Plasmidebereiding met ultrasone behandeling

Ultrasone behandeling is een betrouwbare techniek om plasmide-DNA te fragmenteren. Een nauwkeurig regelbare amplitude, pulsatiemodus en temperatuurregeling zijn de belangrijkste kenmerken van een ultrasone sonicator voor plasmidefragmentatie zonder beschadiging. Bovendien helpt het gebruik van bepaalde middelen om plasmiden tegen afbraak te beschermen. Hielscher Ultrasonics biedt diverse oplossingen voor gecontroleerde plasmidefragmentatie in afzonderlijke monsterbuisjes, voor gelijktijdige sonicatie van talrijke monsters en voor platen met meerdere wells. Lees meer over succesvolle ultrasone plasmidefragmentatie!

Afschuiving van plasmiden met ultrasone behandeling

Wanneer DNA-monsters aan ultrasone golven worden blootgesteld, veroorzaken de ultrasoon opgewekte trillingen akoestische cavitatie in de vloeistof, die DNA-moleculen met een hoog molecuulgewicht door mechanische krachten afschuift of breekt. Sonicatie is de meest gebruikte methode voor experimenten met afschuiving van DNA in bulk, waaronder toepassingen zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarvoor kleine fragmentgroottes absoluut cruciaal zijn om een hoge resolutie te verkrijgen. (vgl. Tseng et al., 2012)
Plasmide-DNA (pDNA) is een specifieke vorm van DNA, gekenmerkt door zijn ringvorm, en komt voor in bacteriën en sommige eukaryoten.
Supercoiled pDNA is de gewenste vorm van plasmide-DNA, omdat deze de beste resultaten oplevert in vervolgprocessen zoals geautomatiseerde sequencing en transfectie. Ultrasone behandeling is geschikt om pDNA, inclusief supercoiled pDNA, succesvol te fragmenteren.
Thompson et al. (2008) toonden aan dat sonicatie van plasmiden, waarvan bekend is dat deze supercoiled DNA fragmenteert, een effectieve manier is om de phred20-leeslengtes bij sequencing zodanig te verbeteren dat ze niet significant verschillen van de controlesjabloon van Beckman Coulter of van enzymatisch gelineariseerde plasmiden.

Gebruik van plasmidevectoren

Plasmiden worden vaak gebruikt als hulpmiddelen om genen te klonen, over te dragen en te manipuleren. Wanneer plasmiden experimenteel voor deze doeleinden worden gebruikt, worden ze vectoren genoemd. DNA-fragmenten of genen kunnen in een plasmidevector worden ingebracht, waardoor een zogenoemd recombinant plasmide ontstaat. Plasmidevectoren worden gebruikt als dragers om recombinant DNA in een gastheercel te brengen en vormen een essentieel onderdeel van moleculair klonen.
“Niet-virale vectoren worden uitgebreid onderzocht op hun mogelijke gebruik in gentherapie voor de behandeling van diverse gecompliceerde ziekten. Niet-virale vectoren beschermen plasmide-DNA tegen fysieke, chemische en enzymatische afbraak en brengen het DNA-molecuul naar de doellocatie. Kationische liposomen, chitosan en andere positief geladen nanodeeltjes vormen bijvoorbeeld complexen met plasmide-DNA door elektrostatische interacties. De gemakkelijk gevormde complexen van kationische liposomen/plasmide-DNA zijn echter relatief groot (d.w.z. 300–400 nm) en heterogeen van aard, waardoor ze moeilijk te gebruiken zijn in farmaceutische toepassingen. De grote en heterogene complexen van plasmide-DNA/liposomen, plasmide-DNA/aerosolen en plasmide-DNA/peptiden kunnen met ultrasone behandeling worden verkleind tot kleinere, homogene deeltjes.” (Sarker et al., 2019)
Een prominent voorbeeld van het gebruik van plasmidevectoren is CRISPR–Cas9. Het CRISPR–Cas9-systeem wordt doorgaans in cellen ingebracht als één groot plasmide of meerdere kleinere plasmiden die coderen voor een doelsequentie, een CRISPR-gids en Cas9.

Ultrasone bereiding van met DNA beladen PLGA-nanodeeltjes door nanoprecipitatie

Jo et al. (2020) gebruikten poly(melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) om een nanodeeltjesdrager te vormen voor het inbrengen van een modelplasmide voor CRISPR–Cas9 in primaire macrofagen afkomstig uit beenmerg. Voor de nanoprecipitatie van PLGA-nanodeeltjes werd PLGA met twee verschillende eindgroepen (ester- en aminegroepen) gebruikt, met als doel dat de positief geladen amine-eindgroepen de inkapselingsefficiëntie en belading verhogen door de ladingsinteracties tussen deze groepen en de negatief geladen ruggengraat van het DNA. In een conische centrifugebuis van polypropyleen van 50 mL werd 100 mg Pluronic F127 opgelost in 20 mL geautoclaveerd gedeïoniseerd water door mengen met een vortexmixer, gevolgd door 30 min milde sonicatie in een ultrasoonbad (zie CupHorn). Er werd een geautoclaveerde magnetische roerstaaf toegevoegd en de oplossing werd gedurende 30 min bij 600 RPM gemengd terwijl de andere oplossingen werden bereid. Gedurende het hele proces werd kunststof laboratoriummateriaal gebruikt in plaats van glaswerk om niet-specifieke adsorptie van DNA tot een minimum te beperken. Oplossingen van PLGA in DMF (44,48 mg/ ml) en TIPS-pentaceen in THF (0,667 mg/ml) werden afzonderlijk bereid. Het PLGA werd gedurende 30 min zonder beweging in DMF gelaten om te bevochtigen, voordat het gedurende 30 min werd gesoniceerd. (voor het volledige protocol zie Jo et al., 2020)

Bescherming van plasmide-DNA tijdens sonicatie

DNA, inclusief plasmiden en supercoiled plasmiden, is zeer gevoelig voor afbraak. Van alle beschikbare fragmentatiemethoden zijn bepaalde nadelen bekend. Ultrasone DNA-fragmentatie is een van de voorkeursmethoden, omdat gecontroleerde sonicatie in combinatie met beschermende maatregelen het mogelijk maakt om door afschuiving en warmte veroorzaakte beschadiging van DNA-strengen te verminderen.
Naast instellingen met een lage amplitude, pulsatiemodus en temperatuurregeling tijdens ultrasone afschuiving van DNA, vertoonde het gebruik van bepaalde middelen een significant beschermend effect tegen DNA-afbraak. Diverse polymeren, peptiden en lipiden beschermen bijvoorbeeld het plasmide-DNA tijdens ultrasone behandeling.

De stabiliteit van plasmide-DNA en nanocomplexen van plasmide-DNA/IL tegen ultrasone afschuifspanning werd onderzocht met een agarosegelelektroforese-assay. Zowel het plasmide-DNA als de nanocomplexen van plasmide-DNA/IL werden gedurende verschillende tijdsperioden aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld. Het plasmide-DNA werd gedurende 0, 10, 20, 30 en 40 minuten aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld. De nanocomplexen van plasmide-DNA/IL werden echter gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld.
(onderzoek en afbeelding: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) toonden aan dat wanneer de nanostructuren van plasmide-DNA / ionische vloeistof (pDNA/IL) gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 min aan ultrasone afschuifspanning werden blootgesteld en werden gecomplexeerd met het commercieel verkrijgbare kationische genoverdrachtsmiddel lipofectamine, het percentage fluorescentiepositieve cellen respectievelijk 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% en 50% bedroeg (zie onderstaande grafiek). Het percentage fluorescentiepositieve cellen nam toe wanneer de nanostructuren gedurende 10 en 20 min aan ultrasone afschuifspanning werden blootgesteld, en nam daarna langzaam af.

Invloed van de ionische vloeistof [Bmim][PF6] op het inbrengen van plasmide-DNA in COS7-cellen. Nanocomplexen van plasmide-DNA/IL (ionische vloeistof) werden gedurende maximaal 120 minuten aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld en met LA gecomplexeerd voordat ze in COS7-cellen werden ingebracht. De gegevens tonen het gemiddelde aantal (%) GFP-positieve HeLa-cellen dat in 10 verschillende microscopische beeldvelden werd geteld, en het experiment werd meerdere keren op drie verschillende dagen uitgevoerd. (Onderzoek en grafiek: ©Sarker et al., 2019)

Ultrasone lysaatbereiding

Protocol voor ultrasone cellysis
Begin met een verrijkt celmonster dat is bereid via een celscheidingsmethode (bijvoorbeeld immunomagnetische celscheiding, fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS), dichtheidsgradiëntcentrifugatie, immunodensiteitscelisolatie).
De celmonsters moeten een volume lysisbuffer bevatten dat geschikt is voor het experimentele doel en de ultrasone sonicator met sonde.
Hypotone buffers hebben de voorkeur, omdat ze ultrasone cellysis bevorderen. Het is belangrijk dat additieven en de zoutconcentratie op passende wijze worden toegepast.
Selecteer uw apparaat voor ultrasone lysis: voor indirecte sonicatie van monsterbuisjes worden de VialTweeter of CupHorn aanbevolen. Voor platen met meerdere wells is de UIP400MTP de ideale ultrasone sonicator. Voor klassieke sonicatie met een sonde is een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht met een microtip het meest geschikt.
Protocol voor sonicatie met een sonde: Plaats de sonde van de ultrasone sonicator in het monstervolume in een microcentrifugebuis en soniceer gedurende ongeveer 10 seconden. Afhankelijk van het DNA-monster kan de sonicatie nog één of twee keer worden herhaald. De benodigde ultrasone energietoevoer (Ws/mL) hangt af van de viscositeit van het monster en het DNA-type. Koeling met een ijsbad en de pulsatiemodus van de ultrasone sonicator helpen thermische afbraak van het monster te voorkomen.
Na ultrasone lysis wordt het monster gecentrifugeerd om de pelletresten (met niet-gelyseerde cellen, celkernen en niet-gelyseerde organellen) af te scheiden.
Als het monster niet onmiddellijk verder wordt verwerkt, kan het bij een geschikte temperatuur worden bewaard om de levensvatbaarheid ervan te behouden.

Ultrasone sonicatoren voor DNA-fragmentatie

Hielscher Ultrasonics biedt diverse op ultrageluid gebaseerde platforms voor fragmentatie van DNA, RNA en chromatine. Deze verschillende platforms omvatten ultrasone sondes (sonotroden), oplossingen voor indirecte sonicatie voor de gelijktijdige monsterbereiding van meerdere buisjes of platen met meerdere wells (bijvoorbeeld platen met 96 wells, microtiterplaten), sonoreactoren en ultrasone cuphorns. Alle platforms voor DNA-afschuiving worden aangedreven door op frequentie afgestemde ultrasone processoren met hoge prestaties, die nauwkeurig regelbaar zijn en reproduceerbare resultaten leveren.

Ultrasone processoren voor elk aantal monsters en elke monstergrootte

Met de ultrasone sonicatoren voor meerdere monsters van Hielscher, de VialTweeter (voor maximaal 10 reageerbuizen) en de UIP400MTP (voor microplaten/platen met meerdere wells), kan de verwerkingstijd van monsters eenvoudig worden verkort dankzij intense en nauwkeurig regelbare ultrasone behandeling, terwijl de gewenste grootteverdeling en opbrengst van DNA-fragmenten worden verkregen. Ultrasone DNA-fragmentatie maakt de stappen van plasmidebereiding efficiënt, betrouwbaar en schaalbaar. Protocollen kunnen lineair worden opgeschaald van één naar talrijke monsters door constante ultrasone parameters toe te passen.
Ultrasone sonicatoren met een sonde met één tot vijf vingers zijn ideaal voor de bereiding van kleinere aantallen monsters. De ultrasone laboratoriumsonicatoren van Hielscher zijn verkrijgbaar met verschillende vermogensniveaus, zodat u het ideale ultrasone apparaat voor celontsluiting kunt kiezen voor uw DNA-gerelateerde toepassing.