Ultrasone lyse van monsters van Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster wordt in laboratoria veel gebruikt als modelorganisme. Daarom moeten pre-analytische voorbereidingsstappen zoals lysis, celdisruptie, eiwitextractie en DNA-fragmentatie van Drosophila melanogaster-monsters vaak worden uitgevoerd. Ultrasone ontmengers zijn betrouwbaar en efficiënt en kunnen worden gebruikt om verschillende taken zoals lysis, eiwitextractie of DNA-fragmentatie uit te voeren door alleen de ultrasone procesparameters aan te passen. Ultrasone homogenisatoren zijn daardoor flexibele instrumenten met een breed scala aan toepassingen.

Ultrasone lysis en eiwitextractie

Lysis, celsolubilisatie, weefselhomogenisatie en eiwitextractie zijn typische taken voor ultrasone ontmengers in biologische laboratoria. Ultrasone ontmengers en celverstoorders zijn zeer geschikt voor het homogeniseren van dierlijke weefsels, insecten (bijv. Drosophila melanogaster, C. elegans) of plantenspecimens. Latere toepassingen van ultrasoon zijn de lysis van celsuspensies en -pellets en de extractie van intracellulaire eiwitten.
Ultrasone lysis en eiwitextractie zijn zeer betrouwbare en reproduceerbare processen, die kunnen worden uitgevoerd op basis van vastgestelde protocollen. Aangezien de intensiteit van het ultrasone proces exact kan worden aangepast via sonicatieparameters zoals amplitude, cyclus/pulsmodus, temperatuur en monstervolume, kunnen eenmaal bewezen protocollen keer op keer worden herhaald met hetzelfde resultaat.

Ultrasone DNA- en RNA-fragmentatie

Na cellyse en eiwitextractie is een veelvoorkomende vereiste stap in monstervoorbereiding het afschuiven en fragmenteren van DNA, RNA en chromatine, bijvoorbeeld voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). DNA en RNA fragmentatie kan betrouwbaar worden bereikt door het breken van de covalente bindingen die het DNA bij elkaar houden door fysieke krachten. Met behulp van fysieke afschuiving, zoals sonicatie, worden eerst de DNA-strengen gebroken, waarna het DNA in kleinere stukjes wordt gefragmenteerd.
Ultrasone DNA-fragmentatie is betrouwbaar en efficiënt in het afschuiven van DNA tot een bepaalde lengte, bijvoorbeeld 500 bp (basenparen). De belangrijkste voordelen van ultrasone DNA-fragmentatie zijn de nauwkeurige regeling van de ultrasone procesparameters en intensiteit. De ultrasone procesparameters kunnen worden aangepast door de sonicatie-intensiteit, cycli en tijd nauwkeurig af te stellen. Dit maakt het mogelijk om gewenste DNA-groottes te creëren en de beoogde DNA-lengte kan betrouwbaar worden geproduceerd en gereproduceerd. Ultrasoon DNA-scheren is ook ideaal om DNA-fragmenten met een hoog molecuulgewicht te maken.

Protocollen voor ultrasone lysis van Drosophila melanogaster

Hieronder vindt u verschillende protocollen voor de ultrasoon ondersteunde lysis, eiwitextractie en DNA- of chromatinefragmentatie van Drosophila monsters.

Ultrasone lysis voor CLIP-analyse (Cross-linking Immunoprecipitation)

CLIP-test werd uitgevoerd zoals eerder gemeld met enkele wijzigingen. Ongeveer 20 mg eierstokken van 0 tot 1 dag oude wild-type vrouwtjes werden UV-gecrosslinked (3 × 2000 μJ/cm2), gehomogeniseerd op ijs in 1 mL RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2. MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-vrije Complete Complete Complete Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-vrije Complete Triton X-100).5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1 × EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF) aangevuld met 300 U RNAseOUT en gedurende 30 minuten op ijs geplaatst. Het homogenaat werd op ijs, bij 80% vermogen, vijfmaal gesoneerd in uitbarstingen van 20 seconden met 60 seconden rust ertussen met de Hielscher Ultrasone Processor. UP100H (100 W, 30 kHz) en gecentrifugeerd (16000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Oplosbaar extract werd voorgereinigd met 20 pi Protein-G dynabeads gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Na verwijdering van monsters voor immunoblotting en kwantificering van RNA input (1%), werd HP1 immuno geprecipiteerd met anti-HP1 9A9 antilichaam van 450 pi voorgereinigd extract door incubatie gedurende 4 uur met 50 pi Protein-G dynabeads. Immunoprecipitaten werden 4 keer gewassen met RCB. Om de immunogeprecipiteerde RNA's elueren, werden de gepelleteerde kralen gekookt in 100 pi UltraPure DEPC behandeld water gedurende 5 minuten. 900 pi Qiazol Reagent werd toegevoegd aan het supernatant teruggewonnen voor RNA voorbereiding. Het gezuiverde RNA werd gebruikt als sjabloon voor de synthese van cDNA met oligo dT, willekeurige hexameren en SuperScript reverse transcriptase III volgens het protocol van de fabrikant.
(Cassale et al. 2019)

Ultrasone lysis voor chromatine-immunoprecipitatie-analyse

Chromatine immunoprecipitatie werd uitgevoerd volgens de methode beschreven door Menet met kleine modificaties. 5 mM EDTA-Na bij pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM Spermidine, 0,15 mM Spermine, 1× EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors) met een homogenisator / immersie-dispergeerapparaat 1 min (bij 3000 rpm). Het homogenaat werd overgebracht naar een voorgekoelde glazen dounce en 15 volledige slagen werden toegepast met een strakke stamper. Vrije kernen werden vervolgens gecentrifugeerd bij 6000xg gedurende 10 minuten bij 4°C. De kernen bevattende pellets werden geresuspendeerd in 1 mL NEB en gecentrifugeerd bij 20000 × g gedurende 20 min op sacharosegradiënt (0,65 mL 1,6 M sacharose in NEB, 0,35 mL 0,8 M sacharose in NEB). De pellet werd geresuspendeerd in 1 ml NEB en formaldehyde tot een eindconcentratie van 1%. De kernen werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur verknoopt en afgekoeld door 1/10 volume 1,375 M glycine toe te voegen. De kernen werden verzameld door centrifugatie bij 6000 × g gedurende 5 minuten. De kernen werden tweemaal gewassen in 1 mL NEB en geresuspendeerd in 1 mL Lysis Buffer (15 mM HEPES-Na bij pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bij pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na Deoxycholaat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine en 1× EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors). Nuclei werden gesoniseerd met behulp van een Hielscher Ultrasone Processor UP100H (100 W, 30 kHz) zes keer gedurende 20 s op en 1 min op ijs. De gesoniseerde kernen werden gecentrifugeerd bij 13000 × g gedurende 4 minuten bij 4 °C. Het grootste deel van de gesoniseerde chromatine was 500 tot 1000 basenparen (bp) in lengte. Voor elke immunoprecipitatie werd 15 ug chromatine geïncubeerd in aanwezigheid van 10 ug HP1 9A9 monoklonaal antilichaam (3 uur bij 4 ° C in een draaiend wiel). Vervolgens werd 50 pi dynabeads proteïne G toegevoegd en werd de incubatie een nacht bij 4 °C voortgezet. De supernatanten werden weggegooid en de monsters werden tweemaal gewassen in Lysis Buffer (elke wasbeurt 15 min bij 4 °C) en tweemaal in TE Buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bij pH 8). Chromatine werd geëlueerd uit kralen in twee stappen, eerst in 100 ul van Eluitie Buffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bij pH 8) bij 65 ° C gedurende 15 minuten, gevolgd door centrifugeren en herstel van het supernatant. Kralen materiaal werd opnieuw geëxtraheerd in 100 pi TE + 0,67% SDS. Het gecombineerde eluaat (200 pi) werd overnacht geïncubeerd bij 65 ° C tot cross-links omkeren en behandeld met 50 ug / ml RNaseA gedurende 15 minuten bij 65 ° C en door 500 ug / ml Proteïnase K gedurende 3 uur bij 65 ° C. De monsters werden met fenol-chloroform geëxtraheerd en met ethanol geprecipiteerd. DNA werd geresuspendeerd in 25 μl water. Om de moleculaire analyses met immunogeprecipiteerd DNA te maximaliseren, werden kandidaatgenen in paren geamplificeerd via een geoptimaliseerd duplex-PCR-protocol door twee verschillende sets primers met vergelijkbare smelttemperaturen in één reactie te gebruiken.
(Casale et al. 2019)
 

Ultrasone celverstoorders met hoge prestaties voor biologische monsters

Hielscher Ultrasonics is uw ervaren partner als het gaat om hoogwaardige ultrasone apparaten voor celdisruptie, lysis, eiwitextractie, DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie en andere pre-analytische monstervoorbereidingsstappen. Hielscher biedt een uitgebreid assortiment ultrasone laboratoriumhomogenisatoren en monstervoorbereidingseenheden en heeft het ideale ultrasone apparaat voor uw biologische toepassing en vereisten.
Klassieke ultrasone sonde met microtip zoals de UP200St (200 W; zie foto links) of een van de ultrasone monstervoorbereidingseenheden VialTweeter of UP200St_TD_CupHorn met VialHolder zijn favoriete modellen in onderzoeks- en analyselaboratoria. De klassieke ultrasone sonde is ideaal wanneer er minder monsters moeten worden gelyseerd, geëxtraheerd of gefragmenteerd. De monstervoorbereidingseenheden VialTweeter en UP200St_TD_CupHorn maken de gelijktijdige sonicatie van respectievelijk 10 of 5 vials mogelijk.
Als er grote aantallen monsters (bijv. 96-well platen, microtiterplaten etc.) verwerkt moeten worden, is de UIP400MTP is de ideale sonicatieopstelling. De UIP400MTP functioneert als een grotere bekerhoorn, die gevuld is met water en voldoende ruimte biedt voor micro-well platen. Aangedreven door een krachtige ultrasone processor van 400 watt levert de UIP400MTP een zeer gelijkmatige en intense sonicatie van platen met meerdere putjes om cellen te verstoren, monsters te lyseren, pellets op te lossen, eiwitten te extraheren of DNA af te schuiven.

Nauwkeurige besturing via slimme software

Alle Hielscher ultrasoonoplossingen vanaf 200 watt zijn uitgerust met een digitaal kleurentouchscreen en intelligente software. Via de slimme dataprotocollering worden alle ultrasoonprocesparameters automatisch opgeslagen als CSV-bestand op een ingebouwde SD-kaart zodra de ultrasoon wordt gestart. Dit maakt onderzoek en protocollering veel handiger. Na de sonicatietests of monstervoorbereiding kunt u eenvoudig de sonicatieparameters van elke sonicatierun bekijken en vergelijken.
Via het intuïtieve menu kunnen tal van parameters worden ingesteld voordat de sonicatie begint: Om bijvoorbeeld de temperatuur in het monster te controleren en thermische degradatie te voorkomen, kan een bovengrens voor de monstertemperatuur worden ingesteld. Een insteekbare temperatuursensor, die bij het ultrasone apparaat wordt geleverd, geeft de ultrasone processor feedback over de actuele sonificatietemperatuur. Wanneer de bovenste temperatuurgrens is bereikt, pauzeert het ultrasone apparaat totdat de onderste grens van de ingestelde ∆T is bereikt en begint dan automatisch opnieuw te sonificeren.
Als sonicatie met een specifieke energie-input vereist is, kunt u de uiteindelijke ultrasone energie van de sonicatierun vooraf instellen. Natuurlijk kunnen ook de ultrasone pulsatie en cyclusmodus individueel worden ingesteld.
Om uw meest succesvolle sonicatieparameters opnieuw te gebruiken, kunt u verschillende sonicatiemodi (bijv. sonicatietijd, intensiteit, cyclusmodus etc.) opslaan als vooraf ingestelde modi, zodat ze eenvoudig en snel opnieuw gestart kunnen worden.
Voor nog meer bedieningsgemak kunnen alle digitale ultrasone eenheden worden bediend via een browserafstandsbediening in elke gangbare browser (bijv. InternetExplorer, Safari, Chrome etc.). De LAN-verbinding is een eenvoudige plug-n-play installatie en vereist geen extra software-installatie.
Bij Hielscher weten we dat voor een succesvolle sonicatie van biologische monsters precisie en herhaalbaarheid vereist zijn. Daarom hebben we onze ultrasone apparaten ontworpen als slimme apparaten met alle functies die een efficiënte, betrouwbare, reproduceerbare en handige monstervoorbereiding mogelijk maken.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de verwerkingscapaciteit bij benadering van onze ultrasone systemen, van ultrasone microtips en klassieke ultrasone homogenisatoren tot MultiSample ultrasone apparaten voor het handig en betrouwbaar prepareren van talrijke monsters: