Ultrasoon DNA-scheren
- Tijdens het afschuiven van DNA en RNA worden DNA-moleculen in kleinere stukjes gebroken. DNA / RNA fragmentatie is een van de belangrijke sample prep stappen die nodig zijn om bibliotheken te maken voor next generation sequencing (NGS).
- Ultrasoon DNA-scheren gebruikt de krachten van akoestische cavitatie om het DNA of RNA te breken in stukjes van 100 – 5kb bp.
- Ultrasoon scheren zorgt voor precieze DNA-fragmentatie en aanpassing aan de gewenste DNA-lengte.
DNA afschuiven met ultrasoon geluid
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone oplossingen voor het knippen van DNA, RNA en chromatine. Kies tussen een sonde-type ultrasoonapparaat (bijv. UP100H) voor directe sonicatie met behulp van een microtip, of gebruik de VialTweeeter of de ultrasone cuphorn voor indirecte DNA-preparatie van verschillende monsters tegelijkertijd. Hielscher biedt het ideale apparaat afhankelijk van uw behoeften: of u nu 1 of maximaal 10 monsters hebt, volumes van microliter tot liter... – Hielscher ultrasone processors zijn beschikbaar om te voldoen aan uw eisen om DNA, RNA en chromatinefragmenten op de juiste lengte te prepareren. Reproduceerbaarheid, eenvoudige bediening en nauwkeurige controle zorgen voor een betrouwbare bibliotheek voor next-generation sequencing.
In tegenstelling tot enzymatische DNA-fragmentatie past ultrasoon scheren zuiver mechanische schuifkrachten toe zonder toevoeging van chemicaliën. Door de precieze instelling van procesparameters produceert ultrasoon scheren DNA-fragmenten met een hoog molecuulgewicht (plasmide en genomisch DNA).
Gezuiverde nucleïnezuren kunnen voor of na een fragmentatiestap worden geamplificeerd.
Sonicatieparameters (vermogen, pulscyclus/bursts, tijd en temperatuur) kunnen veilig worden geregeld via software-instellingen.
- nauwkeurige regeling
- sonicatiecycli en -tijd nauwkeurig aanpasbaar aan de gewenste DNA-grootte
- DNA-fragmenten met een hoog molecuulgewicht
- temperatuurregeling
- Snel
- reproduceerbare resultaten
- Autoclaveerbaar
- verschillende oplossingen: sonde-type, VialTweeter en kopshoorn
Protocollen voor ultrasoon DNA-scheren
Voor chromatine-immunoprecipitatie assay
Kort gezegd werden cellen uitgezet in schalen met een diameter van 60 mm (400.000 per schaal) en getransfecteerd met RhoA siRNA (zoals beschreven); na 72 uur werden ze geïncubeerd met formaldehyde (eindconcentratie 1%) gedurende 10 minuten bij 37 °C om eiwitten te verknopen met DNA. De verknopingsreactie werd gedoofd door toevoeging van een tiende volume van 1,25 mol / L glycine, waardoor 125 mmol / L eindconcentratie. Cellen werden tweemaal gewassen met ijskoud PBS, geresuspendeerd in radioimmunoprecipitatie assay buffer [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholaat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0)] met 1 mmol / L fenylmethylsulfonylfluoride, 1 Ag / ml aprotinine en 1 Ag / ml pepstatine A, en bewaard op ijs gedurende 30 minuten. Vervolgens werden cellysaten gesonitiseerd op ijs met een Hielscher UP200S ultrasone sonicator (3 x 40 s, amplitude 40%, cyclus 1; Hielscher Ultrasonics GmbH) totdat vernette chromatines werden afgeschud om DNA-fragmenten tussen 200 en 1.000 bp op te leveren. Een tiende van het hele lysaat werd gebruikt om de hoeveelheid DNA in verschillende monsters te kwantificeren en werd beschouwd als “totaal input-DNA”. Supernatanten werden geïncubeerd met zalm sperma DNA/eiwit agarose-50% slurry om niet-specifieke achtergrond te verminderen. Vervolgens werd immunoprecipitatie uitgevoerd gedurende één nacht bij 4 °C met 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) of zonder antilichaam (negatieve controle). Deze supernatanten werden aangevuld met 5 mol/L NaCl en overnacht verwarmd bij 65°C om eiwit-DNA-kruisverbindingen terug te draaien. De immunocomplexen werden verder behandeld met DNase- en RNase-vrije proteïnase K en het DNA werd gezuiverd door fenol/chloroformextractie en ethanolprecipitatie. PCR werd gedaan met specifieke primers die corresponderen met een sequentie binnen de promotorregio van het menselijke iNOS-gen (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)
EGFP-expressiestudies
Voor expressiestudies werd de recombinante stam L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience, Duitsland) met het gen voor EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), chromosomaal ssu geïntegreerd, gekweekt in de verschillende media zoals eerder beschreven en aangevuld met 100 mg l-1 Nourseothricine (Jena Bioscience, Duitsland). Tijdens de kweek werden 1 ml monsters genomen, gecentrifugeerd (2000 × g, 20°C, 10 min) en gewassen met 0,9% NaCl-oplossing. De pellet werd geresuspendeerd in buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) en uiteengevallen door sonificatie met de ultrasone processor. UP400S (toepassing van energie ∼ 400 Ws). Celresten werden verwijderd door centrifugeren (6000 × g, 4°C, 5 min) en geanalyseerd door natriumdodecylsulfaat - polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) onder reducerende omstandigheden volgens de methode van Laemmli (1970) met 12,5% polyacralamide gels. EGFP-expressie werd onderzocht in geagiteerde cultuur. (Fritsche et al. 2007)
chromatine-immunoprecipitatie
De chromatine-immunoprecipitatietest werd uitgevoerd met de ChIP-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, VS) volgens de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen. Kort gezegd werden gedifferentieerde humane podocyten gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur vernet met 1% formaldehyde. De cellen werden gewassen met ijskoud PBS en de fixatiereactie werd gestopt door toevoeging van 0,125 M glycine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden opnieuw gewassen met ijskoud PBS en van de schaal geschraapt. De cellen werden gepelleteerd door centrifugeren en geresuspendeerd in de lysisbuffer. Na centrifugeren werden de gepelleteerde kernen geresuspendeerd in de afschuifbuffer, gedurende 30 minuten geïncubeerd op ijs en werd het chromatine afgeschud door sonicatie, bijv. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Duitsland) bij 25% vermogen 5 pulsen van elk 20 seconden op ijs tot fragmenten van ongeveer 200-600 bp. Het geschoren chromatine werd vervolgens gecentrifugeerd en het supernatant werd verzameld. Voor immunoprecipitaties werd 60 μl chromatine geïncubeerd met 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, UK) of NF-κB p50 (Abcam) antilichamen of met konijnen-IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA), als negatieve controle, overnacht bij 4 °C met zachte rotatie. Immunocomplexen gebonden aan magnetische korrels werden verzameld met behulp van een magnetische standaard, uitgebreid gewassen, en de eiwit/DNA-kruisverbindingen werden omgekeerd en DNA geëlueerd voor real-time PCR-analyse. (Ristola et al. 2009)
EHEC DNA voorbereiding voor chip array analyse
Rangschikking van cellysaten en geëxtraheerd DNA
Bacteriepellets gesuspendeerd in PBS tot de gewenste eindconcentratie werden behandeld met ultrasone verstoorder UP100H (Hielscher GmbH, Duitsland) uitgerust met een microtip MS1 (1 mm in diameter). De werkfrequentie was 30 kHz en het effectieve uitgangsvermogen was 100 W. Tijdens de werking werden de monsters gekoeld in een ijsbad, gemengd en gecentrifugeerd. De monsters werden gebruikt voor flowcytometrisch onderzoek, terwijl de monsters voor latere verwerking een warmtebehandeling ondergingen (95 °C, 5 min). De ruwe cellysaten werden verwerkt met een mengsel van fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Een gelijk volume van dit mengsel werd toegevoegd aan het lysaatmonster, de oplossing werd gedurende 15 seconden krachtig geveerd en gecentrifugeerd bij 15.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) rond 22°C. De bovenste waterige fase die het genomisch DNA bevatte, werd zorgvuldig gescheiden en verzameld in een nieuwe steriele Eppendorf-buis.
Vervolgens werden de monsters gesonitiseerd om het DNA te fragmenteren. De sonicatiestap werd uitgevoerd onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Om de fragmentatie-effecten op het genomisch DNA te evalueren, werden de monsters geanalyseerd met agarosegelelektroforese.
(…) De monsters die eerder gedurende 2,5 min werden gesonitiseerd, werden na warmtebehandeling en centrifugeren onderworpen aan een extractiestap. Vrijkomend DNA werd twee keer geëxtraheerd met een fenol:chloroform:isoamylalcoholmengsel en vervolgens onderworpen aan een tweede sonicatie gedurende 0 - 15 min. Agarosegelelektroforese werd gebruikt om de grootteverdeling te bepalen van DNA dat na extractie ultrasoon werd gefragmenteerd (Fig. rechtsboven). Sterk gefragmenteerd DNA bleek eerder uit de aanwezigheid van een DNA-uitstrijk dan uit banden met een hoog moleculair gewicht die werden geëlimineerd uit monsters die 2,5 min of langer werden geësoniseerd. Langere sonificatie verminderde geleidelijk de fragmentlengte tot ongeveer 150-600 bp en sonificatie gedurende 15 minuten breekt deze fragmenten verder af, zoals vooral te zien is aan het bovenste deel van de uitstrijk. De gemiddelde grootte van de DNA-fragmenten nam dus geleidelijk af met de ultrasoontijd en de behandeling van 5 minuten maakte het mogelijk om de grootte van de DNA-fragmenten te verkrijgen die het meest geschikt waren voor chip array assays. Uiteindelijk werd de voorbereidingsprocedure voor DNA-analyses vastgesteld, bestaande uit eerst 2 minuten ultrasone behandeling, DNA-extractie (2×) en vervolgens 5 minuten sonicatie. (Basselet et al. 2008)
Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)
HEK293 cellen werden gekweekt zoals hierboven beschreven en gefixeerd met 2 mM disuccinimidyl-glutaraat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met PBS. Chromatine werd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur verknoopt met 1% (v/v) formaldehyde en tweemaal gewassen met ijskoud PBS. De verknopingsreactie werd gestopt door incubatie met glycine in een eindconcentratie van 0,125 M gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie met trypsine werden de cellen uit de celkweekschaal geschraapt en tweemaal gewassen met PBS. De celpellet werd geresuspendeerd in lysisbuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl en 0,5% (v/v) Nonidet P-40), geïncubeerd op ijs gedurende 10 minuten en gehomogeniseerd met een Dounce homogenisator. Vervolgens werden de kernen gepelleteerd door centrifugeren (3500 x g, 5 min, 4 °C) en geresuspendeerd in kernenbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA en 1% (w/v) SDS). Nuclei werden verstoord door sonicatie met drie pulsen van 20 seconden in een UP50H sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bij een instelling van cyclus 0,5 en amplitude 30%, wat genomische DNA-fragmenten opleverde met een bulkgrootte van 200 - 1000 bp. Voor ChIP werd 50g DNA 4-voudig verdund in immunoprecipitatiebuffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v/v) Triton X-100 en 0,01% (w/v) SDS). (Weiske et al. 2006).
Analyse van histonmodificatie door chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)
Kort samengevat, 6 x 106 cellen werden tweemaal gewassen met PBS en verknoopt op de kweekplaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in aanwezigheid van 0,5% formaldehyde. De verknopingsreactie werd gestopt door 0,125 M glycine toe te voegen. Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij 48°C. Alle buffers werden voorgekoeld en bevatten proteaseremmers (Complete Mini, Roche). De cellen werden tweemaal gewassen met PBS en vervolgens geschraapt. Verzamelde pellets werden opgelost in 1 ml lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) en werden gesonitiseerd in een koud ethanolbad gedurende 10 cycli bij 100% amplitude met een UP50H sonicator (Hielscher, Teltow, Duitsland). Chromatinefragmentatie werd gevisualiseerd in 1% agarosegel. De verkregen fragmenten lagen in het bereik van 200-500pb. Oplosbaar chromatine werd verkregen door de gesoniseerde monsters bij 14.000 g gedurende 10 minuten bij 48 °C te centrifugeren. De oplosbare fractie werd 1/10 verdund in verdunningsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) en vervolgens aliquotten en opgeslagen bij 80°C tot gebruik. (Rodriguez et al. 2008)
Apparaat | Vermogen [W] | Type | Volume [mL] | ||
---|---|---|---|---|---|
UIP400MTP | 400 | voor microtiterplaten | vanaf 6 | – | 3465 putten | VialTweeter | 200 | stand-alone | 0.5 | – | 1.5 |
UP50H | 50 | handheld of staand | 0.01 | – | 250 |
UP100H | 100 | handheld of staand | 0.01 | – | 500 |
UP200Ht | 200 | handheld of staand | 0.1 | – | 1000 |
UP200St | 200 | staand | 0.1 | – | 1000 |
UP400St | 400 | staand | 5.0 | – | 2000 |
kopshoorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 | – | 200 |
GDmini2 | 200 | verontreinigingsvrije doorstroomcel |
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
Literatuur/referenties
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Monsterverwerking voor DNA-chiparraygebaseerde analyse van enterohemorragische Escherichia coli (EHEC). Microbiële celfabrieken 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing draait de resistentie tegen doxorubicine terug in humane colonkankercellen. Moleculair kankeronderzoek 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Evaluatie van de methode voor Fusarium DNA-extractie uit mycelia en tarwe voor downstream real-time PCR-kwantificering en correlatie met mycotoxinegehaltes. Tijdschrift voor microbiologische methoden 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Karakterisering van het groeigedrag van Leishmania tarentolae - een nieuw expressiesysteem voor recombinante eiwitten. Tijdschrift voor Basismicrobiologie 47, 2007. 384-393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regeling van het Neph3-gen in podocyten - sleutelrol van transcriptiefactoren NF-κB en Sp1. BMC Moleculaire Biologie 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genoomwijde opsporing van niet-gemethyleerde DNA Alu herhalingen in normale en kankercellen. Nucleïnezuuronderzoek Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): Het histidinetriade-eiwit Hint1 triggert apoptose onafhankelijk van zijn enzymatische activiteit. Tijdschrift voor biologische chemie. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356-27366.