Hielscher Echografietechniek

Ultrasone DNA Shearing

  • Gedurende DNA en RNA afschuiving worden DNA-moleculen in kleinere stukjes gebroken. DNA / RNA fragmentatie is een van de belangrijke sample prep stappen nodig maken bibliotheken next generation sequencing (NGS).
  • Ultrasone DNA schuifkrachten gebruikt de krachten van akoestische cavitatie aan het DNA of RNA in stukken van 100 breken – 5KB bp.
  • Ultrasone afschuiving zorgt voor nauwkeurige DNA-fragmentatie en aanpassing aan de gewenste DNA lengte.

 

Ultrasone DNA Shearing

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrageluid gebaseerde oplossingen voor DNA, RNA en chromatine afschuiving. Kiezen tussen een probe-type ultrasonicators (bijvoorbeeld UP100H) voor directe ultrasoonapparaat via een microtip of gebruik het VialTweeeter of ultrasone cuphorn voor DNA- bereiding van verschillende monsters indirecte tegelijk. Hielscher biedt de ideale inrichting rekening houdend met uw behoeften: Of heb je 1 of tot 10 monsters, volumes van microliter tot liter volumes – Hielscher ultrasone processors beschikbaar om uw behoeften aan DNA, RNA en chromatine fragmenten te bereiden op de juiste lengte. Reproduceerbaarheid, eenvoudige bediening en een nauwkeurige controle mogelijk te maken voor een betrouwbare bibliotheek voor next-generation sequencing.
In tegenstelling tot enzymatische DNA- fragmentatie, ultrasone afschuiven zijn zuiver mechanische afschuifkrachten zonder toevoeging van chemicaliën. Door de nauwkeurige instelling van de procesparameters, ultrasone afschuifkrachten produceert hoogmoleculair DNA-fragmenten molecuul (plasmide en genoom DNA).
Gezuiverde nucleïnezuren kunnen worden versterkt voor of na een fragmentatiestap.
Ultrasoonapparaat parameters (vermogen, impulscyclus / bursts, tijd en temperatuur) kan veilig worden bestuurd via software-instellingen.

voordelen:

  • nauwkeurige controle
  • sonicatie cycli en de tijd nauwkeurig aangepast aan de gewenste DNA size
  • hoogmoleculair DNA-fragmenten moleculair
  • temperatuurregeling
  • Snel
  • reproduceerbare resultaten
  • autoclaveerbaar
  • verschillende oplossingen: Sonde-type, VialTweeter en Cuphorn

Protocollen voor ultrasoon DNA Shearing

Voor Chromatine immunoprecipitatie assay

In het kort werden cellen uitgeplaat in schalen met een diameter van 60 mm (400.000 per schaal) en getransfecteerd met RhoA-siRNA (zoals beschreven); na 72 uur werden ze gedurende 10 minuten bij 37 ° C met formaldehyde (eindconcentratie, 1%) geïncubeerd om eiwitten met DNA te verknopen. De verknopingsreactie werd geblust door de toevoeging van eentiende volume van 1,25 mol / L glycine, waardoor een uiteindelijke concentratie van 125 mmol / 1 werd verkregen. Cellen werden tweemaal gewassen met ijskoude PBS, opnieuw gesuspendeerd in radioimmunoprecipitatie assaybuffer [150 mmol / L NaCl, 1% NP40, 0,5% deoxycholaat, 0,1% SDS, 5 mmol / L EDTA, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 8,0 )] met 1 mmol / L fenylmethylsulfonylfluoride, 1 Ag / ml aprotinine en 1 Ag / ml pepstatine A en 30 min op ijs bewaard. Vervolgens werden cellysaten op ijs gesonificeerd met een Hielscher UP200S ultrasound sonicator (3 x 40 s, 40% amplitude, 1 cyclus; Hielscher GmbH Ultrasonics) tot verknoopte chromatins werden geknipt DNA-fragmenten verkregen tussen 200 en 1000 bp. Eén tiende van gehele lysaat werd gebruikt om de hoeveelheid DNA aanwezig in verschillende monsters te kwantificeren en geacht “totale input DNA”. Bovenstaande vloeistoffen werden geïncubeerd met zalmsperma DNA / agarose-eiwit 50% suspensie specifieke achtergrond te verminderen. Immunoprecipitatie werd vervolgens overnacht uitgevoerd bij 4 ° C met 5 Ag anti-NF-nB p65 (Upstate) of zonder antilichaam (negatieve controle). De supernatanten werden aangevuld met 5 mol / l NaCI en overnacht verwarmd bij 65 ° C van eiwit-DNA verknopingen terugkeren. De immunocomplexen werden verder behandeld met DNase- en RNase-vrij proteinase K, en DNA werd gezuiverd met fenol / chloroform extractie en ethanolprecipitatie. PCR werd uitgevoerd met specifieke primers die overeenkomen met een sequentie in het promotorgebied van het humane gen iNOS (p1 primer: 5¶-GAGGGCTTTCCCA- GAACCAAG-3¶; p2 primer: GCTGGGCTACTGACCCAG- CAGTTCCAG-3¶). (Doublier et al., 2008)

EGFP-expressie studies

Voor expressie studies, de recombinante stam L. tarentolae p10 :: F9Begfp1.4dBsat # 12 (Jena Bioscience, Duitsland) met het gen voor EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), SSU chromosomaal geïntegreerd werd in de verschillende media gekweekt zoals eerder beschreven en bovendien aangevuld met 100 mg l-1 Nourseothricine (Jena Bioscience, Duitsland). Tijdens kweek werden monsters van 1 ml genomen, gecentrifugeerd (2000 x g, 20 ° C, 10 min) en gewassen met 0,9% NaCl-oplossing. Pellet werd opnieuw gesuspendeerd in buffer (20 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT) en gedesintegreerd door sonificatie met de ultrasone processor UP400S (Van energie ~ 400 Ws). Celafval werden verwijderd door centrifugatie (6000 x g, 4 ° C, 5 min) en geanalyseerd met natriumdodecylsulfaat - polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) onder reducerende omstandigheden volgens de werkwijze van Laemmli (1970) met 12,5% polyacralamide gelen . EGFP-expressie werd in geroerde kweek onderzocht. (Fritsche et al. 2007)

Hielscher's UP100H werd gebruikt om DNA voor EHEC chip array analyse bereiden

Elektroforetische analyse van genomisch DNA van E. coli EDL933 onderworpen aan 0-15 min ultrasone trillingen. L geeft de DNA Ladder. (Basselet et al. 2008)

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


chromatine immunoprecipitatie

Ultrasone cel verbreker UP100H (100W) voor lysis celdisruptie en DNA afschuiving.De chromatine immunoprecipitatie test werd uitgevoerd met behulp van de chip-ITTM Express (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant met enkele wijzigingen. In het kort, gedifferentieerde menselijke podocytes werden verknoopt met 1% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden gewassen met ijskoude PBS en de vastlegging reactie werd gestopt door toevoeging van 0,125 M glycine gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De cellen werden opnieuw met ijskoude PBS gewassen en afgeschraapt van de schaal. De cellen werden afgecentrifugeerd en geresuspendeerd in lysisbuffer. Na centrifugeren gepelleteerd kernen opnieuw gesuspendeerd in afschuiving buffer, geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten en het chromatine werd gefragmenteerd door sonificatie, b.v. UP100H (Hielscher Ultrasonics GmbH, Teltow, Duitsland) met 25% vermogen van 5 pulsen van 20 sec elk op ijs in fragmenten van ongeveer 200 - 600 bp. Het afgeschoven chromatine werd vervolgens gecentrifugeerd en het supernatant werd verzameld. Voor immuunprecipitaties werd 60 μl chromatine geïncubeerd met 1 μg Sp1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, VS), NF-κB p65 (Abcam, Cambridge, VK) of NF-κB p50 (Abcam) antilichamen of met konijn IgG (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, VS), als een negatieve controle, overnacht bij 4 ° C met zachte rotatie. Immunocomplexen gebonden aan magnetische korrels werden verzameld met behulp van een magnetische standaard, uitgebreid gewassen, en de eiwit / DNA-verknopingen werden omgekeerd en DNA geëlueerd voor real-time PCR-analyse. (Ristola et al. 2009)

EHEC DNA voorbereiding chip array analyse

Regeling van cellysaten en geëxtraheerd DNA
Bacteriële pellets gesuspendeerd in PBS tot de gewenste eindconcentratie werden behandeld met ultrasound verstoorder UP100H (Hielscher GmbH, Duitsland) uitgerust met een microtip MS1 (diameter 1 mm). De werkfrequentie was 30 kHz en het effectieve uitgangsvermogen was 100 W. Tijdens de operatie werden monsters gekoeld in een ijs-waterbad, gemengd en gecentrifugeerd. De monsters werden gebruikt voor flowcytometrieonderzoeken, terwijl voor latere behandeling de monsters werden onderworpen aan een warmtebehandeling (95 ° C, 5 minuten). De ruwe cellysaten werden verwerkt met een mengsel van fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1). Een gelijk volume van dit mengsel werd toegevoegd aan het lysaatmonster, de oplossing werd krachtig gedurende 15 s gevortexed en gecentrifugeerd bij 15.000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (KT) rond 22 ° C. De bovenste waterige fase die het genomische DNA bevatte werd zorgvuldig gescheiden en verzameld in een nieuwe steriele Eppendorf-buis.
Vervolgens werden monsters gesoniceerd om het DNA te fragmenteren. De sonicatiestap werd gerealiseerd onder dezelfde omstandigheden als hierboven beschreven. Om de fragmentatie-effecten op het genomische DNA te evalueren, werden monsters geanalyseerd met behulp van agarosegelelektroforese.
(…) De monsters die eerder gedurende 2,5 min werden gesoniceerd werden onderworpen aan een extractiestap na warmtebehandeling en centrifugatie. Het DNA dat werd vrijgemaakt werd tweemaal geëxtraheerd met een mengsel van fenol: chloroform: isoamylalcohol en daarna onderworpen aan tweede sonicatie gedurende 0 - 15 minuten. Agarose-gelelektroforese werd gebruikt om de grootteverdeling van DNA te bepalen dat werd onderworpen aan ultrasone fragmentatie na extractie (figuur rechtsboven). Sterk gefragmenteerd DNA was duidelijk uit de aanwezigheid van een DNA-uitstrijkje in plaats van banden met hoog molecuulgewicht die werden geëlimineerd uit monsters die gedurende 2,5 min of langer werden gesoniceerd. Langere sonicatie verminderde geleidelijk fragmentlengtes tot ongeveer 150 - 600 bp en sonicatie gedurende 15 minuten verminderde deze fragmenten verder, zoals meestal te zien is aan het bovenste deel van het uitstrijkje. Dus nam de gemiddelde DNA-fragmentafmeting geleidelijk af met ultrasone emoties en de 5 minuten durende behandeling liet toe om de groottes van DNA-fragmenten te verkrijgen die het meest geschikt zijn voor chip-array-assays. Eindelijk werd de DNA-analietbereidingsprocedure die eerste 2 min ultrasone behandeling, DNA-extractie (2x) en daaropvolgende 5 min-sonicatie omvat, vastgesteld. (Basselet et al. 2008)

Chromatine immunoprecipitatie (chip)

Ultrasone processor UP100H voor DNA, RNA en chromatine afschuiving. (Klik om te vergroten!)HEK293-cellen werden gekweekt zoals hierboven beschreven en gefixeerd met 2 mM disuccinimidylglutaraat gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de cellen tweemaal gewassen met PBS. Chromatine werd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur verknoopt met behulp van 1% (v / v) formaldehyde en tweemaal gewassen met ijskoude PBS. De verknopingsreactie werd gestopt door incubatie met glycine bij een eindconcentratie van 0,125 M gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na incubatie met trypsine werden de cellen uit de celkweekschaal geschraapt en tweemaal met PBS gewassen. De celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in lysisbuffer (5 mM Pipes, pH 8,0, 85 mM KCl en 0,5% (v / v) Nonidet P-40), gedurende 10 minuten op ijs geïncubeerd en gehomogeniseerd met een Dounce-homogenisator. Vervolgens werden kernen gepelleteerd door centrifugatie (3500 xg, 5 min, 4 ° C) en geresuspendeerd in nuclei-buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,1, 10 mM EDTA en 1% (gew./vol.) SDS). De kernen werden verstoord door sonicatie met drie pulsen van 20 s in a UP50H-sonicator (Hielscher Ultraschall Technologie) bij een instelling van 0,5 cyclus en amplitude 30%, waarbij genomische DNA-fragmenten met een grootste afmeting van 200-1000 bp. Voor ChIP, 50 g DNA werd verdund 4-voudig immunoprecipitatie buffer (16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM NaCl, 1,2 mM EDTA, 1,1% (v / v) Triton X-100 en 0,01% (w / v) SDS). (Weiske et al. 2006)

Histonmodificatie analyse van chromatine immunoprecipitatie (ChIP)

In het kort, 6 x 106 cellen werden tweemaal gewassen met PBS en gecrosslinked op de kweekplaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in de aanwezigheid van 0,5% formaldehyde. De verknopingsreactie werd gestopt door 0,125 M glycine toe te voegen. Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij 48 ° C. Alle buffers waren vooraf gekoeld en bevatten proteaseremmers (Complete Mini, Roche). De cellen werden tweemaal met PBS gewassen en vervolgens geschraapt. Verzamelde pellets werden opgelost in 1 ml lysisbuffer (1% SDS, 5 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8) en werden gesoniceerd in een koud ethanolbad gedurende 10 cycli met 100% amplitude met behulp van een UP50H-sonicator (Hielscher, Teltow, Duitsland). Chromatine fragmentatie werd gevisualiseerd in 1% agarosegel. Verkregen fragmenten werden in het traject 200-500pb. Oplosbaar chromatine werd verkregen door centrifugeren van de monsters gesoniceerd bij 14.000 g gedurende 10 minuten bij 48 ° C. De oplosbare fractie werd 1/10 verdund in verdunningsbuffer (1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl) en vervolgens in porties verdeeld en bewaard bij 80 ° C tot gebruik. (Rodriguez et al. 2008)

Apparaat Vermogen [W] Type Volume [ml]
VialTweeter 200 op zichzelf staand 0.5 1.5
UP50H 50 handheld of standmounted 0.01 250
UP100H 100 handheld of standmounted 0.01 500
Uf200 ः t 200 handheld of standmounted 0.1 1000
UP200St 200 gemonteerd 0.1 1000
UP400St 400 gemonteerd 5.0 2000
Cuphorn 200 CupHorn, sonoreactor 10 200
GDmini2 200 contaminatievrije stroomcel

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Hielscher's VialTweeter is is'deal voor de gelijktijdige bereiding van meerdere monsters

VialTweeter ultrasoon sample prep

Neem contact met ons op! / Vraag ons!

Vraag voor meer informatie

Gebruik het onderstaande formulier als u aanvullende informatie wilt over ultrasone homogenisatie. We zullen u graag een ultrasoon systeem aanbieden dat aan uw eisen voldoet.









Let op onze Privacybeleid.


Literatuur / Referenties

  • Basselet P., G. Wegrzyn, Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Monsterverwerking DNA chip array gebaseerde analyse van enterohemorragische Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 07:29. 2008.
  • . Doublier S., Riganti Ch, Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., D. Ghigo, Bosia A (008): Gaat terug RhoA Silencing het Resistentie tegen doxorubicine in humane cellen darmkanker. Molecular Cancer Research 6 (10) 2008.
  • Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., T. Börjesson, Spliid NHH, Simonsson M. (2008): Methode evaluatie van Fusarium DNA extractie uit mycelia en tarwe stroomafwaartse real-time PCR kwantificatie en correlatie met mycotoxinen niveaus . Journal of microbiologische methoden 2008.
  • Fritsche C Sitz M., Weiland N., R. Breitling, Pohl H.-D. (2007): Karakterisering van het groeigedrag van Leishmania tarentolae - een nieuwe expressiesysteem voor recombinante eiwitten. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384-393.
  • Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., HOLTHÖFER H. (2009): verordening van Neph3 gen in podocytes - de belangrijkste rollen van transcriptiefactoren NF-KB en SP1. BMC Molecular Biology 10:83 2009.
  • Rodriguez J., L. Vives, Jorda M., C. Morales, Munoz M., E. Vendrell, Peinado M. A. (2008): Genoom-brede volgen van ongemethyleerd DNA Alu herhalingen in normale en kankercellen. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 770-784 2008.
  • Weiske J. Huber O. (2006): De Histidine Triad Protein Hint1 Triggers apoptose onafhankelijk van de enzymatische activiteit. The Journal of Biological Chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006 27.356-27.366.


Feiten die de moeite waard zijn om te weten

Ultrasone / akoestische cavitatie creëert zeer intense krachten die de kristallisatie en neerslag processen bevordert (klik om te vergroten!)

Ultrasone DNA afschuiving gebaseerd op akoestische cavitatie en hydrodynamische afschuifkrachten