Ultrasone bereiding van monsters van C. Elegans

C. elegans, een nematodeworm, is een veelgebruikt modelorganisme in de biologie. Monstervoorbereiding voor analyse vereist lysis, eiwit- en vetextractie en RNA-fragmentatie, wat betrouwbaar kan worden uitgevoerd door middel van sonicatie. Ultrasone celdisruptoren zijn betrouwbare, geavanceerde en gebruiksvriendelijke apparaten voor de snelle voorbereiding van monsters van C. elegans.

Ultrasone bereiding van monsters van C. Elegans

C. elegans zijn rondwormen die veel gebruikt worden in onderzoekslaboratoria om genomica, ontwikkelingsbiologie en ziekten te onderzoeken. Veel genen in het genoom van C. elegans hebben functionele tegenhangers bij de mens. Daardoor is de nematodeworm een uiterst nuttig model voor menselijke ziekten. Andere voordelen voor het brede gebruik van C. elegans zijn de gemakkelijke en goedkope kweek op platen met bacteriën (bijv. E. coli), de transparantie, de gemakkelijke hantering en de mogelijkheid om de wormen in te vriezen en voor langere tijd te bewaren.
Eiwit- en lipidenanalyse zijn gangbare procedures in laboratoria en ultrasone monstervoorbereiding is de gevestigde methode om C. elegans nematoden te lyseren in elk ontwikkelingsstadium (d.w.z. embryo's, larven L1-L4, volwassenen). Aangezien C. elegans ook gebruikt wordt als eiwitexpressiesysteem om doelgerichte eiwitten te overexpresseren, is een betrouwbare, reproduceerbare lysis- en eiwitextractiemethode nodig die een hoge eiwitopbrengst geeft. Ultrasone celdisruptie- en extractiesystemen zijn beschikbaar als sonde-type homogenisatoren en als multi-sample ultrasone apparaten. Hielscher Ultrasonics heeft de ideale ultrasone celdisruptor voor uw laboratoriumprocedure, voor een gemakkelijke monstervoorbereiding en voor allerlei soorten monsters.

Ultrasone protocollen voor verstoring en lysis van C. Elegans

Ultrasone homogenisatie en lysis van C. elegans en de daaropvolgende eiwit- en vetextractie kunnen worden uitgevoerd volgens verschillende procedures met verschillende homogenisatie- en lysisbuffers enz. Alle lysisprotocollen hebben gemeen dat de monsters continu in ijs bewaard moeten worden om eiwitafbraak te voorkomen. Hieronder presenteren we enkele betrouwbare en snelle ultrasone lysis- en extractieprotocollen voor de bereiding van hoogwaardige eiwit- of lipidebevattende monsters van C. elegans.

Voordelen van ultrasone C. elegans lysis

• Betrouwbaar
• reproduceerbaar
• nauwkeurig temperatuurgeregeld
• betrouwbare procesbesturing
• zachtaardige methode
• gemakkelijk aan te brengen
• Veilig

Ultrasone eiwitextractie uit monsters van C. elegans

Ultrasone lysis en eiwitextractie van C. elegans wormen kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende protocollen. Hieronder presenteren we enkele betrouwbare en snelle lysisprotocollen voor reproduceerbare eiwitextractieresultaten.

Snelle bereiding van cytosolisch extract van C. elegans wormen door Sonicatie

Met het volgende protocol kun je C. elegans lysaten bereiden in minder dan 30 minuten.
Verzameling van C. elegans
Neem de gewenste C. elegans wormen op in een 1,5 ml buis fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of was ze uit een plaat met 1,5 ml PBS. Centrifugeer gedurende 1min bij 2000rpm om te pelleteren. Bewaar de monsters te allen tijde in ijs.
Was de wormen vervolgens twee keer met PBS.
Was de wormen daarna tweemaal met ddH₂O.
Resuspendeer de wormen in ten minste 500ul homogenisatiebuffer (HB). De wormmonsters zijn nu klaar voor ultrasone lysis.
Voor een hogere kwaliteit eiwitextract kun je bacteriële verontreiniging verminderen door de wormen telkens 5 minuten te wassen in PBS en steriel, ultrazuiver water (ddH₂O) of voer sucrose floatatie uit. Bewaar de wormmonsters continu op ijs.

Ultrasoon C. elegans Lysis-protocol

• Zorg ervoor dat je het ultrasoonapparaat van tevoren voorbereidt, zodat de ultrasone homogenisator klaar is voor gebruik (sonde gemonteerd, sonicatieprogramma vooraf ingesteld).

Als uw ultrasoonapparaat op een standaard is gemonteerd, plaats dan het ijsbad met uw monsterbuizen onder de ultrasone sonde en steek de ultrasone sonde in de 1,5 ml buis.

• Voor de lysis van C. elegans met de UP200St of UP200Ht moet ultrasoon worden toegepast met een microtip (bijv. 2 mm sonde S26d2; zie afbeelding links) bij een amplitude van 40% gedurende 1 seconde met 30 seconden pauze ertussen. 5 sonicatiecycli voor elke 1 seconde met 30 seconden pauze zijn ideaal voor de lysis van C. elegans. Als u de lysis voor de eerste keer uitvoert, kunt u de voortgang van de lysis in kleine aliquots van het monster na elke puls controleren met een microscoop.
• De lysis is succesvol voltooid wanneer de wormen uiteenvallen. Overmatige sonificatie resulteert in het afbreken van kernen en wordt zichtbaar wanneer het monster stroperig wordt of schuimt. Gebruik indien nodig meer pulsen om afbraak van het monster te voorkomen. Verleng de tijd van elke ultrasone pulscyclus niet om eiwitextracten van hoge kwaliteit te verkrijgen.
• Maak het cellysaat helder door de ultrasoon gelyseerde wormen te centrifugeren bij 14.000 tpm gedurende 10 minuten bij 4ºC.
• Breng vervolgens het supernatant over in een vers buisje en bereid voor op immunoprecipitatie of andere analyses.

Opmerking voor homogenisatiebuffer: Bereid de homogenisatiebuffer voor het ultrasone lysisprotocol hierboven als volgt:

High-Throughput Lysis van C. elegans in 96-Well Plates met behulp van de UIP400MTP Plate Sonicator

C. elegans Lysis (volwassen nematoden)
UIP400MTP 80% amplitude, 20 cycli (elke sonicatiecyclus: 30 sec AAN, 30 sec UIT)
Lysisbuffer:

• Optie 1) 4% SDS, 0,1 M Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA
• Optie 2) voor co-immunoprecipitatie (co-IP): 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,5% NP-40 (complete proteïnaseremmer-cocktail)

Snelle DNA-fragmentatie
C. elegans (volwassen nematoden) DNA 200-300bp: UIP400MTP plaat sonicator – stel 80% amplitude, 30 pulsen in – elke 30sec aan, 30sec uit

UIP400MTP Plate Sonicator voor high-throughput monstervoorbereiding sonificeert gelijkmatig monsters in multi-well, microtiterplaten en 96-well platen

Ultrasone lysis van C. elegans voor kwantitatieve affiniteitspurificatie-analyses

C. elegans embryo's (∼2 miljoen per replicaat) werden vers geoogst in biologische triplo door jonge gravide hermafrodieten te bleken en op ijs te sonificeren (cyclus: 0,5 s, amplitude: 40-45%, 5 slagen/sessie, 5 sessies, interval tussen sessies: 30 s; UP200S ultrasone processor met micro-tip S26d2 (Hielscher Ultrasonics GmbH)) in lysisbuffer (totaal volume: ∼600 μl; 50 mm Tris-HCl, pH 7,4, 100 mm KCl, 1 mm MgCl2, 1 mm EGTA, 1 mm DTT, 10% glycerol, proteaseremmer mengsel, 0,1% Nonidet P-40 Substitute). Na sonicatie werd Nonidet P-40 Substitute toegevoegd tot 1% en de lysaten werden geïncubeerd met kop over staart rotatie bij 4 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door centrifugatie bij 20.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Gewist lysaat werd vervolgens opgezogen zonder verstoring van de bovenste lipidenlaag en gesplitst door de helft in een van beide de anti-GFP agarose korrels of de geblokkeerde controle kralen (40-50 pi). Na kop over staart rotatie bij 4 ° C gedurende 60-90 min, werden de kralen een keer gewassen met lysisbuffer met 0,1% Nonidet P-40 Substitute, gevolgd door twee keer wassen in buffer I (25 mm Tris-HCl, pH 7,4, 300 mm NaCl, 1 mm MgCl2) of buffer II (1 mm Tris-HCl, pH 7,4, 150 mm NaCl, 1 mm MgCl2) of beide. Voor GFP:MBK-2 pull-downs werden twee afzonderlijke experimenten uitgevoerd met verschillende wascondities. Eiwitten werden geëlueerd door orbitaal schudden in 50 ul van 6 m ureum / 2 M thioureum bij kamertemperatuur. Voor de MBK-1::GFP pull-down experimenten werden eiwitten twee keer geëlueerd door schudden in 50 ul van 8 m guanidiniumchloride bij 90 ° C, gevolgd door ethanol precipitatie. Geëlueerde eiwitmonsters werden vervolgens verteerd in oplossing.
(cf. Chen et al., 2016)

Ultrasone homogenisatie en lysis van wormen

Voor C. elegans lysis en eiwitextractie procedure, werden 30.000 nemotoden van het relevante stadium verzameld per monster en gewassen in ijskoud S-basal, geconcentreerd door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 2 minuten, zes keer gewassen met ijskoud S-basal om resterende bacteriën te verwijderen, en vervolgens bewaard op ijs tot klaar voor gebruik. Voor de eiwitextractie werden gravid-adult wormen na de laatste S-basal wasbeurt tot een compacte pellet gevormd. Wormenpellets werden vervolgens geresuspendeerd in 1 ml ijskoud extractiebuffer [20 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 2 mM EDTA, 1% Triton-X-100, proteaseremmers (Sigma P2714)] en onmiddellijk verwerkt.
∼30.000 gravid-adult wormen (overeenkomend met ∼100 mg nat gewicht) werden op ijs gesoneerd met een ultrasoonapparaat van het probe-type (bv. UP50H met microtip MS2) bij een amplitude van 40% gedurende 10 cycli van 3 sec aan, 30 sec uit, in 1 ml ijskoude extractiebuffer. (cf. Baskharan et al. 2012)

Ultrasone vetextractie uit C. elegans

Bij lipidomics, een tak van metabolomics, wordt het lipidecomplement van biologische systemen gekarakteriseerd en geanalyseerd. C. elegans wordt veel gebruikt in lipidomics om de interactie van metabole lipiden en hun effecten op gezondheid en levensduur te onderzoeken.
Ultrasone lysis en extractie wordt gebruikt om lipiden zoals sfingolipiden vrij te maken uit embryo's, larven en volwassen wormen van C. elegans. Ultrasoonbehandeling wordt gebruikt om wormenhomogenaten te bereiden en vervolgens de lipiden uit het monster te extraheren.
Protocol voor ultrasone lipide-extractie uit C. elegans
Ontdooi de C. elegans pellet op ijs en resuspendeer met 0,5 ml ultrawater. Sonificeer de monsters van C. elegans in reageerbuizen van 1,5 ml, terwijl de monsters continu in ijs worden gehouden.
Sonificatie kan worden uitgevoerd met een sonde-ultrasoonstoof zoals de UP200Htde ultrasone monstervoorbereidingseenheid VialTweeter (gelijktijdige sonicatie van 10 monsters) of de UIP400MTP (voor sonicatie van platen met meerdere putjes, zoals 96-wells platen).Gebruik voor ultrasone lysis met de UP200Ht de microtip S26d2. Stel de ultrasone cyclusmodus vooraf in het digitale menu in. Stel de amplitude in op 10% en de sonicatiecyclusmodus van 2 sec. pulsen van 20 cycli met een pauze van 30 sec. tussen elke ultrasone pulsatiestoot.
Breng de supernatanten over in glazen buisjes met schroefdop. Voer Folch-extractie uit door aan elke glazen buis 1 ml ultrawater toe te voegen, gevolgd door 6 ml chloroform/methanolmengsel (verhouding = 2:1).
Vortex elke glazen buis gedurende 30 sec gedurende 4 keer. Centrifugeer de buisjes gedurende 15 minuten bij 1.258 xg (Eppendorf, 5810 R) om de fasescheiding verder te verbeteren. Breng de lagere hydrofobe fractie over in een schoon glazen buisje met een glazen pasteurpipet. Droog de onderste hydrofobe fractie onder stikstofstroom in een stikstofverdamper. Bewaar de gedroogde pellet tot gebruik in een vriezer van -80 °C.

Ultrasone bereiding van wormlysaten

Wormenlysaat: L4 stadium wormen werden geoogst en drie keer gewassen met M9 buffer (42,26 mM Na₂HPO₄, 22,04 mM KH₂PO₄85,56 mM NaCl en 0,87 mM MgSO₄) om alle bacteriën te verwijderen. Na zoveel mogelijk M9-buffer verwijderd te hebben, werden de wormen geresuspendeerd in lysisbuffer: 50 mM HEPES, 50 mM KCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 5 mM fosfaat β-glycerol, 0,1% (v/v) Triton X-100, 50 mM natriumfluoride, 1 mM natriumorthovanadaat, 5 mM natriumpyrofosfaat, 0,2 mM fenylmethanesulfonylfluoride en proteaseremmer. De wormen werden bevroren in vloeibare stikstof en drie keer ontdooid bij 37 °C. Vervolgens werden de wormen op droog ijs gesonitiseerd met een ultrasone VialTweeter voor de gelijktijdige bereiding van 10 monsterbuizen. De sonificatie werd uitgevoerd bij 50% amplitude in 10 cycli van 2 sec. met 30 sec pauze tussen de sonificatie-uitbarstingen. Daarna werden de monsters gecentrifugeerd bij 12000 rpm bij 4°C gedurende 15 min. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij -70°C. Een aliquot werd gebruikt voor eiwitkwantificering met de Bradford-test.
Bepaling van totaal glutathion, GSH en GSSG: Voor glutathionkwantificering werden lysaten en bepalingen op dezelfde dag gemaakt. Glucose-gevoede en controle L4 larven werden geoogst en gewassen met M9 buffer drie keer. Na het verwijderen van zoveel mogelijk van M9 buffer, werden wormen resuspendeerd in ijskoud metafosforzuur (5% w / v), dan wormen werden gesonitiseerd in ijs met een ultrasone VialTweeter op 50% amplitude in tien sonicatie cycli van 2 sec. met 30 sec. pauze tussen elke cyclus. Daarna gecentrifugeerd bij 12000 rpm bij 4 ̊C gedurende 15 min.
(vgl. Alcántar-Fernández et al., 2018)

Monstervoorbereiding van C. elegans vóór immunoprecipitatie en Western Blotting

In het kort, voor embryonale extracten, werden C. elegans L1 larven gekweekt in grootschalige vloeibare S-medium culturen tot volwassenheid. Embryo's werden verzameld met behulp van de standaard bleekmethode en gesuspendeerd in lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 8,7% glycerol, 0,05% NP-40, 1􏰅 Protease Inhibitor Cocktail, en 1􏰅 Fosfatase Inhibitor Cocktail I en II), snel ingevroren in vloeibare stikstof, en gelyseerd door ultrasone celdisruptie met behulp van een ultrasoonapparaat met microtip zoals het UP200Ht met S26d2 gedurende 10 pulsen gedurende 10 s bij een amplitude van 30%. Als een groter aantal monsters moet worden geprepareerd, kan de ultrasone VialTweeter of de MultiSample-Ultrasonicator UIP400MTP voor wellplates worden aanbevolen. Na sonicatie werden de extracten vooraf gereinigd door centrifugeren bij 30.000 g gedurende 20 minuten bij 4°C. Het vooraf gereinigde extract (300 µg totaal eiwit) werd geïncubeerd met 40µ􏰂g van anti-CDC-25.1 affiniteit-gezuiverd antilichaam (dit onderzoek), gekoppeld aan proteïne A-agarose, of als controle werd een vergelijkbare hoeveelheid konijnimmunoglobuline (Ig)G, gekoppeld aan proteïne A-agarose, gebruikt in een totaal volume van 200 µl lysisbuffer met 1% NP-40, waardoor de niet-specifieke binding van eiwitten aan de matrix werd verminderd. De monsters werden gedurende 1 uur bij 4 °C geroteerd, de korrels werden driemaal gewassen met lysisbuffer en geëlueerd met 30 µl glycine/HCl en 200 mM NaCl, pH 2,2. Na immunoprecipitatie werden de eluaten verdund in 30µ􏰂l SDS-monsterbuffer, verwarmd tot 95°C gedurende 4 minuten, en meestal 3% van het totaal voor input en 30% voor de eluaten werden toegepast op SDS-PAGE gevolgd door Western blotting met anti-CDC-25.1 (1:400), anti-LIN-23 (1:750), anti-ubiquitine (1:1000), anti-GSK3􏰁 (1:500), of anti-􏰁β-actine (1:2000) antilichamen. Wanneer extracten niet werden onderworpen aan immunoprecipitatie, werd dezelfde hoeveelheid totaal eiwit afkomstig van deze extracten geresuspendeerd in SDS-monsterbuffer, verwarmd tot 95°C en vervolgens direct toegepast op SDS-PAGE en geanalyseerd door Western blotting. (cf. Segref et al. 2020)

Ultrasone lysis onder nauwkeurige temperatuurregeling

Een nauwkeurige en betrouwbare temperatuurregeling is cruciaal bij het hanteren van biologische monsters. Hoge temperaturen initiëren thermisch geïnduceerde eiwitafbraak in monsters.
Zoals bij alle mechanische monstervoorbereidingstechnieken veroorzaakt sonicatie warmte. De temperatuur van de monsters kan echter goed worden geregeld bij gebruik van de VialTweeter. We bieden u verschillende opties om de temperatuur van uw monsters te bewaken en te regelen terwijl u ze prepareert met de VialTweeter en VialPress voor analyse.

1. Bewaking van de monstertemperatuur: De ultrasone processor UP200St, die de VialTweeter aanstuurt, is uitgerust met intelligente software en een insteekbare temperatuursensor. Sluit de temperatuursensor aan op de UP200St en steek de punt van de temperatuursensor in een van de monsterbuizen. Via het digitale gekleurde touch-display kun je in het menu van de UP200St een specifiek temperatuurbereik instellen voor de sonicatie van je monster. De ultrasoon stopt automatisch wanneer de maximumtemperatuur is bereikt en pauzeert totdat de monstertemperatuur is gedaald tot de laagste waarde van de ingestelde temperatuur ∆. Dan start de sonicatie automatisch opnieuw. Daarna start de sonicatie automatisch opnieuw. Deze slimme functie voorkomt door warmte veroorzaakte degradatie.
2. Het VialTweeter-blok kan worden voorgekoeld. Plaats het VialTweeter-blok (alleen de sonotrode zonder transducer!) in de koelkast of vriezer om het titanium blok voor te koelen om temperatuurstijging in het monster uit te stellen. Indien mogelijk kan het monster zelf ook worden voorgekoeld.
3. Gebruik droogijs om te koelen tijdens sonicatie. Gebruik een ondiep bakje gevuld met droogijs en plaats de VialTweeter op het droogijs zodat de warmte snel kan worden afgevoerd.

Vind de optimale ultrasone celverstoorder voor uw lysisatietoepassing

Hielscher Ultrasonics is een ervaren fabrikant van hoogwaardige ultrasone celverstoorders en homogenisatoren voor laboratoria, bench-top en industriële systemen. De grootte van uw bacteriële celkweek, uw onderzoeks- of productiedoel en het te verwerken celvolume per uur of dag zijn essentiële factoren om de juiste ultrasone celdisruptor voor uw toepassing te vinden.
Hielscher Ultrasonics biedt verschillende oplossingen voor de gelijktijdige sonicatie van multi-samples (tot 10 vials) en massamonsters (d.w.z. microtiterplaten / 96-wellsplaten), de klassieke probe-type laboratorium-ultrasoneur met verschillende vermogensniveaus van 50 tot 400 watt tot volledig industriële ultrasone processoren met tot 16.000 watt per eenheid voor commerciële celdisruptie en eiwitextractie in grote productie. Alle Hielscher ultrasone processors zijn gebouwd voor 24/7/365 bedrijf onder volledige belasting. Robuustheid en betrouwbaarheid zijn de belangrijkste kenmerken van onze ultrasone apparaten.
Alle digitale ultrasone homogenisatoren zijn uitgerust met slimme software, gekleurd aanraakscherm en automatische gegevensprotocollering, waardoor het ultrasone apparaat een handig werkinstrument wordt in laboratoria en productiefaciliteiten.
Laat ons weten wat voor soort cellen, welk volume, met welke frequentie en met welk doel u uw biologische monsters moet verwerken. Wij zullen u de meest geschikte ultrasone celdisruptor aanbevelen voor uw procesvereisten.

De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone systemen, van compacte handhomogenisatoren en MultiSample Ultrasonicators tot industriële ultrasone processoren voor commerciële toepassingen: