Ultrasoonbehandeling is een betrouwbare techniek om plasmide DNA te fragmenteren. Nauwkeurig regelbare amplitude, pulsatiemodus en temperatuurbeheersing zijn de belangrijkste kenmerken van een ultrasoonapparaat voor het onschadelijk maken van plasmide-fragmentatie. Bovendien helpt het gebruik van bepaalde middelen tegen degradatie van plasmiden. Hielscher Ultrasonics biedt diverse oplossingen voor gecontroleerde plasmide fragmentatie van enkele vials, gelijktijdige sonicatie van talrijke monsters evenals multi-well platen. Meer informatie over succesvolle ultrasone plasmide fragmentatie!

Plasmide afschuiving met ultrasoonbehandeling

Wanneer DNA-monsters worden onderworpen aan ultrasone golven, veroorzaken de ultrasoon opgewekte trillingen akoestische cavitatie in de vloeistof die DNA-moleculen met een hoog molecuulgewicht via mechanische krachten afschuift of breekt. Sonificatie is de meest gebruikte methode voor bulk-DNA-scheerexperimenten, met inbegrip van toepassingen zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarvoor kleine fragmentgroottes absoluut cruciaal zijn om een hoge resolutie te verkrijgen. (cf. Tseng et al., 2012)
Plasmide DNA (pDNA) is een specifieke vorm van DNA, gekenmerkt door zijn ringvorm en wordt aangetroffen in bacteriën en sommige eukaryoten.
Supergecoild pDNA is de gewenste vorm van plasmide DNA, aangezien het de beste resultaten oplevert bij down-stream processen zoals geautomatiseerde sequencing en transfectie. Ultrasoonbehandeling is geschikt om pDNA, met inbegrip van supercoiled pDNA, succesvol te fragmenteren.
Thompson et al. (2008) toonden aan dat sonicatie van plasmiden, waarvan bekend is dat het supercoiled DNA fragmenteert, een doeltreffende manier is om de lengte van de sequentie phred20-lezingen te verbeteren tot het punt dat zij niet significant verschillen van het controlesjabloon van Beckman Coulter of enzymatisch gelineariseerde plasmiden.

Gebruik van plasmidevectoren

Plasmiden worden vaak gebruikt als gereedschap om genen te klonen, over te dragen en te manipuleren. Wanneer plasmiden voor deze doeleinden experimenteel worden gebruikt, worden ze vectoren genoemd. DNA-fragmenten of genen kunnen in een plasmidevector worden ingevoegd, waardoor een zogenaamd recombinant plasmide ontstaat. Plasmidevectoren worden gebruikt als vehikel om recombinant DNA in een gastheercel te brengen en zijn een essentieel onderdeel van moleculair klonen.
“Niet-virale vectoren worden uitgebreid bestudeerd voor hun mogelijk gebruik in gentherapie om diverse gecompliceerde ziekten te behandelen. Niet-virale vectoren beschermen plasmide DNA tegen fysische, chemische en enzymatische degradatie en brengen de DNA-molecule naar de plaats van bestemming. Zo vormen kationische liposomen, chitosan en andere positief geladen nanodeeltjes complexen met plasmide DNA door elektrostatische interacties. De gemakkelijk gevormde kationische liposomen/plasmide DNA-complexen zijn echter relatief groot (d.w.z. 300-400 nm) en heterogeen van aard, waardoor zij moeilijk te gebruiken zijn in farmaceutische toepassingen. De grote en heterogene plasmide DNA/liposomen, plasmide DNA/aerosolen, en plasmide DNA/peptidencomplexen kunnen met behulp van ultrasoonbehandeling worden teruggebracht tot kleinere en homogene deeltjes.” (Sarker et al., 2019)
Een prominent voorbeeld van het gebruik van plasmidevectoren is CRISPR-Cas9. Het CRISPR-Cas9-systeem wordt gewoonlijk aan cellen toegediend in de vorm van een enkel groot plasmide of meerdere kleinere plasmiden die coderen voor een doelsequentie, een CRISPR-gids en Cas9.

