Ultrasone Lyse van Drosophila melanogaster monsters

Drosophila melanogaster wordt veel gebruikt in laboratoria als modelorganisme. Daarom moeten preanalytische bereidingsstappen zoals lysis, celdisruptie, eiwitextractie en DNA-scheren van Drosophila melanogaster monsters vaak worden uitgevoerd. Ultrasone dismembrators zijn betrouwbaar en efficiënt en kunnen worden gebruikt om verschillende taken zoals lysis, eiwitextractie of DNA-fragmentatie op hun gemak uit te voeren door alleen de ultrasone procesparameters aan te passen. Ultrasone homogenisatoren zijn daardoor flexibele hulpmiddelen met een breed scala aan toepassingen.

Ultrasone Lyse en Proteïne-extractie

Lyse, celsolubilisatie, weefselhomogenisatie en eiwitextractie zijn typische taken voor ultrasone ontleders in biologische laboratoria. Ultrasone dismembrators en celvernietigers zijn zeer geschikt voor het homogeniseren van dierlijk weefsel, insecten (bijv. Drosophila melanogaster, C. elegans) of plantenspecimens. Latere toepassingen van ultrasonicatie zijn de lysis van celsuspensies en -pellets en de extractie van intracellulaire eiwitten.
Ultrasone lyse en eiwitextractie zijn zeer betrouwbare en reproduceerbare processen, die kunnen worden uitgevoerd op basis van vastgestelde protocollen. Aangezien de ultrasone procesintensiteit exact kan worden aangepast via sonicatieparameters zoals amplitude, cyclus-/pulsmodus, temperatuur en monstervolume, kunnen eenmaal beproefde protocollen steeds opnieuw worden herhaald met hetzelfde resultaat.

Ultrasoon DNA en RNA-fragmentatie

Na cellyse en eiwitextractie is het afschuiven en fragmenteren van DNA, RNA en chromatine, bijvoorbeeld voor chromatine immunoprecipitatie (ChIP), een veelvoorkomende vereiste stap in de monstervoorbereiding. DNA- en RNA-fragmentatie kan op betrouwbare wijze worden bereikt door het breken van de covalente bindingen die het DNA bij elkaar houden door fysieke krachten. Met behulp van fysieke afschuiving zoals sonicatie worden eerst de DNA-strengen gebroken, waarna het DNA in kleinere stukjes wordt gefragmenteerd.
Ultrasoon DNA-fragmentatie is betrouwbaar en efficiënt in het afschuiven van DNA op een gerichte lengte, bijvoorbeeld 500bp (basenparen). De grote voordelen van ultrasoon DNA-fragmentatie zijn onder andere de nauwkeurige controle van de ultrasone procesparameters en de intensiteit. De ultrasone procesparameters kunnen worden aangepast door de intensiteit, de cycli en de tijd van de sonatie nauwkeurig af te stemmen. Dit maakt het mogelijk om de gewenste DNA-grootte te creëren en de beoogde DNA-lengte kan op betrouwbare wijze worden geproduceerd en gereproduceerd. Ultrasoon DNA-scheren is ook ideaal om DNA-fragmenten met een hoog moleculair gewicht te creëren.

Protocollen voor Ultrasone Lyse van Drosophila melanogaster

Hieronder vindt u verschillende protocollen voor de ultrasoon geassisteerde lyse, eiwitextractie en DNA- of chromatinefragmentatie van Drosophila-monsters.

Ultrasone Lyse voor Kruisverbindingsimmunoprecipitatie (CLIP) Assay

De CLIP-test werd uitgevoerd zoals eerder gemeld, met enkele aanpassingen. Ongeveer 20 mg eierstokken van 0 tot 1 dag oude wild-type vrouwen werden UV-crosslinked (3 × 2000 uJ / cm2), gehomogeniseerd op ijs in 1 ml RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2.5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1 x EDTA-vrij Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) aangevuld met 300 U RNAseOUT en geplaatst op ijs gedurende 30 minuten. Het homogenaat werd op ijs gezongen, bij 80% vermogen, vijf keer in 20 s barstte met een 60 s rust tussendoor met behulp van de Hielscher Ultrasonic Processor. UP100H (100 W, 30 kHz) en gecentrifugeerd (16000 × g gedurende 5 minuten bij 4°C). Oplosbaar extract werd geprepareerd met 20 ul Eiwit-G-dynabeads gedurende 20 min bij 4 ° C. Na verwijdering van de monsters voor immunoblotting en kwantificering van RNA-input (1%) werd HP1 immunoprecipitaat met anti-HP1 9A9-antilichaam van 450 μl geprepareerd extract door incubatie gedurende 4 uur met 50 μl Eiwit-G-dynabeads. Immunoprecipitaten werden 4 keer gewassen met RCB. Om de immunogeprecipiteerde RNA's te elueren, werden de pelletkorrels gekookt in 100 μl met UltraPure DEPC behandeld water gedurende 5 min. 900 μl Qiazol Reagens werd toegevoegd aan het supernatant hersteld voor RNA-preparatie. De RNA gezuiverd werd gebruikt als een sjabloon om cDNA te synthetiseren met behulp van oligo dT, willekeurige hexameren en SuperScript reverse transcriptase III volgens het protocol van de fabrikant.
(Cassale et al. 2019)

Ultrasone Lyse voor Chromatine Immunoprecipitatie Assay

Chromatine immunoprecipitatie werd uitgevoerd volgens de door Menet beschreven methode met kleine aanpassingen. Ongeveer 20 mg eierstokken van 0- tot 1-daagse wild-type vrouwen werden gehomogeniseerd in 1 mL NEB-buffer (10 mM HEPES-Na bij pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bij pH 8, 0.5 mM EDTA-Na bij pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermidine, 1× EDTA-vrij Complete Protease Inhibitors) met een homogenisator / onderdompelingsspreider 1 min (bij 3000 rpm). Het homogenaat werd overgebracht naar een voorgekoelde glasdounce en 15 volle slagen werden aangebracht met een strakke stamper. De vrije kernen werden vervolgens gecentrifugeerd bij 6000xg gedurende 10 minuten bij 4°C. De kernen-bevattende pellets werden geresuspendeerd in 1 mL NEB en gecentrifugeerd bij 20000 × g gedurende 20 min op sacharose gradiënt (0,65 mL van 1,6 M sacharose in NEB, 0,35 mL van 0,8 M sacharose in NEB). De pellet werd geresuspendeerd in 1 mL NEB en formaldehyde tot een eindconcentratie van 1%. De kernen werden vernet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en gedoofd door toevoeging van 1/10 vol van 1,375 M glycine. De kernen werden verzameld door middel van centrifugatie bij 6000 × g gedurende 5 min. Nucleaire werden twee keer gewassen in 1 mL NEB en geresuspendeerd in 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na bij pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bij pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholate, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine en 1 × EDTA-vrij Complete Protease Inhibitors). Nuclei werden gesoneerd met behulp van een Hielscher Ultrasone Processor UP100H (100 W, 30 kHz) zes keer voor 20 s op en 1 min op ijs. Sonische kernen werden gecentrifugeerd bij 13000 × g gedurende 4 minuten bij 4°C. Het merendeel van de sonische chromatine was 500 tot 1000 basenparen (bp) lang. Voor elke immunoprecipitatie werd 15 μg chromatine geïncubeerd in aanwezigheid van 10 μg HP1 9A9 monoklonaal antilichaam (3 uur bij 4 ° C in een draaiend wiel). Vervolgens werd 50 μl dynabeads eiwit G toegevoegd en de incubatie werd voortgezet gedurende de nacht bij 4 ° C. De supernatanten werden weggegooid en de monsters werden tweemaal gewassen in Lysis Buffer (elk wassen 15 min bij 4 ° C) en tweemaal in TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bij pH 8). Chromatine werd geëlueerd uit korrels in twee stappen, eerst in 100 ul Eluition Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bij pH 8) bij 65 ° C gedurende 15 min, gevolgd door centrifugeren en het herstel van het supernatans. Kralenmateriaal werd opnieuw geëxtraheerd in 100 μl TE + 0,67% SDS. De gecombineerde eluaat (200 ul) werd geïncubeerd overnacht bij 65 ° C om de crosslinks om te keren en behandeld met 50 ug / ml RNaseA gedurende 15 min bij 65 ° C en met 500 ug / ml Proteinase K gedurende 3 uur bij 65 ° C. De monsters werden fenol-chloroform geëxtraheerd en de ethanol werd neergeslagen. Het DNA werd geresuspendeerd in 25 μl water. Voor het maximaliseren van de moleculaire analyses met DNA immunogeprecipiteerd, werden kandidaat-genen geamplificeerd in paren door middel van een geoptimaliseerde duplex-PCR-protocol met behulp van twee verschillende sets van primers met vergelijkbare smelttemperaturen in een enkele reactie.
(Casale et al. 2019)

Hoogwaardige ultrasone celverstoorders voor biologische monsters

Hielscher Ultrasonics is uw lang ervaren partner als het gaat om hoogwaardige ultrasonicatoren voor celverstoring, lysis, eiwitextractie, DNA, RNA en chromatinefragmentatie en andere pre-analytische monstervoorbereidingsstappen. Met een uitgebreid portfolio van ultrasone laboratoriumhomogenisatoren en monstervoorbereidingsapparaten heeft Hielscher het ideale ultrasone apparaat voor uw biologische toepassing en eisen.
Klassieke sonde-type ultrasonicator met micro-tip zoals de UP200St (200W; zie foto links) of een van de ultrasone monstervoorbereidingseenheden VialTweeter of UP200St_TD_CupHorn met VialHolder zijn favoriete modellen in onderzoeks- en analyselaboratoria. De klassieke ultrasone sonde is ideaal, wanneer er minder monsters moeten worden gelyseerd, geëxtraheerd of gefragmenteerd. De monstervoorbereidingseenheden VialTweeter en UP200St_TD_CupHorn maken het mogelijk om gelijktijdig tot 10 respectievelijk 5 flacons te soniseren.
Als er hoge monsteraantallen (bv. 96-wellsplaten, microtiterplaten enz.) moeten worden verwerkt, worden de UIP400MTP is de ideale sonische opstelling. De UIP400MTP werkt als een grotere cuphorn, die gevuld is met water en genoeg ruimte heeft om micro-wellschijven vast te houden. Aangedreven door een 400 watt krachtige ultrasone processor, levert de UIP400MTP een zeer gelijkmatige en intense sonicatie van multi-well platen om cellen te verstoren, monsters te lyseren, pellets op te lossen, proteïnen te extraheren of DNA af te scheren.

Nauwkeurige controle via slimme software

Alle Hielscher sonication-oplossingen vanaf 200 watt zijn uitgerust met een digitaal kleuren-touchscreen en een intelligente software. Via de slimme dataprotocollering worden alle ultrasone procesparameters automatisch als CSV-bestand opgeslagen op een ingebouwde SD-kaart zodra de ultrasonicator wordt opgestart. Dit maakt onderzoek en protocollering zo veel gemakkelijker. Na de sonicatieproeven of monstervoorbereiding kunt u eenvoudig de sonicatieparameters van elke sonicatierun bekijken en vergelijken.
Via het intuïtieve menu kunnen tal van parameters vooraf worden ingesteld: Om bijvoorbeeld de temperatuur in het monster te regelen en de thermische degradatie ervan te voorkomen, kan een bovengrens voor de temperatuur van het monster worden ingesteld. Een insteekbare temperatuursensor, die bij de ultrasone eenheid wordt geleverd, geeft de ultrasone processor feedback over de werkelijke sonische temperatuur. Wanneer de bovenste temperatuurlimiet is bereikt, pauzeert het ultrasoonapparaat tot de ondergrens van de ingestelde ∆T is bereikt en begint dan automatisch weer te sonischen.
Als er sonar met een specifieke energie-input nodig is, kunt u de uiteindelijke ultrasone energie van de sonicatierun vooraf instellen. Natuurlijk kunnen ook de ultrasone pulsatie- en cyclusmodus individueel worden ingesteld.
Om uw meest succesvolle sonicatieparameters opnieuw te gebruiken, kunt u verschillende sonicatiemodi (bijv. sonicatietijd, intensiteit, cyclusmodus enz.) opslaan als vooraf ingestelde modi, zodat ze gemakkelijk en snel opnieuw kunnen worden gestart.
Voor meer bedieningsgemak kunnen alle digitale ultrasone apparaten worden bediend via de browserafstandsbediening in elke gangbare browser (bijv. InternetExplorer, Safari, Chrome, enz.). De LAN-verbinding is een eenvoudige plug-n-play setup en vereist geen extra software-installatie.
Bij Hielscher weten we dat het succesvol soneren van biologische monsters precisie en herhaalbaarheid vereist. Daarom hebben we onze ultrasonicatoren ontworpen als slimme apparaten met alle functies die een efficiënte, betrouwbare, reproduceerbare en gemakkelijke monstervoorbereiding mogelijk maken.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van ultrasone microtips en klassieke ultrasone homogenisatoren tot MultiSample ultrasonicators voor de handige, betrouwbare voorbereiding van talrijke monsters: