Ultrasone lyse van Drosophila Melanogaster-monsters

Drosophila melanogaster wordt in laboratoria veelvuldig gebruikt als modelorganisme. Daarom moeten preanalytische voorbereidingsstappen zoals lyse, celontsluiting, eiwitextractie en afschuiving van DNA bij Drosophila melanogaster-monsters regelmatig worden uitgevoerd. Ultrasone desintegratoren zijn betrouwbaar en efficiënt en kunnen eenvoudig worden gebruikt voor uiteenlopende taken zoals lyse, eiwitextractie of DNA-fragmentatie door alleen de ultrasone procesparameters aan te passen. Ultrasone homogenisatoren zijn daarmee flexibele hulpmiddelen met een breed scala aan toepassingen.

Ultrasone lyse en eiwitextractie

Lyse, solubilisatie van cellen, weefselhomogenisatie en eiwitextractie zijn typische taken voor ultrasone desintegratoren in biologische laboratoria. Ultrasone desintegratoren en celontsluiters zijn zeer geschikt voor het homogeniseren van dierlijke weefsels, insecten (bijv. Drosophila melanogaster, C. elegans) of plantaardige specimens. Verdere toepassingen van ultrasone behandeling zijn de lyse van celsuspensies en pellets en de extractie van intracellulaire eiwitten.
Ultrasone lyse en eiwitextractie zijn zeer betrouwbare en reproduceerbare processen die op basis van vastgelegde protocollen kunnen worden uitgevoerd. Omdat de ultrasone procesintensiteit nauwkeurig kan worden ingesteld via sonicatieparameters zoals amplitude, cyclus- / pulsmodus, temperatuur en monstervolume, kunnen eenmaal beproefde protocollen steeds opnieuw met hetzelfde resultaat worden herhaald.

Ultrasone DNA- en RNA-fragmentatie

Na cellyse en eiwitextractie is de afschuiving en fragmentatie van DNA, RNA en chromatine een vaak vereiste stap in de monstervoorbereiding, bijvoorbeeld vóór chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). DNA- en RNA-fragmentatie kunnen betrouwbaar worden bereikt door de covalente bindingen die het DNA bijeenhouden met fysieke krachten te verbreken. Bij fysieke afschuiving, zoals sonicatie, worden eerst de DNA-strengen gebroken, waarna het DNA in kleinere stukken wordt gefragmenteerd.
Ultrasone DNA-fragmentatie is betrouwbaar en efficiënt voor het afschuiven van DNA tot een beoogde lengte, bijv. 500bp (basenparen). De belangrijkste voordelen van ultrasone DNA-fragmentatie zijn onder meer de nauwkeurige controle van de ultrasone procesparameters en intensiteit. De ultrasone procesparameters kunnen worden aangepast door de sonicatie-intensiteit, cycli en tijd nauwkeurig in te stellen. Hierdoor kunnen gewenste DNA-groottes worden verkregen en kan de beoogde DNA-lengte betrouwbaar worden geproduceerd en gereproduceerd. Ultrasone afschuiving van DNA is ook ideaal voor het verkrijgen van DNA-fragmenten met een hoog molecuulgewicht.

Protocollen voor ultrasone lyse van Drosophila melanogaster

Hieronder vindt u verschillende protocollen voor ultrasoon ondersteunde lyse, eiwitextractie en DNA- of chromatinefragmentatie van Drosophila-monsters.

Ultrasone lyse voor de crosslinking-immunoprecipitatieassay (CLIP)

De CLIP-assay werd uitgevoerd zoals eerder beschreven, met enkele aanpassingen. Ongeveer 20 mg ovaria van wildtype vrouwtjes van 0 tot 1 dag oud werden met UV gecrosslinkt (3 × 2000 μJ/cm2), op ijs gehomogeniseerd in 1 mL RCB-buffer (50 mM HEPES pH 7,4, 200 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, 0,1% Triton X-100, 250 mM sucrose, 1 mM DTT, 1× EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors, 1 mM PMSF), aangevuld met 300 U RNAseOUT, en gedurende 30 min op ijs geplaatst. Het homogenaat werd op ijs bij 80% vermogen vijfmaal gesoniceerd in pulsen van 20 s met daartussen een rustperiode van 60 s, met behulp van de ultrasone processor van Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) en gecentrifugeerd (16.000 × g gedurende 5 min bij 4°C). Het oplosbare extract werd gedurende 20 min bij 4°C vooraf geklaard met 20 μl Protein-G dynabeads. Na het afnemen van monsters voor immunoblotting en kwantificering van de RNA-input (1%) werd HP1 uit 450 μl vooraf geklaard extract geïmmunoprecipiteerd met anti-HP1 9A9-antilichaam door incubatie gedurende 4 h met 50 μl Protein-G dynabeads. De immunoprecipitaten werden 4 keer gewassen met RCB. Om de geïmmunoprecipiteerde RNA’s te elueren, werden de gepelleteerde beads gedurende 5 min gekookt in 100 μL UltraPure DEPC-treated Water. Aan het voor RNA-bereiding teruggewonnen supernatant werd 900 μL Qiazol Reagent toegevoegd. Het gezuiverde RNA werd gebruikt als template om cDNA te synthetiseren met oligo dT, willekeurige hexameren en SuperScript reverse transcriptase III volgens het protocol van de fabrikant.
(Cassale et al. 2019)

Ultrasone lyse voor de chromatine-immunoprecipitatieassay

Chromatine-immunoprecipitatie werd uitgevoerd volgens de door Menet beschreven methode, met kleine aanpassingen. Ongeveer 20 mg ovaria van wildtype vrouwtjes van 0 tot 1 dag oud werden gedurende 1 min (bij 3000 rpm) gehomogeniseerd met een homogenisator / dompeldispergeerder in 1 mL NEB-buffer (10 mM HEPES-Na bij pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,1 mM EGTA-Na bij pH 8, 0,5 mM EDTA-Na bij pH 8, 1 mM DTT, 0,5% NP-40, 0,5 mM spermidine, 0,15 mM spermine, 1× EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors). Het homogenaat werd overgebracht naar een voorgekoelde glazen Dounce-homogenisator en er werden 15 volledige slagen uitgevoerd met een nauwsluitende stamper. Vrije celkernen werden vervolgens gedurende 10 min bij 4°C gecentrifugeerd bij 6000xg. De pellets met celkernen werden geresuspendeerd in 1 mL NEB en gedurende 20 min gecentrifugeerd bij 20.000 × g op een sucrosegradiënt (0,65 mL 1,6 M sucrose in NEB, 0,35 mL 0,8 M sucrose in NEB). De pellet werd geresuspendeerd in 1 mL NEB en formaldehyde tot een eindconcentratie van 1%. De celkernen werden gedurende 10 min bij kamertemperatuur gecrosslinkt, waarna de reactie werd gestopt door toevoeging van 1/10 vol 1,375 M glycine. De celkernen werden verzameld door centrifugatie bij 6000 × g gedurende 5 min. De celkernen werden tweemaal gewassen in 1 mL NEB en geresuspendeerd in 1 mL lysebuffer (15 mM HEPES-Na bij pH 7,6, 140 mM NaCl, 0,5 mM EGTA, 1 mM EDTA bij pH 8, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 0,1% Na-deoxycholaat, 0,1% SDS, 0,5% N-lauroylsarcosine en 1× EDTA-vrije Complete Protease Inhibitors). De celkernen werden gesoniceerd met een ultrasone processor van Hielscher UP100H (100 W, 30 kHz) in zes cycli van 20 s sonicatie en 1 min op ijs. De gesoniceerde celkernen werden gedurende 4 min bij 4°C gecentrifugeerd bij 13.000 × g. Het grootste deel van het gesoniceerde chromatine had een lengte van 500 tot 1000 basenparen (bp). Voor elke immunoprecipitatie werd 15 μg chromatine geïncubeerd in aanwezigheid van 10 μg monoklonaal HP1 9A9-antilichaam (3 h bij 4°C op een roterend wiel). Vervolgens werd 50 μl dynabeads protein G toegevoegd en werd de incubatie bij 4°C gedurende de nacht voortgezet. De supernatanten werden weggegooid en de monsters werden tweemaal gewassen in lysebuffer (elke wasstap 15 min bij 4 °C) en tweemaal in TE-buffer (1 mM EDTA, 10 mM TrisHCl bij pH 8). Chromatine werd in twee stappen van de beads geëlueerd; eerst in 100 μl elutiebuffer 1 (10 mM EDTA, 1% SDS, 50 mM TrisHCl bij pH 8) gedurende 15 min bij 65°C, gevolgd door centrifugatie en terugwinning van het supernatant. Het beadsmateriaal werd opnieuw geëxtraheerd in 100 μl TE + 0,67% SDS. Het gecombineerde eluaat (200 μl) werd gedurende de nacht bij 65°C geïncubeerd om de crosslinks ongedaan te maken en behandeld met 50 μg/ml RNaseA gedurende 15 min bij 65°C en met 500 μg/ml proteïnase K gedurende 3 h bij 65°C. De monsters werden geëxtraheerd met fenol–chloroform en geprecipiteerd met ethanol. Het DNA werd geresuspendeerd in 25 μl water. Om de moleculaire analyses met geïmmunoprecipiteerd DNA te maximaliseren, werden kandidaatgenen paarsgewijs geamplificeerd volgens een geoptimaliseerd duplex-PCR-protocol, met twee verschillende primersets met vergelijkbare smelttemperaturen in één reactie.
(Casale et al. 2019)
 

Ultrasone celontsluiters met hoge prestaties voor biologische monsters

Hielscher Ultrasonics is uw partner met jarenlange ervaring op het gebied van ultrasone sonicatoren met hoge prestaties voor celontsluiting, lyse, eiwitextractie, DNA-, RNA- en chromatinefragmentatie en andere preanalytische stappen voor monstervoorbereiding. Met een uitgebreid assortiment ultrasone laboratoriumhomogenisatoren en apparaten voor monstervoorbereiding heeft Hielscher het ideale ultrasone apparaat voor uw biologische toepassing en vereisten.
Klassieke ultrasone sonicatoren met sonde en microtip, zoals de UP200St (200W; zie afbeelding links), of een van de ultrasone apparaten voor monstervoorbereiding VialTweeter of UP200ST_TD_CupHorn met VialHolder zijn favoriete modellen in onderzoeks- en analytische laboratoria. De klassieke ultrasone sonde is ideaal wanneer een kleiner aantal monsters moet worden gelyseerd of geëxtraheerd, of wanneer het materiaal ervan moet worden gefragmenteerd. De apparaten voor monstervoorbereiding VialTweeter en UP200St_TD_CupHorn maken gelijktijdige sonicatie van respectievelijk maximaal 10 of 5 monsterbuisjes mogelijk.
Wanneer grote aantallen monsters (bijv. platen met 96 wells, microtiterplaten enz.) moeten worden verwerkt, biedt de UIP400MTP de ideale sonicatieopstelling. De UIP400MTP werkt als een grotere cuphorn, die met water wordt gevuld en voldoende ruimte biedt voor microwellplaten. Aangedreven door een krachtige ultrasone processor van 400 watt levert de UIP400MTP een zeer uniforme en intense sonicatie van multiwellplaten om cellen te ontsluiten, monsters te lyseren, pellets te solubiliseren, eiwitten te extraheren of DNA door afschuiving te fragmenteren.

Nauwkeurige controle via slimme software

Alle sonicatieoplossingen van Hielscher vanaf 200 watt zijn uitgerust met een digitaal kleurentouchscreen en intelligente software. Via de slimme gegevensregistratie worden alle ultrasone procesparameters automatisch als CSV-bestand op een ingebouwde SD-kaart opgeslagen zodra de ultrasone sonicator wordt gestart. Dit maakt onderzoek en registratie veel gemakkelijker. Na de sonicatieproeven of monstervoorbereiding kunt u de sonicatieparameters van elke sonicatiebehandeling eenvoudig bekijken en vergelijken.
Via het intuïtieve menu kunnen vóór de sonicatie talrijke parameters worden ingesteld: om bijvoorbeeld de temperatuur in het monster te regelen en thermische degradatie te voorkomen, kan een bovengrens voor de monstertemperatuur worden ingesteld. Een aansluitbare temperatuursensor, die met het ultrasone apparaat wordt meegeleverd, geeft de ultrasone processor feedback over de actuele sonicatietemperatuur. Wanneer de bovenste temperatuurgrens wordt bereikt, pauzeert het ultrasone apparaat totdat de ondergrens van de ingestelde ∆T wordt bereikt en begint het daarna automatisch opnieuw met soniceren.
Als sonicatie met een specifieke energietoevoer vereist is, kunt u de uiteindelijke ultrasone energie van de sonicatiebehandeling vooraf instellen. Uiteraard kunnen ook de ultrasone pulsatie en de cyclusmodus afzonderlijk worden ingesteld.
Om uw succesvolste sonicatieparameters opnieuw te gebruiken, kunt u verschillende sonicatiemodi (bijv. sonicatietijd, intensiteit, cyclusmodus enz.) opslaan als vooraf ingestelde modi, zodat deze eenvoudig en snel opnieuw kunnen worden gestart.
Voor meer bedieningsgemak kunnen alle digitale ultrasone apparaten via afstandsbediening in elke gangbare browser worden bediend (bijv. InternetExplorer, Safari, Chrome enz.). De LAN-verbinding is een eenvoudige plug-and-play-opstelling en vereist geen installatie van aanvullende software.
Bij Hielscher weten we dat succesvolle sonicatie van biologische monsters nauwkeurigheid en herhaalbaarheid vereist. Daarom hebben we onze ultrasone sonicatoren ontworpen als slimme apparaten met alle functies die een efficiënte, betrouwbare, reproduceerbare en gemakkelijke monstervoorbereiding mogelijk maken.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van ultrasone microtips en klassieke ultrasone homogenisatoren tot MultiSample-sonicatoren voor de gemakkelijke, betrouwbare voorbereiding van grote aantallen monsters: