Plasmidevoorbereiding met behulp van ultrasoonbehandeling

Ultrasoonbehandeling is een betrouwbare techniek om plasmide DNA te fragmenteren. Nauwkeurig regelbare amplitude, pulsatiemodus en temperatuurbeheersing zijn de belangrijkste kenmerken van een ultrasoonapparaat voor het onschadelijk maken van plasmide-fragmentatie. Bovendien helpt het gebruik van bepaalde middelen tegen degradatie van plasmiden. Hielscher Ultrasonics biedt diverse oplossingen voor gecontroleerde plasmide fragmentatie van enkele vials, gelijktijdige sonicatie van talrijke monsters evenals multi-well platen. Meer informatie over succesvolle ultrasone plasmide fragmentatie!

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Ultrasone DNA-fragmentatie is een betrouwbare en efficiënte techniek die algemeen wordt gebruikt bij Next Generation Sequencing (NGS)

De UIP400MTP maakt een nauwkeurig gecontroleerde ultrasone behandeling van multi-well platen mogelijk. Een van de toepassingen van de UIP400MTP is de fragmentatie van plasmide-DNA om fragmenten van een specifiek beoogde lengte te verkrijgen.

Plasmide afschuiving met ultrasoonbehandeling

Wanneer DNA-monsters worden onderworpen aan ultrasone golven, veroorzaken de ultrasoon opgewekte trillingen akoestische cavitatie in de vloeistof die DNA-moleculen met een hoog molecuulgewicht via mechanische krachten afschuift of breekt. Sonificatie is de meest gebruikte methode voor bulk-DNA-scheerexperimenten, met inbegrip van toepassingen zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), waarvoor kleine fragmentgroottes absoluut cruciaal zijn om een hoge resolutie te verkrijgen. (cf. Tseng et al., 2012)
Plasmide DNA (pDNA) is een specifieke vorm van DNA, gekenmerkt door zijn ringvorm en wordt aangetroffen in bacteriën en sommige eukaryoten.
Supergecoild pDNA is de gewenste vorm van plasmide DNA, aangezien het de beste resultaten oplevert bij down-stream processen zoals geautomatiseerde sequencing en transfectie. Ultrasoonbehandeling is geschikt om pDNA, met inbegrip van supercoiled pDNA, succesvol te fragmenteren.
Thompson et al. (2008) toonden aan dat sonicatie van plasmiden, waarvan bekend is dat het supercoiled DNA fragmenteert, een doeltreffende manier is om de lengte van de sequentie phred20-lezingen te verbeteren tot het punt dat zij niet significant verschillen van het controlesjabloon van Beckman Coulter of enzymatisch gelineariseerde plasmiden.

Voordelen van ultrasone DNA-fragmentatie

  • Nauwkeurig controleerbaar
  • Reproduceerbare resultaten
  • Aanpasbaar aan de lengte van de DNA-fragmenten
  • temperatuurregeling
  • Schaalbaar tot elke steekproefgrootte
De video toont het ultrasone monstervoorbereidingssysteem UIP400MTP, dat de betrouwbare monstervoorbereiding van alle standaard multi-well platen mogelijk maakt met behulp van ultrasoon geluid van hoge intensiteit. Typische toepassingen van de UIP400MTP zijn cellysis, DNA-, RNA- en chromatinescheren en eiwitextractie.

Ultrasoon toestel UIP400MTP voor multi-well sonicatie van platen

Gebruik van plasmidevectoren

Plasmiden worden vaak gebruikt als gereedschap om genen te klonen, over te dragen en te manipuleren. Wanneer plasmiden voor deze doeleinden experimenteel worden gebruikt, worden ze vectoren genoemd. DNA-fragmenten of genen kunnen in een plasmidevector worden ingevoegd, waardoor een zogenaamd recombinant plasmide ontstaat. Plasmidevectoren worden gebruikt als vehikel om recombinant DNA in een gastheercel te brengen en zijn een essentieel onderdeel van moleculair klonen.
“Niet-virale vectoren worden uitgebreid bestudeerd voor hun mogelijk gebruik in gentherapie om diverse gecompliceerde ziekten te behandelen. Niet-virale vectoren beschermen plasmide DNA tegen fysische, chemische en enzymatische degradatie en brengen de DNA-molecule naar de plaats van bestemming. Zo vormen kationische liposomen, chitosan en andere positief geladen nanodeeltjes complexen met plasmide DNA door elektrostatische interacties. De gemakkelijk gevormde kationische liposomen/plasmide DNA-complexen zijn echter relatief groot (d.w.z. 300-400 nm) en heterogeen van aard, waardoor zij moeilijk te gebruiken zijn in farmaceutische toepassingen. De grote en heterogene plasmide DNA/liposomen, plasmide DNA/aerosolen, en plasmide DNA/peptidencomplexen kunnen met behulp van ultrasoonbehandeling worden teruggebracht tot kleinere en homogene deeltjes.” (Sarker et al., 2019)
Een prominent voorbeeld van het gebruik van plasmidevectoren is CRISPR-Cas9. Het CRISPR-Cas9-systeem wordt gewoonlijk aan cellen toegediend in de vorm van een enkel groot plasmide of meerdere kleinere plasmiden die coderen voor een doelsequentie, een CRISPR-gids en Cas9.

Ultrasone bereiding van met DNA geladen PLGA nanodeeltjes door nanoprecipitatie

Jo et al. (2020) gebruikten poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) om een nanodeeltjesdrager te vormen voor de levering van een model CRISPR-Cas9 plasmide aan primaire beenmerg-afgeleide macrofagen. Voor de nanoprecipitatie van PLGA-nanodeeltjes werd PLGA met twee verschillende eindgroepen (ester- en aminegroepen) gebruikt, met als doel dat de positief geladen amine-eindkapsels de inkapselingsefficiëntie en de lading verhogen door de ladingsinteracties tussen het en de negatief geladen ruggengraat van het DNA. In een polypropyleen conische centrifugebuis van 50 ml werd 100 mg Pluronic F127 opgelost in 20 ml geautoclaveerd DI-water door vortexmenging, gevolgd door 30 min zachte sonicatie met behulp van een ultrasoon bad (zie CupHorn). Een geautoclaveerde magnetische roerstaaf werd toegevoegd en de oplossing werd gedurende 30 minuten bij 600 omwentelingen per minuut gemengd terwijl de andere oplossingen werden gemaakt. Overal werd plastic laboratoriumgerei gebruikt in plaats van glaswerk om aspecifieke adsorptie van DNA te minimaliseren. Oplossingen van PLGA opgelost in DMF (44,48 mg/ml) en TIPS pentaceen opgelost in THF (0,667 mg/ml) werden afzonderlijk gemaakt. Het PLGA werd gedurende 30 min. rustig in DMF nat gelaten alvorens gedurende 30 min. te sonificeren (voor volledig protocol zie Jo et al., 2020)

Verwante toepassingen:

  • Extractie van DNA
  • Inkapseling van DNA
  • Dispersie van met nanodeeltjes bedekt DNA
  • Afgifte van plasmide DNA in cellen
UP200St TD_CupHorn voor de indirecte sonicatie van monsters

De UP200St CupHorn voor de indirecte sonicatie van monsters, bijv. voor DNA-extractie en fragmentatie.

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Bescherming van plasmide DNA tijdens sonificatie

DNA met inbegrip van plasmiden en supercoiled plasmiden zijn zeer gevoelig voor degradatie. Alle beschikbare fragmentatiemethoden hebben bepaalde nadelen. Ultrasone DNA-fragmentatie is een van de methoden waaraan de voorkeur wordt gegeven, aangezien gecontroleerde sonicatie in combinatie met beschermende maatregelen het mogelijk maakt door afschuiving en hitte veroorzaakte beschadiging van DNA-strengen te beperken.
Naast lage amplitude-instellingen, pulsatiemodus en temperatuurregeling tijdens het ultrasoon scheren van DNA, toonde het gebruik van bepaalde middelen een significant beschermend effect tegen DNA-degradatie. Zo beschermen verschillende polymeren, peptiden en lipiden het plasmide DNA tijdens ultrasoonbehandeling.

Ionische vloeistoffen kunnen plasmide DNA beschermen tegen beschadiging tijdens sonicatie.

De stabiliteit van plasmide DNA en plasmide DNA/IL nanocomplexen tegen ultrasone afschuifstress werd onderzocht met behulp van agarose gelelektroforese assay. Zowel het plasmide DNA als de plasmide DNA/IL nanocomplexen werden gedurende verschillende tijdstippen aan ultrasone afschuifspanning blootgesteld. Het plasmide DNA werd blootgesteld aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30 en 40 minuten. De plasmide DNA/IL-nanocomplexen werden echter blootgesteld aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 minuten.
(studie en foto: ©Sarker et al., 2019)

Sarker et al. (2019) toonden aan dat wanneer de plasmide DNA / ionische vloeistof (pDNA/IL) nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 en 120 min en gecomplexeerd met de commercieel verkrijgbare kationische genafleveringsagent lipofectamine, het percentage fluorescerende positieve cellen respectievelijk 80%, 98%, 97%, 85%, 78%, 65%, 65%, en 50% was (zie onderstaande grafiek). Het percentage fluorescerende positieve cellen steeg toen de nanostructuren werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende 10 en 20 min, en daalde daarna langzaam.

Ultrasone fragmentatie van plasmide DNA

Invloed van ionische vloeistof [Bmim][PF6] op de afgifte van plasmide DNA aan COS7 cellen. Plasmide DNA / LIL (ionische vloeistof) nanocomplexen werden onderworpen aan ultrasone afschuifspanning gedurende maximaal 120 minuten en gecomplexeerd met LA voor het afleveren in COS7 cellen. De gegevens tonen het gemiddelde aantal (%) van GFP-positieve HeLa-cellen geteld in 10 verschillende microscopische velden en het experiment werd meerdere malen uitgevoerd op drie verschillende dagen. (Studie en grafiek: ©Sarker et al., 2019)

Plasmide DNA kan worden beschermd door toevoeging van een middel vóór de ultrasone fragmentatie.

Plasmide DNA kan worden beschermd door toevoeging van een middel vóór de ultrasone fragmentatie: Sonicatie-geïnduceerde degradatie van naakt pDNA (A) en van pDNA geformuleerd met 1,5 mM CaCl2 en 20 % (v/v) t-butanol (B)
De monsters werden met een 20 W sonde gedurende maximaal 120 s gesoniseerd, zoals aangegeven boven aan elk rijtje. Baan H komt overeen met de Hyperladder I ™️-marker. De OC- en SC-plasmidebanden zijn aangegeven.
(studie en foto's: ©Wu et al., 2009)

Ultrasone lysaatbereiding

Ultrasoon cellysis protocol
Ultrasoonapparaat UP200Ht met microtip S26d2 voor ultrasone lysis van biologische monstersBegin met een verrijkt cellenmonster dat is bereid via een celscheidingsmethode (bv. immunomagnetische celscheiding, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), centrifugatie met dichtheidsgradiënt, celscheiding met immunodichtheid).
De celmonsters moeten een volume lysisbuffer bevatten dat is afgestemd op het experimentele doel en het sonde-type ultrasoonapparaat.
Hypotone buffers genieten de voorkeur omdat zij de ultrasone cellyse versterken. Het is belangrijk dat additieven en zoutconcentraties op de juiste wijze worden gebruikt.
Selecteer uw ultrasone lysisapparaat: Voor indirecte sonicatie van vials worden de VialTweeter of CupHorn aanbevolen. Voor multiwell-platen is de UIP400MTP het ideale ultrasone apparaat. En voor klassieke sonicatie op basis van een sonde is een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht met een microtip het meest geschikt.
Protocol voor sonde-type sonicatie: Plaats de ultrasone sonde in het monstervolume in een microcentrifugebuis en soniceer gedurende ongeveer 10 seconden. Afhankelijk van het DNA-monster kan de sonicatie nog één of twee keer worden herhaald. De vereiste ultrasone energie-input (Ws/mL) is afhankelijk van de viscositeit van het monster en het DNA-type. Koeling via een ijsbad en pulsatiemodus van de ultrasoneator helpen voorkomen dat het monster thermisch wordt afgebroken.
Na de ultrasone lysis wordt het monster gecentrifugeerd om de pelletresten (met niet-gellyseerde cellen, kernen en niet-gellyseerde organellen) af te scheiden
Als het monster niet onmiddellijk verder wordt verwerkt, kan het bij een geschikte temperatuur worden bewaard om de levensvatbaarheid ervan te behouden.

Ultrasone apparaten voor DNA-fragmentatie

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende platforms op basis van ultrageluid voor DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie. Deze verschillende platforms omvatten ultrasone sondes (sonotrodes), indirecte sonicatieoplossingen voor de gelijktijdige monstervoorbereiding van meerdere buisjes of multi-well-platen (bijv. 96-well-platen, microtiterplaten), sonoreactoren en ultrasone koperen oortjes. Alle platforms voor DNA-scheiding worden aangedreven door frequentie-afgestemde, hoogwaardige ultrasone processoren, die nauwkeurig regelbaar zijn en reproduceerbare resultaten opleveren.

Ultrasone processoren voor elk aantal monsters en elke monstergrootte

Met Hielscher's multi-sample ultrasoonapparaten VialTweeter (voor maximaal 10 reageerbuisjes) en UIP400MTP (voor microtiterplaten/ multiwellplaten) wordt het eenvoudig mogelijk om de monsterverwerkingstijd te verkorten dankzij intense en nauwkeurig regelbare ultrasoonisering, terwijl de gewenste DNA-fragmentgrootteverdeling en opbrengst wordt verkregen. Ultrasone DNA-fragmentatie maakt de plasmidevoorbereidingsstappen efficiënt, betrouwbaar en schaalbaar. Protocollen kunnen lineair worden opgeschaald van één tot talrijke monsters door constante ultrasone parameters toe te passen.
Probe ultrasonicators with one to five fingers are ideal for the preparation of smaller sample numbers. Hielscher’s lab ultrasonicators are available with different power levels so that you can choose the ideal ultrasonic disruptor for your DNA-related application.

The VialTweeter is a MultiSample Ultrasonicator that allows for reliable sample preparation under precisely controlled temperature conditions.

De ultrasone multi-sample bereidingseenheid VialTweeter maakt het mogelijk om tot 10 flesjes tegelijk te soniseren. Met het clamp-on apparaat VialPress kunnen tot 4 extra buizen naar voren worden gedrukt voor intense sonicatie.

nauwkeurige procesbesturing

Hielscher ultrasoonapparaten kunnen op afstand worden bediend via browserbesturing. Sonicatieparameters kunnen worden bewaakt en nauwkeurig worden aangepast aan de procesvereisten.Nauwkeurig controleerbare sonicatie-instellingen zijn van cruciaal belang omdat uitputtende sonificatie DNA, RNA en chromatine kan vernietigen, maar onvoldoende ultrasone afschuiving resulteert in te lange DNA- en chromatinefragmenten. Hielscher's digitale ultrasoonapparaten kunnen eenvoudig worden ingesteld op nauwkeurige sonicatieparameters. Specifieke sonicatie-instellingen kunnen ook worden opgeslagen als geprogrammeerde instelling voor een snelle herhaling van dezelfde procedure.
Alle sonicaties worden automatisch geprotocolleerd en als CSV-bestand opgeslagen op een ingebouwde SD-kaart. Dit maakt een nauwkeurige documentatie van de uitgevoerde proeven mogelijk en maakt het mogelijk om sonicatiereeksen gemakkelijk te herzien.
Via browser-afstandsbediening kunnen alle digitale ultrasooninstallaties worden bediend en bewaakt via elke standaardbrowser. Installatie van extra software is niet nodig, aangezien de LAN-verbinding een zeer eenvoudige plug-n-play installatie is.

Hoogste gebruiksvriendelijkheid bij ultrasone DNA-voorbereiding

Alle Hielscher ultrasoonapparaten zijn ontworpen om ultrageluid van hoge kwaliteit te leveren, terwijl ze tegelijkertijd altijd zeer gebruiksvriendelijk en eenvoudig te bedienen zijn. Alle instellingen zijn goed gestructureerd in een duidelijk menu, dat gemakkelijk toegankelijk is via een gekleurd touch-display of browser-afstandsbediening. De slimme software met programmeerbare instellingen en automatische gegevensregistratie zorgt voor optimale sonicatie-instellingen voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten. De overzichtelijke en gebruiksvriendelijke menu-interface maken Hielscher ultrasoonapparaten tot gebruiksvriendelijke en efficiënte apparaten.
Onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasoonapparaten voor cellyse en DNA-fragmentatie:

batch Volume Stroomsnelheid Aanbevolen apparaten
multi-well platen n.v.t. UIP400MTP
flesjes, klein bekerglas n.v.t. ultrasone CupHorn
tot 10 flesjes n.v.t. VialTweeter
1 tot 500 ml 10 tot 200 ml / min UP100H
10 tot 2000 ml 20 tot 400 ml / min Uf200 ः t, UP400St

Neem contact met ons op! / Vraag ons!

Vraag voor meer informatie

Gebruik onderstaand formulier om aanvullende informatie aan te vragen over ultrasone homogenisatoren voor DNA-extractie en -fragmentatie, toepassingsprotocollen en prijzen. Wij zullen graag uw proces met u bespreken en u een ultrasoon systeem aanbieden dat aan uw eisen voldoet!









Let op onze Privacybeleid.




Literatuur / Referenties

Feiten die de moeite waard zijn om te weten

Wat zijn plasmiden?
Een plasmide is een kleine cirkelvormige DNA-molecule die fysiek gescheiden is van chromosomaal DNA en zich onafhankelijk repliceert. Plasmiden worden vaak geassocieerd met genen die bijdragen tot de overleving van een organisme en specifieke voordelen bieden, bv. antibioticaresistentie. Plasmiden worden meestal aangetroffen als kleine cirkelvormige, dubbelstrengs DNA-moleculen in bacteriën; plasmiden zijn echter soms aanwezig in archaea en eukaryote organismen. Plasmiden zijn belangrijke hulpmiddelen in de moleculaire biologie, de genetica, de biochemie en de biowetenschappen. Plasmiden, die in de genetische manipulatie vectoren worden genoemd, worden gebruikt om bepaalde genen te repliceren of tot expressie te brengen. De gerichte wijziging van een vector wordt vectorontwerp genoemd.

GFP-analyse in celonderzoek
Groen Fluorescerend Eiwit (GFP) is een veelzijdige biologische merker voor het monitoren van fysiologische processen, het visualiseren van eiwitlokalisatie en het detecteren van transgene expressie in vivo. GFP kan worden geëxciteerd door de 488 nm laserlijn en wordt optimaal gedetecteerd bij 510 nm.


Ultrasoon geluid met hoge prestaties! Hielscher's productassortiment bestrijkt het volledige spectrum van de compacte laboratorium ultrasoonmachine over bench-top units tot full-industriële ultrasoon systemen.

Hielscher Ultrasonics vervaardigt hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van Laboratorium naar industrieel formaat.