeurige controle maken een betrouwbare bibliotheek voor next-generation sequencing mogelijk.
In tegenstelling tot enzymatische DNA-fragmentatie maakt ultrasone afschuiving gebruik van zuiver mechanische afschuifkrachten zonder toevoeging van chemicaliën. Door nauwkeurige instelling van de procesparameters levert ultrasone afschuiving DNA-fragmenten met een hoog molecuulgewicht op (plasmide-DNA en genomisch DNA).
Gezuiverde nucleïnezuren kunnen vóór of na een fragmentatiestap worden geamplificeerd.
Sonicatieparameters (vermogen, pulscyclus / pulsreeksen, tijd en temperatuur) kunnen veilig via software-instellingen worden geregeld.

Protocollen voor ultrasone afschuiving van DNA

Voor de chromatine-immunoprecipitatieassay

Kort samengevat werden cellen uitgeplaat in schalen met een diameter van 60mm (400.000 per schaal) en getransfecteerd met RhoA-siRNA (zoals beschreven); na 72 h werden ze gedurende 10 min bij 37°C geïncubeerd met formaldehyde (eindconcentratie, 1%) om eiwitten via crosslinks aan DNA te binden. De crosslinkreactie werd gestopt door toevoeging van een tiende volume 1,25 mol/L glycine, wat een eindconcentratie van 125 mmol/L opleverde. De cellen werden tweemaal gewassen met ijskoude PBS, geresuspendeerd in buffer voor de radio-immunoprecipitatieassay [150 mmol/L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholaat, 0,1% SDS, 5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8,0)] met 1 mmol/L fenylmethylsulfonylfluoride, 1 Ag/mL aprotinine en 1 Ag/mL pepstatine A, en gedurende 30 min op ijs gehouden. Vervolgens werden de cellysaten op ijs gesoniceerd met een Hielscher UP200S ultrasone sonicator (3 x 40 s, amplitude 40%, cyclus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) totdat het gecrosslinkte chromatine door afschuiving DNA-fragmenten van 200 tot 1.000 bp opleverde. Een tiende van het volledige lysaat werd gebruikt om de hoeveelheid DNA in verschillende monsters te kwantificeren en werd beschouwd als het “totale input-DNA”. Supernatanten werden geïncubeerd met een 50%-slurry van zalmsperma-DNA/eiwit-agarose om niet-specifieke achtergrond te verminderen. Vervolgens werd gedurende de nacht bij 4°C immunoprecipitatie uitgevoerd met 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) of zonder antilichaam (negatieve controle). Deze supernatanten werden aangevuld met 5 mol/L NaCl en gedurende de nacht bij 65°C verwarmd om de crosslinks tussen eiwitten en DNA ongedaan te maken. De immuuncomplexen werden verder behandeld met DNase- en RNase-vrije proteïnase K, en het DNA werd gezuiverd door fenol/chloroformextractie en ethanolprecipitatie. PCR werd uitgevoerd met specifieke primers die overeenkomen met een sequentie binnen de promotorregio van het menselijke iNOS-gen (p1-primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2-primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

Onderzoek naar EGFP-expressie

Voor expressieonderzoek werd de recombinante stam L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Duitsland), met het gen voor EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein, versterkt groen fluorescerend eiwit) geïntegreerd op de chromosomale ssu-locus, gekweekt in de verschillende media zoals eerder beschreven, met aanvullende toevoeging van 100 mg l^-1 nourseothricine (Jena Bioscience, Duitsland). Tijdens de kweek werden monsters van 1 ml genomen, gecentrifugeerd (2000 × g, 20°C, 10 min) en gewassen met een 0,9% NaCl-oplossing. De pellet werd geresuspendeerd in buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) en gedesintegreerd door sonicatie met de ultrasone processor UP400S (toegepaste energie ∼ 400 Ws). Celresten werden verwijderd door centrifugatie (6000 × g, 4°C, 5 min) en geanalyseerd door natriumdodecylsulfaat–polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) onder reducerende omstandigheden volgens de methode van Laemmli (1970) met 12,5% polyacrylamidegels. EGFP-expressie werd onderzocht in een geagiteerde cultuur. (Fritsche et al. 2007)

Chromatine-immunoprecipitatie

Voor de chromatine-immunoprecipitatieassay werd gebruikgemaakt van ChIP-IT^TM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, VS), volgens de instructies van de fabrikant met enkele aanpassingen. Kort samengevat werden gedifferentieerde menselijke podocyten gedurende 10 min bij kamertemperatuur gecrosslinkt met 1% formaldehyde. De cellen werden gewassen met ijskoude PBS en de fixatiereactie werd gestopt door gedurende 5 min bij kamertemperatuur 0,125 M glycine toe te voegen. De cellen werden opnieuw gewassen met ijskoude PBS en van de schaal geschraapt. Door centrifugatie werden celpellets verkregen, die in de lysisbuffer werden geresuspendeerd. Na centrifugatie werden de gepelleteerde kernen geresuspendeerd in de afschuifbuffer en gedurende 30 min op ijs geïncubeerd. Het chromatine werd door sonicatie afgeschoven met bijvoorbeeld UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Duitsland) bij 25% vermogen met 5 pulsen van elk 20 sec op ijs, tot fragmenten van ongeveer 200–600 bp. Het afgeschoven chromatine werd vervolgens gecentrifugeerd en het supernatant werd verzameld. Voor immunoprecipitaties werd 60 μl chromatine gedurende de nacht bij 4°C onder voorzichtig roteren geïncubeerd met 1 μg antilichamen tegen Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, VK) of NF-κB p50 (Abcam), of met konijnen-IgG (Zymed Laboratories) als negatieve controle. Immuuncomplexen die aan magnetische beads waren gebonden, werden verzameld met een magnetisch statief en grondig gewassen. De crosslinks tussen eiwitten en DNA werden ongedaan gemaakt en het DNA werd geëlueerd voor real-time PCR-analyse. (Ristola et al. 2009)

EHEC-DNA-preparatie voor chiparrayanalyse

Bereiding van cellysaten en geëxtraheerd DNA
Bacteriële pellets die in PBS waren gesuspendeerd tot de gewenste eindconcentratie, werden behandeld met het ultrasone celontsluitingsapparaat UP100H (Hielscher GmbH, Duitsland), uitgerust met een microtip MS1 (1mm in diameter). De werkfrequentie was 30 kHz en het effectieve uitgangsvermogen was 100 W. Tijdens de behandeling werden de monsters gekoeld in een ijswaterbad, gemengd en gecentrifugeerd. De monsters werden gebruikt voor flowcytometrisch onderzoek, terwijl monsters voor latere verwerking een warmtebehandeling ondergingen (95°C, 5 min). De ruwe cellysaten werden verwerkt met een mengsel van fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Een gelijk volume van dit mengsel werd aan het lysaatmonster toegevoegd, de oplossing werd gedurende 15 s krachtig gevortext en gedurende 2 min bij 15.000 x g gecentrifugeerd bij kamertemperatuur (RT), ongeveer 22°C. De bovenste waterige fase met het genomische DNA werd zorgvuldig afgescheiden en verzameld in een nieuw steriel Eppendorf-buisje.
Vervolgens werden de monsters gesoniceerd om het DNA te fragmenteren. De sonicatiestap werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Om de effecten van fragmentatie op het genomische DNA te beoordelen, werden de monsters geanalyseerd met agarosegelelektroforese.
(…) De monsters die eerder gedurende 2,5 min waren gesoniceerd, ondergingen na warmtebehandeling en centrifugatie een extractiestap. Het vrijgekomen DNA werd tweemaal geëxtraheerd met een mengsel van fenol:chloroform:isoamylalcohol en vervolgens gedurende 0 – 15 min een tweede keer gesoniceerd. Agarosegelelektroforese werd gebruikt om de grootteverdeling te bepalen van DNA dat na extractie ultrasoon was gefragmenteerd (figuur rechtsboven). Sterk gefragmenteerd DNA bleek uit de aanwezigheid van een DNA-smeer in plaats van banden met een hoog molecuulgewicht, die verdwenen uit monsters die gedurende 2,5 min of langer waren gesoniceerd. Langere sonicatie verminderde de fragmentlengten geleidelijk tot ongeveer 150 – 600 bp, en sonicatie gedurende 15 min brak deze fragmenten verder af, zoals vooral te zien is aan het bovenste deel van de smeer. De gemiddelde grootte van de DNA-fragmenten nam dus geleidelijk af met de duur van de ultrasone behandeling, en met een behandeling van 5 min konden de DNA-fragmentgroottes worden verkregen die het meest geschikt waren voor chiparrayassays. Uiteindelijk werd een procedure voor de preparatie van de DNA-analyt vastgesteld, bestaande uit eerst 2 min ultrasone behandeling, DNA-extractie (2×) en vervolgens 5 min sonicatie. (Basselet et al. 2008)

Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

HEK293-cellen werden gekweekt zoals hierboven beschreven en gedurende 45 min bij kamertemperatuur gefixeerd met 2 mM disuccinimidylglutaraat. Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met PBS. Chromatine werd gedurende 10 min bij kamertemperatuur gecrosslinkt met 1% (v/v) formaldehyde en tweemaal gewassen met ijskoude PBS. De crosslinkreactie werd gestopt door gedurende 5 min bij kamertemperatuur te incuberen met glycine bij een eindconcentratie van 0,125 M. Na incubatie met trypsine werden de cellen van de celkweekschaal geschraapt en tweemaal gewassen met PBS. De celpellet werd geresuspendeerd in lysisbuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl en 0,5% (v/v) Nonidet P-40), gedurende 10 min op ijs geïncubeerd en gehomogeniseerd met een Dounce-homogenisator. Vervolgens werden de kernen gepelleteerd door centrifugatie (3500 x g, 5 min, 4 °C) en geresuspendeerd in kernbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA en 1% (w/v) SDS). De kernen werden door sonicatie met drie pulsen van 20 s ontsloten in een sonicator UP50H (Hielscher Ultraschall Technologie) met een cyclusinstelling van 0,5 en een amplitude van 30%, wat genomische DNA-fragmenten opleverde met een grootte van overwegend 200 – 1000 bp. Voor ChIP werd 50g DNA 4-voudig verdund in immunoprecipitatiebuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 en 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Analyse van histonmodificaties door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Kort samengevat werden 6 x 10⁶ cellen tweemaal gewassen met PBS en gedurende 15 min bij kamertemperatuur op de kweekplaat gecrosslinkt in aanwezigheid van 0,5% formaldehyde. De crosslinkreactie werd gestopt door toevoeging van 0,125 M glycine. Alle daaropvolgende stappen werden uitgevoerd bij 48°C. Alle buffers waren vooraf gekoeld en bevatten proteaseremmers (Complete Mini, Roche). De cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervolgens afgeschraapt. De verzamelde pellets werden opgelost in 1 ml lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) en in een koud ethanolbad gedurende 10 cycli bij 100% amplitude gesoniceerd met een sonicator UP50H (Hielscher, Teltow, Duitsland). Chromatinefragmentatie werd zichtbaar gemaakt in een 1% agarosegel. De verkregen fragmenten lagen in het bereik van 200–500pb. Oplosbaar chromatine werd verkregen door de gesoniceerde monsters gedurende 10 min bij 14.000g en 48°C te centrifugeren. De oplosbare fractie werd 1/10 verdund in verdunningsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl), vervolgens in aliquots verdeeld en tot gebruik bij 80°C bewaard. (Rodriguez et al. 2008)