Ultrasone eiwitextractie uit weefsel en celculturen
- Eiwitextractie is een essentiële stap in de monstervoorbereiding binnen de proteomica.
- Eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit plantaardig en dierlijk weefsel, gisten en micro-organismen.
- Sonicatie is een betrouwbare, efficiënte methode voor eiwitextractie die binnen een korte extractietijd hoge eiwitopbrengsten oplevert.
Eiwitextractie uit weefsels en cellen
Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is een essentiële stap in de monstervoorbereiding die bij veel biochemische en analytische technieken wordt uitgevoerd, zoals ELISA, PAGE, westernblotting, massaspectrometrie of eiwitzuivering. Ultrasone celontsluiting, lyse en extractie vormen een nauwkeurig regelbare, niet-thermische techniek om hoge eiwitopbrengsten te garanderen.
Eiwitextractie uit cellen met de ultrasone sonde UP200St
- Snel
- Hoge opbrengsten
- Zeer efficiënt
- Nauwkeurige regeling van parameters
- Reproduceerbare resultaten
- Lineaire schaalbaarheid
Algemene instructies voor ultrasone lyse en eiwitextractie
- Temperatuurregeling: Om een hoge eiwitopbrengst zonder thermische denaturatie te garanderen, moet de temperatuur tijdens de extractie worden geregeld. De geavanceerde ultrasone homogenisatoren van Hielscher – ook ultrasone desintegratoren of ultrasoonapparaten genoemd – zijn nauwkeurig regelbaar. Ze worden geleverd met een aansluitbare temperatuursensor. In de instelmogelijkheden van de ultrasone homogenisator kan een maximumtemperatuur worden ingesteld. Wanneer deze maximumtemperatuur wordt bereikt, stopt de sonicator automatisch totdat het monster is afgekoeld.
- Buffer: De keuze van een geschikte buffer en het juiste buffervolume verschillen per weefsel en moeten door middel van proefondervindelijk testen worden bepaald.
- Isolatie / zuivering: Eiwitlysaten kunnen een overmaat aan biomoleculen bevatten, zoals DNA of koolhydraten, die mogelijk door eiwitprecipitatie (deoxycholaat-trichloorazijnzuur) of bufferwisseling kunnen worden verwijderd.
Chittapalo en Noomhorm (2009) rapporteerden in hun onderzoek dat de eiwitopbrengst toenam door het gebruik van sonicatie en dat het proces van ultrasone weefselhomogenisatie en lyse bestaande extractieprocessen aanzienlijk kan verbeteren – waardoor nieuwe commerciële extractiemogelijkheden ontstaan.
Ultrasone CupHorn voor de gelijktijdige, zeer doeltreffende voorbereiding van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden voor eiwitisolatie en DNA-fragmentatie.
Eiwitextractie uit dierlijk weefsel
Voor de voorbereiding van weefsel in zijn geheel (bijv. nier, hart, long, spier enz.) moet het weefsel met schoon gereedschap in zeer kleine stukjes worden gesneden, bij voorkeur op ijs en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen te voorkomen (bijv. een lysebuffer zoals RIPA of een hypotone lysebuffer met een cocktail van protease- en fosfataseremmers). Na het snijden wordt het monster ondergedompeld in vloeibare stikstof om het snel in te vriezen. Het monster kan bij -80°C worden bewaard voor later gebruik of op ijs worden gehouden voor onmiddellijke homogenisatie. Direct vóór de ultrasone extractie wordt snel ijskoude lysebuffer (met de proteaseremmers DTT, leupeptine en aprotinine) aan het monsterbuisje toegevoegd (per ~10 mg weefsel wordt ongeveer ~600 μL buffer aanbevolen). Per monsterbuisje wordt ongeveer 20–60mg weefsel aanbevolen.
Ultrasone homogenisatie, lyse en extractie worden uitgevoerd met een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht, uitgerust met een sonotrode met microtip. De sonicatieduur bedraagt 60–90 sec. in een ultrasone cyclusmodus met 15 sec. sonicatie en 10 sec. rusttijd. Het monster moet voortdurend in ijs worden gehouden.
Na ultrasone homogenisatie / extractie wordt het lysaat gedurende ongeveer 20 min. bij 27.000g gecentrifugeerd. Vervolgens wordt het supernatant verzameld, zodat de eiwitconcentratie kan worden bepaald met een eiwitassay zoals de Pierce BCA-eiwitassay.
Eiwitextractie uit bloedserum
Om een homogeen mengsel van het serum en de fosfaatbuffer te verkrijgen, wordt het monster eerst met een vortexmixer gemengd voordat ultrasone cellyse plaatsvindt. Voor de ultrasone lyse wordt het monster met een ultrasone laboratoriumhomogenisator zoals de UP100H gedurende 8 cycli bij 20% amplitude gesoniceerd, waarbij elke cyclus bestaat uit 5 seconden aan en 15 seconden uit. Eiwitextractie wordt uitgevoerd door in cycli te soniceren (pulsatiemodus) en het monster op ijs te plaatsen, zodat oververhitting en thermische afbraak van het monster worden voorkomen. Omdat serum een grote hoeveelheid eiwitten met een hoog molecuulgewicht bevat (zoals albumine, α1-antitrypsine, transferrine, haptoglobuline, immunoglobuline G en immunoglobuline A), die de scheiding van eiwitten met een laag molecuulgewicht tijdens IEF verstoren, wordt aanbevolen deze met een depletiekolom uit het serum te verwijderen.
Eiwitextractie uit plantaardig weefsel
Vers, zacht plantaardig weefsel, bijv. mos enz., kan eenvoudig worden ontsloten door het gehakte monstermateriaal voor sonicatie in lysebuffer te plaatsen. Taai, verhout plantaardig weefsel, zoals zaden, dennennaalden enz., moet droog worden gemalen. Sommige harde, houtige plantaardige materialen moeten worden ingevroren en in vloeibare stikstof worden gemalen voordat ze door sonicatie worden geëxtraheerd. Voor suspensies van plantencelculturen is een ultrasone behandeling van 30 tot 150 seconden in een lysebuffer meestal voldoende. Taaier materiaal, zoals pompoenpitten, vereist intensievere sonicatie, zoals hieronder beschreven.
Protocol voor ultrasone extractie van albumine uit pompoenpitten
Voor de ultrasone eiwitextractie van albumine uit fijngemalen pompoenpitpoeder worden 10 g ontvet pompoenpitpoeder en 100 mL gedeïoniseerd water als oplosmiddel toegevoegd aan een glazen bekerglas van 250mL. De eiwitextractie bestaat uit twee stappen: eerst wordt het monster gesoniceerd met een sonicator met sonde UP400St (400W, 24kHz), uitgerust met sonotrode S24d7. Het glazen bekerglas wordt tijdens de ultrasone homogenisatie in een koudwaterbad geplaatst. De aansluitbare temperatuursensor en de instellingen voor temperatuurregeling van de sonicator UP400St zorgen ervoor dat de monstertemperatuur altijd onder 30°C blijft. Door de nauwkeurige temperatuurregeling tijdens sonicatie wordt denaturatie van albumine voorkomen. Vervolgens werd de extractie uitgevoerd met een mixer bij een toerental van 200 rpm en bij 30°C. Daarna wordt het bekerglas overgebracht naar een thermostatische schudder. Globuline wordt verwijderd door dialyse met gedestilleerd water. Na verwijdering van de globuline kan een monster van het eiwitextract worden genomen om het albumineprofiel te bepalen. Vervolgens wordt het extract met 0,1 M HCl op pI=3,0 gebracht voor albuminecoagulatie. De vaste fase wordt door centrifugatie bij 5000g en 20°C gescheiden en opnieuw opgelost in gedeïoniseerd water. Albuminecoagulatie wordt tweemaal uitgevoerd om het eiwitaandeel in het albumineconcentraat te verhogen.
Ultrasone alkalische eiwitextractie voor de bereiding van eiwitconcentraat uit rijstzemelen laat zien dat de ultrasone behandeling een hogere eiwitopbrengst oplevert in een aanzienlijk kortere extractietijd – vergeleken met conventionele extractiemethoden.
Protocol voor monstervoorbereiding voor functioneel iNOS-enzym
Om volledig functioneel iNOS-enzym te verkrijgen (bijv. voor geneesmiddelenscreening), wordt het volgende protocol aanbevolen: de celsuspensie moet op ijs worden geplaatst en wordt met een UP100H bij een amplitude van 10µm gesoniceerd in een cyclusmodus met 5 sec. sonicatie en 25 sec. rust op ijs. De procedure moet ongeveer 3 keer worden herhaald. De rusttijd tussen sonicatiecycli beperkt de temperatuurstijging en vermindert daardoor het risico op denaturatie.
Ultrasone eiwitsolubilisatie
Sonicatie kan het proces van eiwitsolubilisatie versnellen, dat doorgaans meerdere uren duurt. Om het monster niet te oververhitten en eiwitafbraak en modificaties in ureumhoudende oplossingen te voorkomen, mogen de ultrasone pulsen niet langer dan enkele seconden duren.
Sonicator UP200Ht met microtip S26d2 van 2mm voor de sonicatie van kleine monsters.
Ultrasone apparatuur voor eiwitextractie
Hielscher Ultrasonics biedt een breed assortiment ultrasone homogenisatoren voor de desintegratie van cellen, weefsels, bacteriën, micro-organismen, gist en sporen.
De laboratoriumsonicatoren van Hielscher zijn krachtig en eenvoudig te bedienen. Ze zijn gebouwd voor 24/7-gebruik en ontworpen als robuuste en efficiënte laboratorium- en tafelapparaten. Bij alle apparaten kunnen het afgegeven energieniveau en de amplitude nauwkeurig worden geregeld. Het brede assortiment accessoires biedt verdere opstellingsmogelijkheden. De digitale sonicatoren, zoals de VialTweeter, UP200Ht, UP200St en UP400St, hebben geïntegreerde temperatuurregeling en een ingebouwde SD-kaart voor automatische gegevensregistratie.
Voor de indirecte, gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters zonder kruisbesmetting bieden wij de VialTweeter of de ultrasone CupHorn aan.
De onderstaande tabel geeft u een overzicht van onze sonicatoren voor monstervoorbereiding, celontsluiting en extractie. Klik op het apparaattype voor meer informatie over elke ultrasone homogenisator. Onze goed opgeleide technische medewerkers met jarenlange ervaring helpen u graag bij het kiezen van de meest geschikte sonicator voor uw monstervoorbereiding!
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| tot 10 flacons of buisjes | n.v.t. | VialTweeter |
| platen met meerdere wells / microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| meerdere buisjes / vaten | n.v.t. | CupHorn |
| 1 tot 500mL | 10 tot 200mL/min | UP100H |
| 10 tot 1000mL | 20 tot 200mL/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 tot 2000mL | 20 tot 400mL/min | UP400St |
Afhankelijk van uw toepassing, materiaal en monstervolume adviseren wij u de meest geschikte opstelling voor uw monstervoorbereiding. Neem vandaag nog contact met ons op!
Neem contact met ons op! / Stel ons uw vragen!
De digitale sonicatoren van Hielscher beschikken over afstandsbediening via een browser en automatische gegevensregistratie op een geïntegreerde SD-kaart.
VialTweeter voor indirecte sonicatie.
Wetenswaardigheden
Proteomica
Proteomica is het onderzoeksgebied dat eiwitten en het proteoom onderzoekt. Eiwitten vervullen een groot aantal vitale functies binnen organismen. Het proteoom is de volledige verzameling eiwitten die op een bepaald moment door een genoom, cel, weefsel of organisme tot expressie worden gebracht. Het proteoom varieert met de tijd en met de specifieke behoeften of stressfactoren waaraan een cel of organisme wordt blootgesteld. Meer specifiek is het de verzameling eiwitten die in een bepaald type cel of organisme op een bepaald moment onder vastgestelde omstandigheden tot expressie worden gebracht. De term is een samenvoeging van proteïnen en genoom. Proteomica is de studie van het proteoom.
Eiwit
Eiwitten zijn grote biomoleculen, zogeheten macromoleculen – die zijn opgebouwd uit één of meer lange ketens van aminozuurresiduen. Eiwitten zijn aanwezig in alle organismen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong en zijn essentieel voor de meeste biologische functies. Omdat eiwitten veel biologische informatie bevatten, worden ze voor analytische doeleinden geëxtraheerd, bijv. voor proteomisch onderzoek. De belangrijkste functies van eiwitten omvatten de katalyse van metabole reacties, DNA-replicatie, de reactie op prikkels en het transport van moleculen van de ene locatie naar de andere. Eiwitten verschillen voornamelijk van elkaar in hun aminozuurvolgorde, die wordt bepaald door de nucleotidevolgorde van hun genen en doorgaans resulteert in de vouwing van het eiwit tot een specifieke driedimensionale structuur die de activiteit ervan bepaalt. Eiwitten zijn – naast peptiden – een van de belangrijkste bestanddelen van voeding. Daarom is proteomica een krachtig hulpmiddel binnen de voedingswetenschap voor het optimaliseren van processen, voedselveiligheid en voedingskundige beoordeling.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction is een pre-analytische procedure om analyten te scheiden en voor te concentreren. In combinatie met sonicatie kan troebelpuntextractie worden geïntensiveerd, waardoor het proces efficiënter, sneller en milieuvriendelijker wordt. Met sonicatie is troebelpuntextractie een aanzienlijk efficiëntere methode voor de voorbereiding van analyten. Lees meer over ultrasoon ondersteunde troebelpuntextractie!
Gelelektroforese
Gelelektroforese is de belangrijkste methode voor de scheiding en analyse van macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten, evenals hun fragmenten, op basis van hun grootte en lading. De methode wordt in de klinische chemie gebruikt om eiwitten te scheiden op basis van lading en/of grootte (IEF-agarose, in wezen onafhankelijk van de grootte) en in de biochemie, moleculaire biologie en proteomica om een gemengde populatie DNA- en RNA-fragmenten op lengte te scheiden, de grootte van DNA- en RNA-fragmenten te schatten of eiwitten op lading te scheiden.
Celculturen
Celkweek is het gecontroleerde groeiproces waarbij cellen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt. De kweekomstandigheden verschillen per celtype. Over het algemeen bestaat de omgeving van een celcultuur uit een geschikt vat (bijv. een petrischaal) met een substraat of medium dat de essentiële voedingsstoffen (aminozuren, koolhydraten, vitaminen, mineralen), groeifactoren, hormonen en gassen levert (CO2, O2) en het fysisch-chemische milieu reguleert (pH-buffer, osmotische druk, temperatuur). De meeste cellen hebben een oppervlak of kunstmatig substraat nodig, terwijl andere celculturen vrij zwevend in kweekmedium kunnen worden gekweekt (suspensiecultuur, celsuspensie).
Grootschalige kweken van dierlijke cellijnen worden gebruikt bij de industriële productie van virale vaccins en andere biotechnologisch verkregen producten. Menselijke stamcellen worden gekweekt om het aantal cellen te vergroten en de cellen voor transplantatiedoeleinden te laten differentiëren tot verschillende somatische celtypen.
Weefselmonsters
De term weefsel beschrijft een cellulair tussenniveau, waarbij het celmateriaal zich op een organisatieniveau tussen cellen en een volledig orgaan bevindt. In weefsel zijn vergelijkbare cellen met dezelfde oorsprong samengebracht die gezamenlijk een specifieke functie vervullen. Door de functionele groepering van meerdere weefsels worden de complexe structuren van organen gevormd.
Weefselmonsters worden genomen voor onderzoek in de biologie, histologie/histopathologie, parasitologie, biochemie en immunohistochemie, evenals voor het kweken van weefsel en het extraheren van DNA. Er kan onderscheid worden gemaakt tussen dierlijk weefsel (onderverdeling: zoogdierweefsel) en plantaardig weefsel. Dierlijke weefsels worden ingedeeld in de vier basistypen bindweefsel, spierweefsel, zenuwweefsel en epitheelweefsel. Plantaardig weefsel wordt onderverdeeld in de volgende drie weefselsystemen: de epidermis, het grondweefsel en het vaatweefsel.
Weefselmonsters kunnen worden bereid uit dierlijke of plantaardige delen, bijv. bot, spier, bladeren enz.
Lichaamsvloeistoffen
Bloed, serum, plasma, hersenvocht, speeksel en synoviale vloeistof zijn lichaamsvloeistoffen die een rijke bron van diagnostisch relevante informatie vormen. Daarom is een geavanceerde voorbereiding van monsters van lichaamsvloeistoffen voor analyse belangrijk. De eerste moeilijkheid houdt verband met het brede dynamische bereik van de componenten die in lichaamsvloeistoffen aanwezig zijn.
Bepaling van de eiwitconcentratie
De Bradford-assay, Lowry-assay en bicinchoninezuurassay (BCA) zijn gangbare assays om de concentratie van eiwitten te bepalen. Runderalbumine (BSA) is een van de meest gebruikte eiwitstandaarden.
Lysebuffer
Lysebuffer moet worden gekozen op basis van het celmateriaal of weefsel (weefselkweek, plant, bacteriën, schimmels enz.), of de cellen zich in een structuur bevinden en het type structuur. Een breed scala aan lysebuffers voor de extractie van eiwitten, membranen en organellen wordt samengesteld met één of meer detergentia. Het detergens wordt doorgaans gekozen door proefondervindelijk testen of – indien beschikbaar – volgens een bestaand eiwitextractieprotocol. Het detergens moet compatibel zijn met het weefsel waaruit wordt geëxtraheerd en de eiwitten. Over het algemeen wordt het mildste detergens gekozen dat voor een specifiek weefsel / eiwit werkt, om de maximale functionaliteit van het extract te behouden. Bovendien houdt een mild detergens bij de extractie van membranen en organellen het membraan intact. Veelgebruikte detergentia in lysebuffers zijn meestal niet-ionisch of zwitterionisch, bijv. CHAPS, deoxycholaat, Triton™ X-100, NP40 en Tween 20.
Weefsels zoals hersenen, lever, darm, nier, milt enz. kunnen bijvoorbeeld eenvoudig met RIPA worden gebufferd – er moeten echter proteaseremmers en DTT (bijv. voor gelelektroforese) worden toegevoegd.
Lysebuffer voor skeletspierweefsel (ijskoud): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 % Triton X-100, 10 % (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, aangevuld met een cocktail van protease- en fosfataseremmers
Tabel met gangbare buffers en hun pH-bereik. Over het algemeen worden deze buffers gewoonlijk gebruikt bij concentraties van 20–50 mM.
| Buffer | pH-bereik |
|---|---|
| Citroenzuur – NaOH | 2,2 – 6,5 |
| Natriumcitraat – citroenzuur | 3,0 – 6,2 |
| Natriumacetaat – azijnzuur | 3,6 – 5,6 |
| Natriumzout van cacodylzuur – HCl | 5,0 – 7,4 |
| MES – NaOH | 5,6 – 6,8 |
| Natriumdiwaterstoffosfaat – dinatriumwaterstoffosfaat | 5,8 – 8,0 |
| Imidazool – HCl | 6,2 – 7,8 |
| MOPS – KOH | 6,6 – 7,8 |
| Tri-ethanolaminehydrochloride – NaOH | 6,8 – 8,8 |
| Tris – HCl | 7,0 – 9,0 |
| HEPES – NaOH | 7,2 – 8,2 |
| Tricine – NaOH | 7,6 – 8,6 |
| Natriumtetraboraat – boorzuur | 7,6 – 9,2 |
| Bicine – NaOH | 7,7 – 8,9 |
| Glycine – NaOH | 8,6 – 10,6 |
Bij de meeste buffers is de pH afhankelijk van de temperatuur. Dit geldt vooral voor Tris-buffers. De pKa verandert van 8,06 bij 25°C naar 8,85 bij 0°C.
(pH en pKa van een buffer: pH meet de concentratie van waterstofionen in een waterige oplossing. pKa (= zuurdissociatieconstante) is een verwante, maar specifiekere maat, omdat deze helpt te voorspellen hoe een molecuul zich bij een bepaalde pH-waarde zal gedragen.)
TRIzol
TRIzol is een chemische oplossing die wordt gebruikt om RNA/DNA/eiwit te extraheren tijdens guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroformextractie. Het gebruik van ultrasoon ondersteunde TRIzol-extractie resulteert in hoge DNA-, RNA- en eiwitopbrengsten uit hetzelfde monster en overtreft daarmee andere extractiemethoden.
Literatuur/Referenties
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.