Ultrasone bereiding van met DNA geladen PLGA nanodeeltjes door nanoprecipitatie

Jo et al. (2020) gebruikten poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) om een nanodeeltjesdrager te vormen voor de levering van een model CRISPR-Cas9 plasmide aan primaire beenmerg-afgeleide macrofagen. Voor de nanoprecipitatie van PLGA-nanodeeltjes werd PLGA met twee verschillende eindgroepen (ester- en aminegroepen) gebruikt, met als doel dat de positief geladen amine-eindkapsels de inkapselingsefficiëntie en de lading verhogen door de ladingsinteracties tussen het en de negatief geladen ruggengraat van het DNA. In een polypropyleen conische centrifugebuis van 50 ml werd 100 mg Pluronic F127 opgelost in 20 ml geautoclaveerd DI-water door vortexmenging, gevolgd door 30 min zachte sonicatie met behulp van een ultrasoon bad (zie CupHorn). Een geautoclaveerde magnetische roerstaaf werd toegevoegd en de oplossing werd gedurende 30 minuten bij 600 omwentelingen per minuut gemengd terwijl de andere oplossingen werden gemaakt. Overal werd plastic laboratoriumgerei gebruikt in plaats van glaswerk om aspecifieke adsorptie van DNA te minimaliseren. Oplossingen van PLGA opgelost in DMF (44,48 mg/ml) en TIPS pentaceen opgelost in THF (0,667 mg/ml) werden afzonderlijk gemaakt. Het PLGA werd gedurende 30 min. rustig in DMF nat gelaten alvorens gedurende 30 min. te sonificeren (voor volledig protocol zie Jo et al., 2020)

Bescherming van plasmide DNA tijdens sonificatie

DNA met inbegrip van plasmiden en supercoiled plasmiden zijn zeer gevoelig voor degradatie. Alle beschikbare fragmentatiemethoden hebben bepaalde nadelen. Ultrasone DNA-fragmentatie is een van de methoden waaraan de voorkeur wordt gegeven, aangezien gecontroleerde sonicatie in combinatie met beschermende maatregelen het mogelijk maakt door afschuiving en hitte veroorzaakte beschadiging van DNA-strengen te beperken.
Naast lage amplitude-instellingen, pulsatiemodus en temperatuurregeling tijdens het ultrasoon scheren van DNA, toonde het gebruik van bepaalde middelen een significant beschermend effect tegen DNA-degradatie. Zo beschermen verschillende polymeren, peptiden en lipiden het plasmide DNA tijdens ultrasoonbehandeling.

De stabiliteit van plasmide DNA en plasmide DNA/IL nanocomplexen tegen ultrasone afschuifstress werd onderzocht met behulp van agarose gelelektroforese assay. Zowel het plasmide DNA als de plasmide DNA/IL nanocomplexen werden gedurende verschillende tijdstippen aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld. Het plasmide DNA werd blootgesteld aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30 en 40 minuten. De plasmide DNA/IL-nanocomplexen werden echter blootgesteld aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten.
(studie en foto: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) toonden aan dat wanneer de plasmide DNA / ionische vloeistof (pDNA/IL) nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 min en gecomplexeerd met de commercieel verkrijgbare kationische genafleveringsagent lipofectamine, het percentage fluorescerende positieve cellen respectievelijk 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, en 50% was (zie onderstaande grafiek). Het percentage fluorescerende positieve cellen steeg toen de nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende 10 en 20 min, en daalde daarna langzaam.

Invloed van ionische vloeistof [Bmim][PF6] op de afgifte van plasmide DNA aan COS7 cellen. Plasmide DNA / LIL (ionische vloeistof) nanocomplexen werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende maximaal 120 minuten en gecomplexeerd met LA voor het afleveren in COS7 cellen. De gegevens tonen het gemiddelde aantal (%) van GFP-positieve HeLa-cellen geteld in 10 verschillende microscopische velden en het experiment werd meerdere malen uitgevoerd op drie verschillende dagen. (Studie en grafiek: ©Sarker et al., 2019)

Ultrasone lysaatbereiding

Ultrasoon cellysis protocol
Begin met een verrijkt cellenmonster dat is bereid via een celscheidingsmethode (bv. immunomagnetische celscheiding, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), centrifugatie met dichtheidsgradiënt, celscheiding met immunodichtheid).
De celmonsters moeten een volume lysisbuffer bevatten dat is afgestemd op het experimentele doel en het sonde-type ultrasoonapparaat.
Hypotone buffers genieten de voorkeur omdat zij de ultrasone cellyse versterken. Het is belangrijk dat additieven en zoutconcentraties op de juiste wijze worden gebruikt.
Selecteer uw ultrasone lysisapparaat: Voor indirecte sonicatie van vials worden de VialTweeter of CupHorn aanbevolen. Voor multiwell-platen is de UIP400MTP het ideale ultrasone apparaat. En voor klassieke sonicatie op basis van een sonde is een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht met een microtip het meest geschikt.
Protocol voor sonde-type sonicatie: Plaats de ultrasone sonde in het monstervolume in een microcentrifugebuis en soniceer gedurende ongeveer 10 seconden. Afhankelijk van het DNA-monster kan de sonicatie nog één of twee keer worden herhaald. De vereiste ultrasone energie-input (Ws/mL) is afhankelijk van de viscositeit van het monster en het DNA-type. Koeling via een ijsbad en pulsatiemodus van de ultrasoneator helpen voorkomen dat het monster thermisch wordt afgebroken.
Na de ultrasone lysis wordt het monster gecentrifugeerd om de pelletresten (met niet-gellyseerde cellen, kernen en niet-gellyseerde organellen) af te scheiden
Als het monster niet onmiddellijk verder wordt verwerkt, kan het bij een geschikte temperatuur worden bewaard om de levensvatbaarheid ervan te behouden.

Ultrasone apparaten voor DNA-fragmentatie

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende platforms op basis van ultrageluid voor DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie. Deze verschillende platforms omvatten ultrasone sondes (sonotrodes), indirecte sonicatieoplossingen voor de gelijktijdige monstervoorbereiding van meerdere buisjes of multi-well-platen (bijv. 96-well-platen, microtiterplaten), sonoreactoren en ultrasone koperen oortjes. Alle platforms voor DNA-scheiding worden aangedreven door frequentie-afgestemde, hoogwaardige ultrasone processoren, die nauwkeurig regelbaar zijn en reproduceerbare resultaten opleveren.

Ultrasone processoren voor elk aantal monsters en elke monstergrootte

Met Hielscher's multi-sample ultrasoonapparaten VialTweeter (voor maximaal 10 reageerbuisjes) en UIP400MTP (voor microtiterplaten/ multiwellplaten) wordt het eenvoudig mogelijk om de monsterverwerkingstijd te verkorten dankzij intense en nauwkeurig regelbare ultrasoonisering, terwijl de gewenste DNA-fragmentgrootteverdeling en opbrengst wordt verkregen. Ultrasone DNA-fragmentatie maakt de plasmidevoorbereidingsstappen efficiënt, betrouwbaar en schaalbaar. Protocollen kunnen lineair worden opgeschaald van één tot talrijke monsters door constante ultrasone parameters toe te passen.
Sonde-ultrasoonapparaten met één tot vijf vingers zijn ideaal voor het prepareren van kleinere aantallen monsters. Hielscher's lab ultrasoonapparaten zijn verkrijgbaar met verschillende vermogensniveaus, zodat u de ideale ultrasoonontstoorder voor uw DNA-gerelateerde toepassing kunt kiezen.