Plasmidevoorbereiding met ultrasoonbehandeling
Ultrasoontechniek is een betrouwbare techniek om plasmide DNA te fragmenteren. Nauwkeurig regelbare amplitude, pulsatiemodus en temperatuurregeling zijn de belangrijkste kenmerken van een ultrasoonapparaat voor niet-schadelijke plasmide fragmentatie. Daarnaast helpt het gebruik van bepaalde middelen om te beschermen tegen afbraak van plasmiden. Hielscher Ultrasonics biedt diverse oplossingen voor gecontroleerde plasmide fragmentatie van enkele flacons, gelijktijdige sonicatie van talrijke monsters en platen met meerdere putjes. Lees meer over succesvolle ultrasone plasmide fragmentatie!
De UIP400MTP maakt nauwkeurig gecontroleerde ultrasoonbehandeling van platen met meerdere putjes mogelijk. Een van de toepassingen van de UIP400MTP is het fragmenteren van plasmide DNA om fragmenten van een specifiek beoogde lengte te verkrijgen.
Plasmide afschuiven met ultrasoonbehandeling
Wanneer DNA-monsters worden blootgesteld aan ultrasone golven, creëren de ultrasoon gegenereerde trillingen akoestische cavitatie in de vloeistof die DNA-moleculen met een hoog molecuulgewicht afschudt of breekt via mechanische krachten. Sonificatie is de meest gebruikte methode voor bulkscheidingsexperimenten met DNA, inclusief toepassingen zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarbij kleine fragmentgroottes absoluut cruciaal zijn om een hoge resolutie te verkrijgen. (cf. Tseng et al., 2012)
Plasmide DNA (pDNA) is een specifieke vorm van DNA die wordt gekenmerkt door zijn ringvorm en wordt aangetroffen in bacteriën en sommige eukaryoten.
Supergewikkeld pDNA is de gewenste vorm van plasmide DNA omdat het de beste resultaten oplevert in downstreamprocessen zoals geautomatiseerde sequentiebepaling en transfectie. Ultrasoon is geschikt om pDNA, inclusief supergewikkeld pDNA, succesvol te fragmenteren.
Thompson et al. (2008) toonden aan dat plasmide-sonicatie, waarvan bekend is dat het supercoiled DNA fragmenteert, een effectieve manier is om de leeslengtes van sequentiephred20 te verbeteren tot het punt dat ze niet significant verschillen van de controlesjabloon van Beckman Coulter of enzymatisch gelineariseerde plasmiden.
- Nauwkeurig bestuurbaar
- Reproduceerbare resultaten
- Aanpasbaar aan de lengte van DNA-fragmenten
- temperatuurregeling
- Schaalbaar tot elke steekproefgrootte
Gebruik van plasmide vectoren
Plasmiden worden vaak gebruikt om genen te klonen, over te dragen en te manipuleren. Wanneer plasmiden experimenteel gebruikt worden voor deze doeleinden, worden ze vectoren genoemd. DNA-fragmenten of genen kunnen in een plasmidevector worden ingevoegd, waardoor een zogenaamd recombinant plasmide ontstaat. Plasmide vectoren worden gebruikt om recombinant DNA in een gastheercel te brengen en zijn een belangrijk onderdeel van moleculair klonen.
“Niet-virale vectoren worden uitgebreid bestudeerd voor hun mogelijke gebruik in gentherapie om verschillende gecompliceerde ziekten te behandelen. Niet-virale vectoren beschermen plasmide DNA tegen fysieke, chemische en enzymatische degradatie en brengen de DNA-molecule naar de doellocatie. Kationische liposomen, chitosan en andere positief geladen nanodeeltjes vormen bijvoorbeeld complexen met plasmide DNA door elektrostatische interacties. De gemakkelijk gevormde kationische liposomen/plasmide DNA-complexen zijn echter relatief groot (d.w.z. 300-400 nm) en heterogeen van aard, waardoor ze moeilijk te gebruiken zijn in farmaceutische toepassingen. De grote en heterogene plasmide DNA/liposomen, plasmide DNA/aërosolen en plasmide DNA/peptidencomplexen kunnen worden gereduceerd tot kleinere en homogene deeltjes met behulp van ultrasoonbehandeling.” (Sarker et al., 2019)
Een prominent voorbeeld van het gebruik van plasmide vectoren is CRISPR-Cas9. Het CRISPR-Cas9-systeem wordt meestal aan cellen geleverd als een enkel groot plasmide of meerdere kleinere plasmiden die coderen voor een doelsequentie, een CRISPR-gids en Cas9.
Ultrasone bereiding van met DNA geladen PLGA-nanopartikels door nanoprecipitatie
Jo et al. (2020) gebruikten poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) om een nanodeeltjesdrager te vormen voor de toediening van een model CRISPR-Cas9-plasmide in primaire beenmergafgeleide macrofagen. Voor de nanoprecipitatie van PLGA-nanodeeltjes werd PLGA met twee verschillende eindgroepen (ester- en aminegroepen) gebruikt, met als doel dat de positief geladen amine-eindgroepen de inkapselingsefficiëntie en de lading verhogen door de ladingsinteracties tussen deze groepen en de negatief geladen ruggengraat van het DNA. In een conische centrifugebuis van 50 ml polypropyleen werd 100 mg Pluronic F127 opgelost in 20 ml autoclaaf DI-water door vortexmenging, gevolgd door 30 minuten zachte sonicatie met behulp van een ultrasoon bad (zie CupHorn). Een geautoclaveerde magnetische roerstaaf werd toegevoegd en de oplossing werd gemengd bij 600 RPM gedurende 30 minuten terwijl de andere oplossingen werden gemaakt. Er werd overal plastic laboratoriumgerei gebruikt in plaats van glasgerei om niet-specifieke adsorptie van DNA te minimaliseren. Oplossingen van PLGA opgelost in DMF (44,48 mg/ml) en TIPS pentaceen opgelost in THF (0,667 mg/ml) werden afzonderlijk gemaakt. De PLGA werd gedurende 30 minuten rustig nat gemaakt in DMF voordat het gedurende 30 minuten met ultrasone trillingen werd behandeld (zie Jo et al., 2020 voor het volledige protocol).
- Extractie van DNA
- Inkapseling van DNA
- Dispersie van met nanodeeltjes bedekt DNA
- Afleveren van plasmide DNA in cellen
De UP200St CupHorn voor de indirecte sonicatie van monsters, bijvoorbeeld voor DNA-extractie en -fragmentatie.
Plasmide DNA-bescherming tijdens Sonicatie
DNA inclusief plasmiden en supergewikkelde plasmiden zijn zeer gevoelig voor degradatie. Alle beschikbare fragmentatiemethoden hebben bepaalde nadelen. Ultrasone DNA-fragmentatie is een van de voorkeursmethoden omdat gecontroleerde sonicatie in combinatie met beschermende maatregelen het mogelijk maakt om schade aan DNA-strengen door afschuiving en hitte te beperken.
Naast lage amplitude-instellingen, pulsatiemodus en temperatuurregeling tijdens ultrasoon DNA-scheren, bleek het gebruik van bepaalde middelen een significant beschermend effect te hebben tegen DNA-degradatie. Zo beschermen verschillende polymeren, peptiden en lipiden het plasmide-DNA tijdens ultrasoneren.
De stabiliteit van plasmide DNA en plasmide DNA/IL-nanocomplexen tegen ultrasone afschuifspanning werd onderzocht met behulp van agarosegelelektroforese. Zowel het plasmide DNA als de plasmide DNA/IL-nanocomplexen werden gedurende verschillende tijdstippen blootgesteld aan ultrasone schuifspanning. Het plasmide DNA werd gedurende 0, 10, 20, 30 en 40 minuten blootgesteld aan ultrasone schuifspanning. De plasmide DNA/IL-nanocomplexen werden echter gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten blootgesteld aan ultrasone schuifspanning.
Sarker et al. (2019) toonden aan dat wanneer de plasmide DNA? ionische vloeistof (pDNA/IL) nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone schuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 min en werden gecomplexeerd met het commercieel verkrijgbare kationische genafleveringsmiddel lipofectamine, het percentage fluorescentiepositieve cellen respectievelijk 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65% en 50% was (zie onderstaande grafiek). Het percentage fluorescente positieve cellen nam toe toen de nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone schuifspanning gedurende 10 en 20 minuten, en nam daarna langzaam af.
Invloed van ionische vloeistof [Bmim][PF6] op de toediening van plasmide DNA aan COS7-cellen. Plasmide DNA/IL (ionische vloeistof) nanocomplexen werden onderworpen aan ultrasone schuifspanning gedurende maximaal 120 minuten en gecomplexeerd met LA voor aflevering in COS7 cellen. De gegevens tonen het gemiddelde aantal (%) GFP-positieve HeLa-cellen geteld in 10 verschillende microscopische velden en het experiment werd meerdere keren uitgevoerd op drie verschillende dagen. (Studie en grafiek: ©Sarker et al., 2019)
Plasmide DNA kan worden beschermd door een middel toe te voegen vóór de ultrasone fragmentatie: Sonisch geïnduceerde degradatie van naakt pDNA (A) en van pDNA geformuleerd met 1,5 mM CaCl2 en 20% (v/v) t-butanol (B)
Ultrasone lysaatbereiding
Ultrasoon cellyseprotocol
Begin met een verrijkt celmonster dat is bereid via een celscheidingsmethode (bijv. immunomagnetische celscheiding, fluorescentiegeactiveerde celsortering (FACS), centrifugeren met dichtheidsgradiënt, immunodensiteitscelisolatie).
De celmonsters moeten een volume van een lysisbuffer hebben dat geschikt is voor het experimentele doel en de ultrasone sonde.
Hypotone buffers verdienen de voorkeur omdat ze de ultrasone cellyse versterken. Het is belangrijk dat additieven en zoutconcentraties op de juiste manier worden gebruikt.
Selecteer het ultrasone lysisapparaat: Voor indirecte sonicatie van vials worden de VialTweeter of CupHorn aanbevolen. Voor multiwellplaten is de UIP400MTP het ideale ultrasoonapparaat. En voor klassieke sonicatie met een sonde is een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht met een microtip het meest geschikt.
Protocol voor sonde-type sonicatie: Plaats de ultrasone sonde in het monstervolume in een microcentrifugebuis en soniceer gedurende ongeveer 10 seconden. Afhankelijk van het DNA-monster kan de sonicatie nog een of twee keer worden herhaald. De vereiste ultrasone energie-input (Ws/mL) is afhankelijk van de viscositeit van het monster en het type DNA. Koeling via een ijsbad en de pulsatiemodus van de ultrasoonator helpen voorkomen dat het monster thermisch wordt aangetast.
Na ultrasone lysis wordt het monster gecentrifugeerd om pelletresten te scheiden (die niet-gelysseerde cellen, kernen en niet-gelysseerde organellen bevatten).
Als het monster niet onmiddellijk verder verwerkt wordt, kan het bij een geschikte temperatuur bewaard worden om de levensvatbaarheid te behouden.
Ultrasone apparaten voor DNA-fragmentatie
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone platforms voor DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie. Deze verschillende platforms omvatten ultrasone sondes (sonotrodes), indirecte sonicatieoplossingen voor de gelijktijdige monstervoorbereiding van meerdere buizen of platen met meerdere putjes (bijv. 96-wells platen, microtiterplaten), sonoreactoren en ultrasone koperen hoorns. Alle platforms voor het knippen van DNA worden aangedreven door op frequentie afgestemde, hoogwaardige ultrasone processors, die nauwkeurig regelbaar zijn en reproduceerbare resultaten leveren.
Ultrasone processors voor elk aantal monsters en elke grootte
Met Hielscher's multi-sample ultrasoonapparaten VialTweeter (voor maximaal 10 reageerbuisjes) en UIP400MTP (voor microplaten/multiwellplaten) wordt het gemakkelijk mogelijk om de verwerkingstijd van monsters te verkorten door intensieve en nauwkeurig controleerbare ultrasone trillingen, terwijl de gewenste grootteverdeling en opbrengst van DNA-fragmenten worden verkregen. Ultrasone DNA-fragmentatie maakt plasmide-voorbereidingsstappen efficiënt, betrouwbaar en schaalbaar. Protocollen kunnen lineair worden geschaald van één naar meerdere monsters door constante ultrasone parameters toe te passen.
Sonde-ultrasoonapparaten met één tot vijf vingers zijn ideaal voor de bereiding van kleinere monsteraantallen. De ultrasoonapparaten voor laboratoria van Hielscher zijn verkrijgbaar met verschillende vermogensniveaus, zodat u de ideale ultrasone verstoorder voor uw DNA-gerelateerde toepassing kunt kiezen.
Het ultrasone multi-monster prepareerapparaat VialTweeter maakt gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 vials mogelijk. Met het clamp-on apparaat VialPress kunnen tot 4 extra buisjes naar voren worden gedrukt voor intense sonicatie.
nauwkeurige procesbesturing
Nauwkeurig regelbare sonicatie-instellingen zijn cruciaal, aangezien uitputtende sonificatie DNA, RNA en chromatine kan vernietigen, maar onvoldoende ultrasone afschuiving resulteert in te lange DNA- en chromatinefragmenten. De digitale ultrasoonapparaten van Hielscher kunnen eenvoudig worden ingesteld op een nauwkeurige sonicatieparameter. Specifieke sonicatie-instellingen kunnen ook worden opgeslagen als geprogrammeerde instelling voor snelle herhaling van dezelfde procedure.
Alle sonicaties worden automatisch geprotocolleerd en opgeslagen als CSV-bestand op een ingebouwde SD-kaart. Dit zorgt voor nauwkeurige documentatie van uitgevoerde testen en maakt het mogelijk om sonicatieruns eenvoudig te reviseren.
Met de browser-afstandsbediening kunnen alle digitale ultrasone apparaten worden bediend en gecontroleerd via elke standaardbrowser. Installatie van extra software is niet nodig, omdat de LAN-verbinding een zeer eenvoudige plug-n-play installatie is.
Hoogste gebruiksvriendelijkheid tijdens ultrasone DNA-preparatie
Alle Hielscher ultrasoonapparaten zijn ontworpen om ultrasoon geluid met hoge prestaties te leveren, maar zijn tegelijkertijd altijd zeer gebruiksvriendelijk en eenvoudig te bedienen. Alle instellingen zijn goed gestructureerd in een duidelijk menu, dat eenvoudig toegankelijk is via het gekleurde touch-display of de browser-afstandsbediening. De slimme software met programmeerbare instellingen en automatische gegevensregistratie zorgt voor optimale sonicatie-instellingen voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten. De duidelijke en gebruiksvriendelijke menu-interface maakt van de Hielscher ultrasoonapparaten gebruiksvriendelijke en efficiënte apparaten.
De onderstaande tabel geeft je een indicatie van de verwerkingscapaciteit bij benadering van onze ultrasone laboratoria voor cellyse en DNA-fragmentatie:
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| multi-wells platen | n.v.t. | UIP400MTP |
| flesjes, klein bekerglas | n.v.t. | Ultrasone kopHoorn |
| tot 10 flesjes | n.v.t. | VialTweeter |
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min | UP100H |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min | UP200Ht, UP400St |
Neem contact met ons op!? Vraag het ons!
Literatuur? Referenties
- Mark D. Thompson, Kelly G. Aukema, Dana M. O’Bryan, Stephen D. Rader, Brent W. Murray (2008): Plasmid sonication improves sequencing efficiency and quality in the Beckman Coulter CEQ system. BioTechniques 2008, 45:3, 327-329
- Fykse, Else; Olsen, Jaran; Skogan, Gunnar (2003): Application of sonication to release DNA from Bacillus cereus for quantitative detection by real-time PCR. Journal of microbiological methods 55, 2003. 1-10.
- Ming L. Wu; Sindélia S. Freitas; Gabriel A. Monteiro; Duarte M. F. Prazeres; José A. L. Santos (2009). Stabilization of naked and condensed plasmid DNA against degradation induced by ultrasounds and high-shear vortices. Biotechnology Applied Biochemistry 53(4), 2009.
- Sarker, Satya Ranjan; Ball, Andrew S.; Bhargava, Suresh Kumar; Soni., Sarvesh K. (2019): Evaluation of plasmid DNA stability against ultrasonic shear stress and its in vitro delivery efficiency using ionic liquid [Bmim][PF6]. RSC Advances 9, 2019. 29225-29231.
- Miguel Larguinho, Hugo M. Santos, Gonçalo Doria, H. Scholz, Pedro V. Baptista, José L. Capelo (2010): Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta, Volume 81, Issue 3, 2010. 881-886.
- Julie Ann Wyber; Julie Andrews; Antony D’Emanuele (1997): The Use of Sonication for the Efficient Delivery of Plasmid DNA into Cells. Pharmaceutical Research 14(6), 1997. 750–756.
Wetenswaardigheden
Wat zijn plasmiden?
Een plasmide is een kleine cirkelvormige DNA-molecule die fysiek gescheiden is van chromosomaal DNA en onafhankelijk repliceert. Plasmiden worden vaak geassocieerd met genen die bijdragen aan de overleving van een organisme en die specifieke voordelen bieden, zoals antibioticaresistentie. Plasmiden worden meestal gevonden als kleine cirkelvormige, dubbelstrengs DNA-moleculen in bacteriën; soms zijn plasmiden echter ook aanwezig in archaea en eukaryotische organismen. Plasmiden zijn belangrijke hulpmiddelen in de moleculaire biologie, genetica, biochemie en biowetenschappen. Plasmiden staan bekend als vectoren in genetische manipulatie en worden gebruikt om bepaalde genen te repliceren of tot expressie te brengen. De gerichte wijziging van een vector wordt vectorontwerp genoemd.
GFP-analyse in celonderzoek
Groen fluorescerend eiwit (GFP) is een veelzijdige biologische marker voor het monitoren van fysiologische processen, het visualiseren van eiwitlokalisatie en het detecteren van transgene expressie in vivo. GFP kan worden geëxciteerd door de 488 nm laserlijn en wordt optimaal gedetecteerd bij 510 nm.
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.