Ultrasone bereiding van C. elegans-monsters

C. elegans, een nematode, is een veelgebruikt modelorganisme in de biologie. Monstervoorbereiding voorafgaand aan analyse vereist lysis, eiwit- en lipidenextractie en RNA-fragmentatie, die betrouwbaar via sonicatie kunnen worden uitgevoerd. Ultrasone celontsluitingsapparaten zijn betrouwbare, geavanceerde en gebruiksvriendelijke apparaten voor de snelle bereiding van C. elegans-monsters.

Ultrasone bereiding van C. elegans-monsters

Caenorhabditis elegans zijn rondwormen die veel worden gebruikt in onderzoekslaboratoria om genomica, ontwikkelingsbiologie en ziekten te onderzoeken. Veel genen in het genoom van C. elegans hebben functionele tegenhangers bij de mens. Daardoor is deze nematode een uiterst nuttig model voor menselijke ziekten. Andere voordelen die bijdragen aan het brede gebruik van C. elegans zijn de eenvoudige en goedkope kweek op platen met bacteriën (bijv. E. coli), de transparantie, het gemakkelijke hanteren en de mogelijkheid om de wormen in te vriezen en langere tijd te bewaren.
Eiwit- en lipidenanalyse zijn routinematige procedures in laboratoria en ultrasone monstervoorbereiding is de gevestigde methode om nematoden van C. elegans in elk ontwikkelingsstadium te lyseren (d.w.z. embryo’s, larven L1-L4, volwassen wormen). Omdat C. elegans ook wordt gebruikt als eiwitexpressiesysteem voor de overexpressie van doeleiwitten, is een betrouwbare, reproduceerbare methode voor lysis en eiwitextractie nodig die hoge eiwitopbrengsten oplevert. Ultrasone systemen voor celontsluiting en extractie zijn verkrijgbaar als homogenisatoren met een sonde en als sonicatoren voor meerdere monsters. Voor gemakkelijke monstervoorbereiding en alle soorten monstervolumes en aantallen heeft Hielscher Ultrasonics het ideale ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw laboratoriumprocedure.

Ultrasone protocollen voor ontsluiting en lysis van C. elegans

Ultrasone homogenisatie en lysis van C. elegans en de daaropvolgende eiwit- en lipidenextractie kunnen volgens uiteenlopende procedures worden uitgevoerd, met verschillende homogenisatie- en lysisbuffers enz. Alle lysisprotocollen hebben gemeen dat de monsters voortdurend op ijs moeten worden gehouden om eiwitafbraak te voorkomen. Hieronder presenteren we enkele betrouwbare en snelle ultrasone lysis- en extractieprotocollen voor de bereiding van hoogwaardige C. elegans-monsters die eiwitten of lipiden bevatten.

Voordelen van ultrasone lysis van C. elegans

• betrouwbaar
• reproduceerbaar
• nauwkeurig temperatuurgecontroleerd
• betrouwbare procescontrole
• milde methode
• eenvoudig toe te passen
• veilig

Ultrasone eiwitextractie uit C. elegans-monsters

Ultrasone lysis en eiwitextractie van C. elegans-wormen kunnen volgens verschillende protocollen worden uitgevoerd. Hieronder presenteren we enkele betrouwbare en snelle lysisprotocollen voor reproduceerbare resultaten bij eiwitextractie.

Snelle bereiding van cytosolisch extract uit C. elegans-wormen door sonicatie

Met het volgende protocol kunt u in minder dan 30 minuten C. elegans-lysaten bereiden.
Verzamelen van C. elegans
Breng de gewenste C. elegans-wormen over in een buis van 1,5ml met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of spoel ze met 1,5ml PBS van een plaat. Centrifugeer gedurende 1min bij 2000rpm om een pellet te vormen. Houd de monsters te allen tijde op ijs.
Was de wormen vervolgens tweemaal met PBS.
Was de wormen daarna tweemaal met ddH₂O.
Resuspendeer de wormen in ten minste 500ul homogenisatiebuffer (HB). De wormmonsters zijn nu klaar voor ultrasone lysis.
Voor een hogere kwaliteit van het eiwitextract kunt u de bacteriële verontreiniging verminderen door de wormen gedurende telkens 5min te wassen in PBS en steriel, ultrapuur water (ddH₂O) of door sucroseflotatie uit te voeren. Houd de wormmonsters voortdurend op ijs.

Protocol voor ultrasone lysis van C. elegans

• Zorg ervoor dat u de sonicator vooraf voorbereidt, zodat de ultrasone homogenisator klaar is voor gebruik (sonde gemonteerd, sonicatieprogramma vooraf ingesteld). 

Als uw sonicator op een statief is gemonteerd, plaats dan het ijsbad met uw monsterbuizen onder de ultrasone sonde en steek de ultrasone sonde in de buis van 1,5ml.

• Voor lysis van C. elegans met de UP200St of UP200Ht moet sonicatie worden uitgevoerd met een microtip (bijv. sonde S26d2 van 2mm; zie de afbeelding links) bij 40% amplitude gedurende 1sec, met pauzes van 30sec ertussen. 5 sonicatiecycli van elk 1 seconde met pauzes van 30sec zijn ideaal voor lysis van C. elegans. Als u de lysis voor het eerst uitvoert, kunt u na elke puls de voortgang van de lysis met een microscoop controleren in kleine aliquots van het monster.
• De lysis is succesvol voltooid wanneer de wormen zijn ontsloten. Overmatige sonicatie leidt tot het uiteenvallen van celkernen en wordt zichtbaar wanneer het monster viskeus wordt of schuimt. Gebruik zo nodig meer pulsen om afbraak van het monster te voorkomen. Verleng de duur van elke ultrasone pulscyclus niet, om hoogwaardige eiwitextracten te verkrijgen.
• Klaar het cellysaat door de ultrasoon gelyseerde wormen gedurende 10min bij 14.000rpm en 4ºC te centrifugeren.
• Breng het supernatant vervolgens over in een nieuwe buis en bereid het voor op immunoprecipitatie of andere assays.

Opmerking over de homogenisatiebuffer: bereid de homogenisatiebuffer voor het bovenstaande ultrasone lysisprotocol als volgt:

Lysis van C. elegans met hoge verwerkingscapaciteit in 96-wellsplaten met de platensonicator UIP400MTP

Lysis van C. elegans (volwassen nematoden)
UIP400MTP 80% amplitude, 20 cycli (elke sonicatiecyclus: 30 sec AAN, 30 sec UIT)
Lysisbuffer:

• Optie 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Optie 2) voor co-immunoprecipitatie (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 % NP-40 (Complete proteïnaseremmercocktail)

DNA-fragmentatie met hoge verwerkingscapaciteit
DNA van C. elegans (volwassen nematoden) 200–300bp: platensonicator UIP400MTP – stel 80% amplitude in, 30 pulsen – elk 30sec aan, 30sec uit

De platensonicator UIP400MTP voor monstervoorbereiding met hoge verwerkingscapaciteit soniceert monsters gelijkmatig in multiwellplaten, microtiterplaten en 96-wellsplaten

Ultrasone lysis van C. elegans voor kwantitatieve affiniteitszuiveringsassays

C. elegans-embryo’s (∼2 miljoen per replicaat) werden vers geoogst in drie biologische replicaten door jonge eierdragende hermafrodieten met bleekoplossing te behandelen en op ijs gesoniceerd (cyclus: 0,5 s, amplitude: 40–45%, 5 pulsen/sessie, 5 sessies, interval tussen sessies: 30 s; ultrasone processor UP200S met microtip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in lysisbuffer (totaal volume: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteaseremmermengsel, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Na sonicatie werd Nonidet P-40 Substitute toegevoegd tot 1% en werden de lysaten gedurende 30 min bij 4°C geïncubeerd onder kop-staartrotatie, gevolgd door centrifugatie bij 20.000 × g gedurende 20 min bij 4°C. Het geklaarde lysaat werd vervolgens afgezogen zonder de bovenste lipidenlaag te verstoren en in twee helften verdeeld over de anti-GFP-agaroseparels en de geblokkeerde controleparels (40–50 μl). Na kop-staartrotatie bij 4°C gedurende 60–90 min werden de parels eenmaal gewassen met lysisbuffer met 0,1% Nonidet P-40 Substitute, gevolgd door tweemaal wassen in buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) of buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) of beide. Voor GFP:MBK-2-pull-downs werden twee afzonderlijke experimenten uitgevoerd met verschillende wascondities. Eiwitten werden geëlueerd door orbitaal schudden in 50 μl van 6 m ureum/2 M thioureum bij kamertemperatuur. Voor de MBK-1::GFP-pull-downexperimenten werden eiwitten tweemaal geëlueerd door schudden in 50μl van 8 m guanidiniumchloride bij 90°C, gevolgd door ethanolprecipitatie. De geëlueerde eiwitmonsters werden vervolgens in oplossing verteerd.
(cf. Chen et al., 2016)

Ultrasone homogenisatie en lysis van wormen

Voor de procedure voor lysis en eiwitextractie van C.elegans werden per monster 30.000 nematoden van het betreffende stadium verzameld en gewassen in ijskoud S-basal, geconcentreerd door centrifugatie bij 1500 rpm gedurende 2 min., zesmaal gewassen met ijskoud S-basal om resterende bacteriën te verwijderen en vervolgens op ijs bewaard tot gebruik. Voor eiwitextractie liet men volwassen eierdragende wormen na de laatste wasstap met S-basal een compact pellet vormen. De wormpellets werden vervolgens geresuspendeerd in 1 ml ijskoude extractiebuffer [20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 2mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaseremmers (Sigma P2714)] en onmiddellijk verwerkt.
∼30.000 volwassen eierdragende wormen (overeenkomend met ∼100 mg natgewicht) werden op ijs gesoniceerd met een sonicator met een sonde (bijv. UP50H met microtip MS2) bij 40% amplitude gedurende 10 cycli van 3 sec aan, 30 sec uit, in 1 ml ijskoude extractiebuffer. (cf. Baskharan et al. 2012)

Ultrasone lipidenextractie uit C. elegans

In de lipidomica, een tak van de metabolomica, wordt het geheel van lipiden in biologische systemen gekarakteriseerd en geanalyseerd. C. elegans worden veel gebruikt in de lipidomica om de interactie van metabole lipiden en hun effecten op de gezondheid en levensduur te onderzoeken.
Ultrasone lysis en extractie worden gebruikt om lipiden zoals sfingolipiden vrij te maken uit embryo’s, larven en volwassen wormen van C. elegans. Sonicatie wordt gebruikt om wormhomogenaten te bereiden en vervolgens de lipiden uit het monster te extraheren.
Protocol voor ultrasone lipidenextractie uit C. elegans
Ontdooi het C. elegans-pellet op ijs en resuspendeer met 0,5 ml ultrawater. 
Soniceer de C. elegans-monsters in reageerbuizen van 1,5mL en houd de monsters daarbij voortdurend op ijs.
Sonicatie kan worden uitgevoerd met een sonicator met een sonde, zoals de UP200Ht, het ultrasone apparaat voor monstervoorbereiding VialTweeter (gelijktijdige sonicatie van 10 monsters) of de UIP400MTP (voor de sonicatie van multiwellplaten zoals 96-wellsplaten).
Gebruik voor ultrasone lysis met de UP200Ht de microtip S26d2. Stel vooraf de ultrasone cyclusmodus in het digitale menu in. Stel de amplitude in op 10% en de sonicatiecyclusmodus op 20 cycli met pulsen van 2 sec en een pauze van 30 sec. tussen elke reeks ultrasone pulsen.
Breng de supernatanten over in glazen buizen met schroefdop. 
Voer Folch-extractie uit door 1 ml ultrawater aan elke glazen buis toe te voegen, gevolgd door toevoeging van 6 ml 
chloroform/methanolmengsel (verhouding = 2:1) aan elke glazen buis.
Vortex elke glazen buis 4 keer gedurende 30 sec. 
Centrifugeer de buizen bij 1.258 x g gedurende 15 min (Eppendorf, 5810 R) om de fasescheiding verder te verbeteren. 
Breng de onderste hydrofobe fractie met een glazen pasteurpipet over in een schone glazen buis. 
Droog de onderste hydrofobe fractie onder een stikstofstroom in een stikstofverdamper. 
Bewaar het gedroogde pellet tot gebruik in een vriezer bij -80 °C. 


Ultrasone bereiding van wormlysaten

Wormlysaat: wormen in het L4-stadium werden geoogst en driemaal gewassen met M9-buffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄, 85,56 mM NaCl en 0,87 mM MgSO₄) om alle bacteriën te verwijderen. Na verwijdering van zoveel mogelijk buffer M9 werden de wormen geresuspendeerd in lysisbuffer: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM β-glycerolfosfaat, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,2 mM fenylmethaansulfonylfluoride en een proteaseremmer. De wormen werden drie keer ingevroren in vloeibare stikstof en ontdooid bij 37°C, waarna ze op droogijs werden gesoniceerd met een ultrasoon apparaat van het type VialTweeter voor de gelijktijdige bereiding van 10 monsterbuizen. Sonicatie werd uitgevoerd bij 50% amplitude in 10 cycli van 2 sec. met een pauze van 30 sec tussen de sonicatiereeksen. Daarna werden de monsters bij 12.000 rpm en 4°C gedurende 15 min gecentrifugeerd. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -70°C. Een aliquot werd gebruikt voor eiwitkwantificering met de assay van Bradford.
Bepaling van totaal glutathion, GSH en GSSG: voor de kwantificering van glutathion werden de lysaten op dezelfde dag bereid als waarop de bepaling werd uitgevoerd. Met glucose gevoede larven en controlelarven in het L4-stadium werden geoogst en drie keer gewassen met buffer M9. Na verwijdering van zoveel mogelijk buffer M9 werden de wormen geresuspendeerd in ijskoud metafosforzuur (5% w/v), waarna ze in ijs werden gesoniceerd met een ultrasone VialTweeter bij 50% amplitude in tien sonicatiecycli van 2 sec. met een pauze van 30 sec. tussen elke cyclus. Daarna werd gecentrifugeerd bij 12.000 rpm en 4 ̊C gedurende 15 min.
(cf. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Monstervoorbereiding van C. elegans vóór immunoprecipitatie en westernblotting

Kort samengevat werden voor embryonale extracten C. elegans-larven in het L1-stadium in grootschalige vloeibare culturen met S-medium gekweekt tot volwassenheid. Embryo’s werden verzameld met de standaardmethode met bleekoplossing en gesuspendeerd in lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 proteaseremmercocktail en 1􏰅 fosfataseremmercocktail I en II), snel ingevroren in vloeibare stikstof en gelyseerd door ultrasone celontsluiting met een sonicator met microtip, zoals de UP200Ht met S26d2, met 10 pulsen over 10 s bij 30% amplitude. Als een groter aantal monsters moet worden bereid, worden de ultrasone VialTweeter of de sonicator voor meerdere monsters UIP400MTP voor wellplaten aanbevolen. Na sonicatie werden de extracten vooraf geklaard door centrifugatie bij 30.000g gedurende 20 min bij 4°C. Het vooraf geklaarde extract (300µg totaal eiwit) werd geïncubeerd met 40µ􏰂g affiniteitsgezuiverd anti-CDC-25.1-antilichaam (deze studie), gecrosslinkt aan proteïne A-agarose, of als controle werd een vergelijkbare hoeveelheid konijnenimmunoglobuline (Ig)G gebruikt, gecrosslinkt aan proteïne A-agarose, in een totaal volume van 200µl lysisbuffer met 1% NP-40, waarvan de toevoeging de niet-specifieke binding van eiwitten aan de matrix verminderde. De monsters werden gedurende 1 h bij 4°C geroteerd, de parels werden driemaal gewassen met lysisbuffer en geëlueerd met 30µl glycine/HCl en 200 mM NaCl, pH 2,2. Na immunoprecipitatie werden de eluaten verdund in 30µ􏰂l SDS-monsterbuffer, gedurende 4 min verhit tot 95°C en werd doorgaans 3% van het totaal voor de input en 30% voor de eluaten aangebracht op SDS-PAGE, gevolgd door westernblotting met anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitine (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500) of anti-􏰁β-actine (1:2000) antilichamen. Wanneer extracten niet aan immunoprecipitatie werden onderworpen, werd dezelfde hoeveelheid totaal eiwit uit die extracten geresuspendeerd in SDS-monsterbuffer, verhit tot 95°C en vervolgens rechtstreeks aangebracht op SDS-PAGE en geanalyseerd met westernblotting. (cf. Segref et al. 2020)

Ultrasone lysis onder nauwkeurige temperatuurcontrole

Nauwkeurige en betrouwbare temperatuurcontrole is cruciaal bij het hanteren van biologische monsters. Hoge temperaturen veroorzaken thermisch geïnduceerde eiwitafbraak in monsters.
Zoals alle mechanische technieken voor monstervoorbereiding genereert sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden gecontroleerd met de VialTweeter. We presenteren verschillende mogelijkheden om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te regelen terwijl u ze met de VialTweeter en VialPress voorbereidt voor analyse.

1. Bewaking van de monstertemperatuur: de ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aandrijft, is uitgerust met intelligente software en een aansluitbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via het digitale kleurentouchscreen kunt u in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik voor de sonicatie van uw monsters instellen. De sonicator stopt automatisch wanneer de maximale temperatuur wordt bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de ondergrens van de ingestelde temperatuur-∆. Daarna begint de sonicatie automatisch weer. Deze slimme functie voorkomt door warmte veroorzaakte afbraak.
2. Het blok van de VialTweeter kan vooraf worden gekoeld. Plaats het blok van de VialTweeter (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titaniumblok vooraf te koelen; dit helpt de temperatuurstijging in het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan ook het monster zelf vooraf worden gekoeld.
3. Gebruik droogijs om tijdens sonicatie te koelen. Gebruik een ondiepe bak gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs, zodat warmte snel kan worden afgevoerd.

Vind het optimale ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw lysistoepassing

Hielscher Ultrasonics is een fabrikant met jarenlange ervaring in ultrasone celontsluitingsapparaten en homogenisatoren met hoge prestaties voor laboratoria, tafelmodellen en systemen op industriële schaal. De omvang van uw bacteriële celcultuur, uw onderzoeks- of productiedoel en het celvolume dat per uur of dag moet worden verwerkt, zijn essentiële factoren om het juiste ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw toepassing te vinden.
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen voor de gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters (tot 10 monsterflesjes) en grote aantallen monsters (d.w.z. microtiterplaten / 96-wellsplaten), van de klassieke laboratoriumsonicator met een sonde en verschillende vermogens van 50 tot 400 watt tot volledig industriële ultrasone processoren met maximaal 16.000 watt per apparaat voor commerciële celontsluiting en eiwitextractie in grootschalige productie. Alle sonicatoren van Hielscher zijn gebouwd voor 24/7/365-gebruik onder volledige belasting. Robuustheid en betrouwbaarheid zijn kerneigenschappen van onze ultrasone apparaten.
Alle digitale ultrasone homogenisatoren zijn uitgerust met slimme software, een kleurentouchscreen en automatische gegevensregistratie, die het ultrasone apparaat tot een handig werkinstrument in laboratoria en productiefaciliteiten maken.
Laat ons weten welke soorten cellen, welk volume, hoe vaak en met welk doel u uw biologische monsters moet verwerken. Wij bevelen u het meest geschikte ultrasone celontsluitingsapparaat voor uw procesvereisten aan.

De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van compacte draagbare homogenisatoren en sonicatoren voor meerdere monsters tot industriële ultrasone processoren voor commerciële toepassingen: