Ultrasone DNA-fragmentatie voor Next Gen Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) vereist het betrouwbaar knippen en fragmenteren van genomisch DNA om de strengen genomisch DNA te kunnen sequencen en genoombibliotheken te maken. De gecontroleerde fragmentatie van DNA in DNA-fragmenten is een essentiële stap in de monstervoorbereiding die nodig is voordat het DNA wordt gesequenced. Ultrasoon is een bewezen efficiënte en betrouwbare techniek voor DNA-fragmentatie van bepaalde lengte. Protocollen voor ultrasone DNA-fragmentatie bereiken reproduceerbare fragmentatieresultaten. Hielscher ultrasone apparaten zijn in staat om een breed scala aan verdelingen van de grootte van genomisch DNA-fragment te produceren, die nauwkeurig te regelen zijn via de bedrijfsparameters. Aangezien Hielscher ultrasone DNA-scheidingssystemen beschikbaar zijn voor enkelvoudige en meervoudige flacons en voor microtiterplaten, wordt de monstervoorbereiding zeer efficiënt.
De UIP400MTP plaat Sonicator voor high-throughput monstervoorbereiding sonificeert uniform monsters in multi-wells, microtiterplaten en 96-wells platen
- herhaalbare / reproduceerbare resultaten
- nauwkeurig instelbaar om een bepaalde fragmentlengte te verkrijgen
- Snelle verwerking
- consistente DNA-fragmentatieresultaten
- apparaten voor alle monstervolumes (bijvoorbeeld meerdere flesjes of microtiterplaten)
- hoge doorvoer
- nauwkeurige temperatuurregeling
- eenvoudige, gebruiksvriendelijke bediening
Next-Gen Sequencing: Ultrasone DNA-fragmentatie voor bibliotheekvoorbereiding
Om een Next-generation sequencing uit te voeren, moeten de drie basisstappen (1) bibliotheekvoorbereiding, (2) sequencing en (3) gegevensanalyse worden uitgevoerd. Tijdens bibliotheekpreparatie wordt DNA gefragmenteerd, vervolgens worden de fragmentuiteinden gerepareerd (gepolijst) door toevoeging van een enkele adenine base en worden de doelfragmenten omgezet in dubbelstrengs DNA. Ten slotte worden zogenaamde adapters bevestigd door ligatie, PCR of tagmentatie, zodat het uiteindelijke DNA-bibliotheekproduct kan worden gekwantificeerd voor sequentiebepaling.
DNA-fragmentatie met Sonicatie: Vooral bij shortread-sequencingtechnologieën zoals Illumina, die niet gemakkelijk langere DNA-fragmenten kunnen lezen, moeten de DNA-standaards tot een bepaalde grootte worden gefragmenteerd, wat betrouwbaar kan worden bereikt door ultrasoonbehandeling.
Ultrasoon kan betrouwbaar worden gebruikt voor fragmentatie van DNA, RNA en chromatine.
Next Gen sequencing – bibliotheekvoorbereiding
Ultrasone DNA-fragmentatie wordt vaak gebruikt bij de voorbereiding van DNA-sequentiebibliotheken voor NGS-platforms (next-generation sequencing). Deze techniek wordt gebruikt om DNA-moleculen te breken in kleinere fragmenten van een gewenste grootte, wat de volgende stappen in het bibliotheekpreparaat vergemakkelijkt. Ultrasone DNA-fragmentatie is meestal vereist tijdens de bibliotheekvoorbereidingsstap van NGS-workflows om genomisch DNA te fragmenteren in kleinere stukjes die geschikt zijn voor downstream verwerking en sequentiebepaling. Het speelt een cruciale rol bij het verzekeren van het succes van het sequentie-experiment door DNA-fragmenten te genereren met de juiste grootte voor het specifieke sequentieplatform dat wordt gebruikt.
Elektroforetische analyses van genomisch DNA van E. coli EDL933 onderworpen aan 0 - 15 minuten ultrasoon. L geeft de DNA-ladder aan. (Basselet et al. 2008)
Sequencing van de volgende generatie – Processtappen:
- Ultrasone DNA-fragmentatie: Voordat een bibliotheek wordt opgebouwd, wordt het genomisch DNA gefragmenteerd in kleinere, beter hanteerbare stukjes. Bij ultrasone fragmentatie worden geluidsgolven met een hoge frequentie gebruikt om de DNA-moleculen in fragmenten van de gewenste grootte te knippen. Deze stap is cruciaal omdat het ervoor zorgt dat de sequencinglezingen die later worden gegenereerd de juiste lengte hebben voor het sequencingplatform dat wordt gebruikt. Het groottebereik van de fragmenten kan worden aangepast op basis van de specifieke vereisten van het sequentie-experiment.
- Klonale amplificatie door PCR: Na ultrasone fragmentatie ondergaan de DNA-fragmenten eindreparatie, adapterligatie en PCR-amplificatie om de uiteindelijke DNA-sequentiebibliotheken te genereren. Deze stappen bereiden de gefragmenteerde DNA-moleculen voor op het sequencingproces door adaptersequenties toe te voegen die nodig zijn voor binding aan het sequencingplatform en priming sites te leveren voor PCR-amplificatie.
- DNA-sequentiebepaling door synthese: Zodra de sequentiebibliotheken zijn geprepareerd, begint het proces van DNA-sequentiebepaling door synthese (SBS). Tijdens SBS wordt de DNA-volgorde bepaald door de sequentiële toevoeging van nucleotiden aan de complementaire streng. Deze stap omvat cyclische reacties van nucleotide-inbouw, beeldvorming en splitsing, waardoor de DNA-volgorde kan worden bepaald op basis van de fluorescentiesignalen die door de geïncorporeerde nucleotiden worden uitgezonden.
- Massaal Parallel Sequencing: In de laatste stap worden de ruimtelijk gescheiden, geamplificeerde DNA-sjablonen tegelijkertijd op een massaal parallelle manier gesequenced. Deze high-throughput sequencing aanpak maakt het mogelijk om miljoenen tot miljarden sequencinglezingen te genereren in een enkele sequencerun, waardoor DNA-sequenties efficiënt en snel kunnen worden bepaald.
Hoe werkt ultrasone DNA-fragmentatie?
Sonificatie, ook bekend als akoestische monsterverwerking, is een veelgebruikte methode om DNA te fragmenteren. Bij ultrasoon DNA-scheren worden de monsters onder gecontroleerde omstandigheden blootgesteld aan ultrasone golven. Het werkingsprincipe van ultrasone DNA-fragmentatie is gebaseerd op de trillingen en cavitatie die worden opgewekt door de ultrasone golven. De schuifkrachten die het gevolg zijn van ultrasone (akoestische) cavitatie breken DNA-moleculen met een hoog molecuulgewicht. Door de instelling van de sonicatie, zoals intensiteit (amplitude, duur), pulsatiemodus en temperatuur, kan het DNA nauwkeurig gefragmenteerd worden tot een bepaalde gewenste lengte DNA-fragmenten. Terwijl DNA vaak wordt gereduceerd tot 100 tot 600 bp met behulp van ultrasone trillingen, kunnen langere DNA-fragmenten tot 1300 bp worden verkregen wanneer mildere ultrasone omstandigheden worden toegepast.
Ultrasoon DNA-schuiven tijdens ChIP – chromatine-immunoprecipitatie
Aangepast van Jkwchui onder CC-BY-SA.03
Temperatuurregeling om DNA-degradatie te voorkomen
De dubbelstrengs molecuulvorm van DNA is zeer gevoelig voor verhoogde temperaturen, zodat exacte controle over de temperatuur tijdens de stappen van monstervoorbereiding een cruciale factor is voor betrouwbare analyseresultaten.
Of u nu Hielscher's sonde-ultrasoneersystemen, de VialTweeter of de UIP400MTP gebruikt... – Dankzij een insteekbare temperatuursensor en de software van het slimme apparaat is continue temperatuurbewaking en -regeling gegarandeerd. Om de temperatuur binnen een bepaald bereik te houden, kunt u een boven- en ondergrens instellen. De ultrasoon zal dan pauzeren zodra deze temperatuurgrens wordt overschreden en automatisch doorgaan met soniceren zodra de temperatuur met een ingestelde ∆T is gedaald.
De geavanceerde software van de Hielscher ultrasoonapparaten zorgt ervoor dat de ideale omstandigheden voor monsterbehandeling betrouwbaar worden gehandhaafd.
DNA-fragmentatie van massamonsters met de UIP400MTP ultrasoonapparaat voor meerdere wells
Het aantal monsters in de biowetenschappen is de afgelopen tien jaar aanzienlijk toegenomen. Dit betekent dat zeer grote aantallen monsters (bijv. 384, 1536 of 3456 wells per microtiterplaat) verwerkt moeten worden tijdens monstervoorbereiding en analyse onder constant gelijke omstandigheden om vergelijkbare en geldige resultaten te verkrijgen. Met de UIP400MTP volgt Hielscher Ultrasonics de trend van massaproces van monsters. De UIP400MTP is een ultrasoonapparaat voor monstervoorbereiding met behulp van microtiterplaten. De UIP400MTP kan platen met 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 of 3456 wells verwerken. Afhankelijk van het type microtiterplaat kan elke well monstervolumes bevatten van tientallen nanoliters tot enkele milliliters. De UIP400MTP wordt veel gebruikt in biowetenschappelijk onderzoek voor monstervoorbereiding voorafgaand aan testen zoals ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) of PCR, voorafgaand aan eiwitanalyse, maar ook voor chromatinepreparatie voorafgaand aan CHiP en CHiP-seq, histonmodificatie-identificatie en andere analytische behandelingen (bijv. gelelektroforese, massaspectrometrie).
De VialTweeter voor monsterrepresentatie van maximaal 10 ampullen
De VialTweeter is een veelgebruikte laboratoriumultrasone VialTweeter waarmee tot 10 flacons tegelijkertijd effectief en comfortabel kunnen worden gesoneerd. Aangezien de flacons en reageerbuizen (bijv. Eppendorf flacons, cryoflacons, centrifugebuizen) indirect worden gesoneerd, wordt kruisbesmetting vermeden. Omdat aan elk monster dezelfde ultrasone intensiteit wordt toegediend, zijn alle sonificatieresultaten homogeen en reproduceerbaar. De VialTweeter biedt alle slimme functies zoals onze andere digitale apparaten (bijv. smart menu, programmeerbare instellingen, temperatuurregeling, afstandsbediening enz.
Multi-vingerprobes voor microwellplaten
De multi-vinger sondes met 4 of 8 vingers, die beschikbaar zijn voor de ultrasone sondehomogenisatoren UP200Ht en UP200St, zijn een comfortabele optie om meerdere monsters tegelijk te sonificeren onder dezelfde omstandigheden. De sonotrode MTP-24-8-96 bijvoorbeeld is een probe met acht vingers, die ideaal is voor integratie in geautomatiseerde systemen of voor efficiënte handmatige monstervoorbereiding van de wells van platen met meerdere wells. De multi-vinger sonotrode is ideaal voor geautomatiseerde laboratoria, waar meestal bekers en reageerbuizen worden verwerkt met een standaard ultrasone sonotrode. De multi-vinger- en standaardsonotrodes kunnen binnen enkele minuten snel worden verwisseld, waardoor de ultrasone sonotroder met één sonde verandert in een ultrasone sonotroder met meerdere sondes.
Hielscher ultrasone apparaten voor DNA-fragmentatie
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende ultrasone platforms voor DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie. Deze verschillende platforms omvatten ultrasone sondes (sonotrodes), indirecte sonicatieoplossingen voor de gelijktijdige monstervoorbereiding van meerdere buizen of platen met meerdere putjes (bijv. 96-wells platen, microtiterplaten), sonoreactoren en ultrasone koperen hoorns. Alle platforms voor het knippen van DNA worden aangedreven door op frequentie afgestemde, hoogwaardige ultrasone processors, die nauwkeurig regelbaar zijn en reproduceerbare resultaten leveren.
Ultrasone processors voor elk aantal monsters en elke grootte
Met Hielscher's multi-sample ultrasoonapparaten VialTweeter (voor maximaal 10 reageerbuizen) en UIP400MTP (voor microtiterplaten/multiwellplaten) wordt het eenvoudig mogelijk om de verwerkingstijd van monsters te verkorten door intense en nauwkeurig regelbare ultrasoonbehandeling, terwijl de gewenste DNA-fragmentgrootteverdeling en opbrengst wordt verkregen. Ultrasone DNA-fragmentatie maakt monstervoorbereiding efficiënt, betrouwbaar en schaalbaar. Protocollen kunnen lineair worden opgeschaald van één tot een groot aantal monsters door constant gecontroleerd ultrasoon geluid toe te passen.
Sonde-ultrasoneersystemen met één tot vijf vingers zijn ideaal voor de bereiding van kleinere aantallen monsters. Hielscher's laboratorium ultrasone apparaten zijn verkrijgbaar in verschillende maten, zodat we u het ideale apparaat voor uw toepassing en vereisten kunnen aanbevelen.
nauwkeurige procesbesturing
Nauwkeurig regelbare sonicatie-instellingen zijn cruciaal omdat uitputtende sonificatie DNA, RNA en chromatine kan vernietigen, maar onvoldoende ultrasone afschuiving resulteert in te lange DNA- en chromatinefragmenten. Hielscher's digitale ultrasoonapparaten kunnen eenvoudig worden ingesteld op nauwkeurige sonicatieparameters. Specifieke sonicatie-instellingen kunnen ook worden opgeslagen als geprogrammeerde instelling voor snelle herhaling van dezelfde procedure.
Alle sonicaties worden automatisch geprotocolleerd en opgeslagen als CSV-bestand op een ingebouwde SD-kaart. Dit zorgt voor nauwkeurige documentatie van uitgevoerde testen en maakt het mogelijk om sonicatieruns eenvoudig te reviseren.
Met de browser-afstandsbediening kunnen alle digitale ultrasone apparaten worden bediend en gecontroleerd via elke standaardbrowser. Installatie van extra software is niet nodig, omdat een LAN-verbinding een zeer eenvoudige plug-n-play installatie mogelijk maakt.
Hoogste gebruiksvriendelijkheid in ultrasone monstervoorbereiding
Alle Hielscher ultrasoonapparaten zijn ontworpen om ultrasoon geluid met hoge prestaties te leveren, maar zijn tegelijkertijd altijd zeer gebruiksvriendelijk en eenvoudig te bedienen. Alle instellingen zijn goed gestructureerd in een duidelijk menu, dat eenvoudig toegankelijk is via het gekleurde touch-display of de browser-afstandsbediening. De slimme software met programmeerbare instellingen en automatische gegevensregistratie zorgt voor optimale sonicatie-instellingen voor betrouwbare en reproduceerbare resultaten. De duidelijke en gebruiksvriendelijke menu-interface maakt van de Hielscher ultrasoonapparaten gebruiksvriendelijke en efficiënte apparaten.
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone laboratoriumapparaten, die ideaal zijn voor monstervoorbereidingstaken zoals DNA- en RNA-fragmentatie, cellyse en eiwitextractie:
| Apparaat | Vermogen [W] | Type | Volume [mL] |
|---|---|---|---|
| UIP400MTP | 400 | voor microtiterplaten | 6 – 3456 putten | VialTweeter | 200 | voor maximaal 10 flesjes plus klemmogelijkheid | 0.5 – 1.5 |
| UP50H | 50 | sonde-type | 0.01 – 250 |
| UP100H | 100 | sonde-type | 0.01 – 500 |
| UP200Ht | 200 | sonde-type | 0.1 – 1000 |
| UP200St | 200 | sonde-type | 0.1 – 1000 |
| UP400St | 400 | sonde-type | 5.0 – 2000 |
| kopshoorn | 200 | CupHorn, sonoreactor | 10 – 200 |
| GDmini2 | 200 | verontreinigingsvrije doorstroomcel |
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
De ultrasone multi-monstervoorbereidingseenheid VialTweeter maakt gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 vials mogelijk. Met het clamp-on apparaat VialPress kunnen tot 4 extra buisjes naar voren worden gedrukt voor intense sonicatie.
De sonotrode MTP-24-8-96 heeft acht ultrasone sondes voor de sonicatie van de wells van microtiterplaten.
Literatuur / Referenties
- Poptsova, M., Il’icheva, I., Nechipurenko, D. et al. (2014): Non-random DNA fragmentation in next-generation sequencing. Scientific Reports 4, 4532; 2014.
- Basselet P., Wegrzyn G., Enfors S.-O., Gabig-Ciminska M. (2008): Sample processing for DNA chip array-based analysis of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC). Microbial Cell Factories 7:29. 2008.
- Doublier S., Riganti Ch., Voena C., Costamagna C., Aldieri E., Pescarmona G., Ghigo D., Bosia A. (008): RhoA Silencing Reverts the Resistance to Doxorubicin in Human Colon Cancer Cells. Molecular Cancer Research 6(10), 2008.
- Fredlund E., Gidlund A., Olsen M., Börjesson T., Spliid N.H.H., Simonsson M. (2008): Method evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR quantification and correlation to mycotoxin levels. Journal of Microbiological Methods 2008.
- Fritsche C., Sitz M., Weiland N., Breitling R., Pohl H.-D. (2007): Characterization of the growth behavior of Leishmania tarentolae – a new expression system for recombinant proteins. Journal of Basic Microbiology 47, 2007. 384–393.
- Ristola M., Arpiainen S., Saleem M. A., Mathieson P. W., Welsh G. I., Lehtonen S., Holthöfer H. (2009): Regulation of Neph3 gene in podocytes – key roles of transcription factors NF-κB and Sp1. BMC Molecular Biology 10:83, 2009.
- Rodriguez J., Vives L., Jorda M., Morales C., Munoz M., Vendrell E., Peinado M. A. (2008): Genome-wide tracking of unmethylated DNA Alu repeats in normal and cancer cells. Nucleic Acids Research Vol. 36, No. 3, 2008. 770-784.
- Weiske J. Huber O. (2006): The Histidine Triad Protein Hint1 Triggers Apoptosis Independent of Its Enzymatic Activity. The Journal of Biological chemistry. Vol. 281, No. 37, 2006. 27356–27366.
Wetenswaardigheden
Wat is Next Generation Sequencing?
Next-generation sequencing, ook wel Next Gen Sequencing (NGS), high-throughput sequencing of tweede generatie sequencing, verwijst naar de aanpak van massale parallelle sequencing, waarbij zeer grote (massieve) hoeveelheden DNA van miljoenen fragmenten tegelijkertijd parallel per run worden gesequenced.
Om een Next-generation sequencing uit te voeren, zijn de drie basisstappen van
- bibliotheekvoorbereiding,
- opeenvolging en
- gegevensanalyse
zijn vereist.
Tijdens de bibliotheekbereiding moeten DNA-strengen worden gefragmenteerd in DNA-fragmenten van een bepaalde lengte. Sonificatie is een van de voorkeurstechnieken om DNA te fragmenteren.
Tijdens het proces van DNA-sequentiebepaling wordt de volgorde van nucleotiden in DNA – bekend als nucleïnezuursequentie - wordt bepaald. De nucleïnezuursequentie bestaat uit vier nucleotidebasen: adenine, cytosine, guanine en thymine. – welke code voor informatie.
Next-generation sequencing is een drijvende kracht achter het onderzoek in de biowetenschappen en gepersonaliseerde geneeskunde, aangezien DNA- en RNA-sequencing intensief worden gebruikt in genomisch onderzoek, kankeronderzoek, onderzoek naar zeldzame en complexe ziekten, microbieel onderzoek, agrigenomica en vele andere onderzoeksgebieden.
Next Generation Sequencing vs Sanger Sequencing
Terwijl het met Next Generation Sequencing (NGS) mogelijk is om enorme aantallen genomische monsters te sequencen, kan met Sanger Sequencing (ook bekend als ketenbeëindigingsmethode of Eerste Generatie Sequencing) alleen een klein aantal monsters gesequeneerd worden. Sanger sequencing sequentiëert slechts een enkel DNA-fragment tegelijk en kan in één dag worden uitgevoerd. Vanwege de nauwkeurigheid wordt sequencing met Sanger ook beschouwd als de gouden standaardtechnologie, die wordt gebruikt om resultaten te verifiëren die zijn verkregen met Next Generation Sequencing.
Sanger sequencing bereikt leeslengtes van ongeveer 800 bp (meestal 500-600 bp met niet-verrijkt DNA). De langere leeslengtes bij sequencing met Sanger bieden aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere sequencingmethoden, vooral als het gaat om het sequencen van repetitieve gebieden van het genoom. De uitdaging van sequentiegegevens met een korte leeslengte is met name een probleem bij het sequencen van nieuwe genomen (de novo) en bij het sequencen van sterk herschikte genoomsegmenten, die typisch voorkomen in kankergenomen of in regio's van chromosomen die structurele variatie vertonen. [cp. Morozova en Marra, 2008]
DNA – Desoxyribonucleïnezuur – Vormen en functies
Elke vorm van DNA heeft unieke kenmerken en toepassingen en draagt bij aan een breed spectrum van onderzoeksgebieden, waaronder oncologie, genetica, forensische wetenschap en evolutiebiologie. Hielscher sonicators zijn een zeer efficiënte en betrouwbare oplossing voor het isoleren en fragmenteren van DNA en RNA voor uw analysedoeleinden. In de onderstaande lijst leggen we de specifieke vormen van DNA uit en categoriseren we ze op basis van hun biologische context en functies:
- Genomisch DNA (gDNA)
Genomisch DNA (gDNA): De volledige set DNA in een organisme, met zowel coderende (genen) als niet-coderende gebieden. - Extracellulair DNA
Circulerend Tumor DNA (ctDNA): Fragmenten DNA die door tumorcellen in de bloedbaan worden vrijgelaten.
Celvrij DNA (cfDNA): DNA-fragmenten die vrij circuleren in de bloedbaan en afkomstig zijn van verschillende weefsels. - Extrachromosomaal Circulair DNA (eccDNA): Ronde DNA-moleculen buiten de chromosomen in eukaryote cellen.
Viraal DNA: DNA afkomstig van virussen, geïntegreerd in het genoom van de gastheer of als episomaal DNA. - mitochondriaal DNA
Mitochondriaal DNA (mtDNA): DNA in de mitochondriën, van de moeder geërfd en betrokken bij de energieproductie. - plasmide DNA
Plasmide DNA: Kleine, cirkelvormige DNA-moleculen die onafhankelijk van het chromosomale DNA repliceren, vaak aangetroffen in bacteriën en gebruikt bij genetische manipulatie. - kern-DNA
Nucleair DNA (nDNA): DNA dat zich in de kern van eukaryote cellen bevindt en het grootste deel van het genetisch materiaal in een organisme bevat. - DNA van één cel
Single-Cell DNA (scDNA): DNA geëxtraheerd uit een enkele cel, gebruikt voor gedetailleerde genoomanalyse op individueel celniveau. - Recombinant DNA
Recombinant DNA (rDNA): DNA-moleculen gevormd door laboratoriummethoden van genetische recombinatie om genetisch materiaal van meerdere bronnen samen te brengen. - Gespecialiseerde formulieren
Omgevings-DNA (eDNA): DNA verzameld uit milieumonsters (bodem, water) zonder de bronorganismen te isoleren
Ancient DNA (aDNA): DNA uit oude specimens, dat inzicht geeft in evolutionaire biologie en oude populaties. - Chromosomaal DNA
Chromosomaal DNA: DNA dat de chromosomen in de celkern vormt en zowel coderende als niet-coderende gebieden omvat. - Virale en synthetische vormen
Viraal DNA: DNA afkomstig van virussen, die ofwel geïntegreerd kunnen zijn in het genoom van een gastheer of als onafhankelijke entiteiten kunnen bestaan.
Synthetisch DNA: Kunstmatig gesynthetiseerde DNA-sequenties die door middel van chemische processen zijn gemaakt en vaak worden gebruikt in onderzoek en biotechnologie.
Hielscher Ultrasonics produceert hoogwaardige ultrasone homogenisatoren van lab naar industrieel formaat.