Ultrasone Eiwitextractie van Tissue en Cell Cultures
- Eiwitextractie is een essentiële stap in monstervoorbereiding proteomics.
- Eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit plantaardige en dierlijk weefsel, gisten en micro-organismen.
- Sonicatie is een betrouwbare, efficiënte proteïne-extractie methode die eiwitrijk opbrengsten binnen een korte extractietijd.
Eiwitwinning uit weefsels en cellen
Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is een essentiële monstervoorbereidingsstap die wordt uitgevoerd tijdens vele biochemische en analytische technieken zoals ELISA, PAGE, Western blotting, massaspectrometrie of eiwitzuivering. Ultrasone celdisruptie, -lyse en -extractie is een nauwkeurig controleerbare, niet-thermische techniek die een hoge opbrengst aan eiwitten garandeert.
Eiwitextractie uit cellen met de ultrasone sonde UP200St
- snel
- hoge opbrengsten
- zeer efficiënt
- Nauwkeurige controle over parameters
- reproduceerbare resultaten
- lineaire schaalbaarheid
Algemene instructies voor ultrasone lysis en eiwitextractie
- Temperatuurregeling: Om een hoge opbrengst proteïne zonder thermische denaturatie te garanderen, moet de temperatuur tijdens de extractie worden geregeld. Hielscher state-of-art ultrasone homogenisatoren – ook ultrasone desintegrator of ultrasone reiniger genoemd – zijn precies bestuurbaar. Ze hebben een inplugbare temperatuursensor. In de instelmogelijkheden van de ultrasone homogenisator, kan een maximale temperatuur instelbaar. Wanneer deze max is bereikt, de ultrasonicator automatisch gestopt totdat het monster afgekoeld.
- Buffer: De keuze van een geschikte buffer en het juiste volume buffer varieert van weefsel tot weefsel en moet bedacht-out door trial-and-error tests.
- Isolatie / zuivering: Proteïnelysaten kan een overmaat van biomoleculen zoals DNA of koolhydraten, die kunnen worden verwijderd door eiwitneerslag (deoxycholaat-trichloorazijnzuur) verwezen of bufferuitwisseling.
Chittapalo en Noomhorm (2009) meldden in hun studie dat de eiwitopbrengst toenam met behulp van sonicatie en dat het ultrasone weefselhomogenisatie- en lysisproces de bestaande extractieprocessen aanzienlijk kan verbeteren. – waardoor naar nieuwe commerciële winning kansen.
ultrasone CupHorn voor de gelijktijdige, zeer efficiënte preparatie van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden voor eiwitisolatie en DNA-fragmentatie.
Eiwitextractie uit dierlijk weefsel
Voor de vervaardiging van weefsel van volledige grootte (bijv. Nier, hart, longen, spieren enz.), Moet het weefsel in zeer kleine stukjes worden gesneden met schoon gereedschap, bij voorkeur op ijs en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen (bijv. lysisbuffer zoals RIPA of hypotonische lysisbuffer bevattende cocktail van protease en fosfatase-remmer). Na het ontleden wordt het monster ondergedompeld in vloeibare stikstof voor snelvriezen. Het monster kan worden bewaard bij -80 ° C voor later gebruik of op ijs worden bewaard voor onmiddellijke homogenisatie. Direct voor de ultrasone extractie wordt ijskoude lysisbuffer (met proteaseremmers DTT, leupeptine en aprotinine) snel aan de monsterbuis toegevoegd (per ~ 10 mg weefsel wordt ongeveer - 600 μL buffer aanbevolen). Ong. Per monsterbuis wordt 20-60 mg weefsel aanbevolen.
Ultrasone homogenisatie, lysis en extractie worden uitgevoerd met een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht, uitgerust met een microtip sonotrode. De sonificatie duurt 60-90 sec. bij een ultrasone cyclus van 15 sec. sonificatie en 10 sec. rusttijd. Het monster moet voortdurend in ijs worden bewaard.
Na ultrasoon homogenisatie / extractie wordt het lysaat gecentrifugeerd bij 27.000 g gedurende ca.. 20 minuten. Daarna werd het supernatans opgevangen, waardoor de eiwitconcentratie door eiwitbepaling kan worden bepaald zoals Pierce BCA-eiwitbepaling.
Eiwitextractie uit bloedserum
Voor een homogeen mengsel van het serum en de fosfaatbuffer wordt het monster eerst gevortexd vóór de ultrasone cellyse. Voor de ultrasone lysis wordt het monster gesonitiseerd met een ultrasone laboratoriumhomogenisator zoals de UP100H gedurende 8 cycli bij 20% amplitude, gedurende cycli van telkens 5 seconden aan en 15 seconden uit. Eiwitextractie wordt uitgevoerd door in cycli te sonificeren (pulsatiemodus) en door het monster op ijs te plaatsen zodat oververhitting en thermische degradatie van het monster wordt voorkomen. Aangezien serum een grote hoeveelheid eiwitten met een hoog molecuulgewicht bevat (zoals albumine, α1-antitrypsine, transferrine, haptoglobuline, immunoglobuline G en immunoglobuline A), die interfereren met de scheiding van eiwitten met een laag molecuulgewicht tijdens IEF, wordt aanbevolen deze uit het serum te verwijderen met behulp van een depletiekolom.
Eiwitextractie uit plantenweefsel
Verse, zachte plantenweefsel, b.v. mos etc., kan gemakkelijk worden verstoord door gewoon de gehakte monstermateriaal in lysisbuffer sonicatie. Taaie, ligenous plantenweefsels, zoals zaden, dennennaalden enz., Moet droog worden gemalen. Sommige vaste, houtachtige plantaardige materiaal moet worden ingevroren en gemalen in vloeibare stikstof voordat geëxtraheerd door sonicatie. Voor plantencelcultuur suspensies, een ultrasone behandeling van 30 en 150 seconden in een lysisbuffer meestal voldoende. Strengere materiaal zoals pompoenpitten vereisen een meer intense ultrasoonapparaat zoals hieronder beschreven.
Protocol voor ultrasone extractie van albumine uit pompoenpitten
Voor de ultrasone eiwitextractie van albumine uit fijngemalen pompoenzaadpoeder worden 10 g ontvet pompoenzaadpoeder en 100 mL gedeïoniseerd water als oplosmiddel toegevoegd in een glazen bekerglas van 250 mL. De eiwitextractie bestaat uit twee stappen: Eerst wordt het monster gesoniseerd met een ultrasoonapparaat van het probe-type UP400St (400 W, 24 kHz), uitgerust met een sonotrode S24d7. Het glazen bekerglas wordt tijdens de ultrasone homogenisatie in een koud waterbad geplaatst. De insteekbare temperatuursensor en temperatuurregelingsinstellingen van de ultrasoon UP400St zorgen ervoor dat de temperatuur van het monster altijd onder 30°C wordt gehouden. Door de nauwkeurige temperatuurregeling tijdens sonicatie wordt denaturatie van albumine voorkomen. Ten tweede werd de extractie uitgevoerd met een mixer op een snelheid van 200 rpm en bij 30°C. Daarna wordt het bekerglas overgebracht in een thermostatisch schudapparaat. Globuline wordt verwijderd via dialyse met gedestilleerd water. Na de globulineverwijdering kan het eiwitextract worden bemonsterd voor het bepalen van het albuminegehalte en wordt het vervolgens met 0,1 M HCl voor albuminecoagulatie op pI=3,0 gebracht. De vaste fase wordt gescheiden door centrifugeren bij 5000g, 20°C en opnieuw opgelost in gedeïoniseerd water. De albuminecoagulatie wordt twee keer uitgevoerd om de eiwitverhouding in het albumineconcentraat te verhogen.
Ultrasone alkaline eiwitextractie voor de bereiding van eiwitconcentraat uit rijstzemelen blijkt dat de ultrasone behandeling resulteert in hogere opbrengst eiwit in een significant kortere extractietijd – vergeleken met conventionele extractiewerkwijzen.
Monstervoorbereiding protocol voor functionele iNOS enzym
Om volledig functioneel iNOS-enzym te verkrijgen (bv. voor geneesmiddelenonderzoek) wordt het volgende protocol aanbevolen: De celsuspensie moet op ijs worden geplaatst en wordt gesoneerd met een UP100H bij een amplitude van 10µm bij een cyclusmodus van 5 sec. sonicatie en 25 sec. rust op ijs. De procedure moet ongeveer 3 keer worden herhaald. De rusttijd tussen de sonicatiecycli vermindert de temperatuurstijging en vermindert daardoor het risico van denaturatie.
Ultrasone Protein Het oplosbaar
De sonicatie kan het eiwit oplosbaar proces, dat gewoonlijk verscheidene uren vergt versnellen. Om het monster niet oververhit raken en gaan eiwitafbraak en modificaties in oplossingen die ureum, moeten de ultrasone bursts niet langer dan enkele seconden.
Ultrasoonapparaat UP200Ht met 2 mm microtip S26d2 voor de sonicatie van kleine monsters.
Ultrasone apparatuur voor Protein Extraction
Hielscher Ultrasonics hebben een breed scala van ultrasone homogenisatoren voor de desintegratie van cellen, weefsel, bacteriën, micro-organismen, gisten en sporen.
Hielscher laboratorium ultrasone apparaten zijn krachtig en eenvoudig te bedienen. Ze zijn gebouwd voor 24/7 gebruik en ontworpen als robuuste en efficiënte laboratorium- en tafelmodellen. Voor alle apparaten geldt dat de energieafgifte en de amplitude nauwkeurig kunnen worden geregeld. Het brede assortiment accessoires biedt nog meer instelmogelijkheden. De digitale ultrasone apparaten zoals de VialTweeter, UP200Ht, UP200St en UP400St hebben een geïntegreerde temperatuurregeling en een ingebouwde SD-kaart voor automatische gegevensregistratie.
Voor de indirecte, kruisbesmettingsvrije en gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters bieden wij de VialTweeter of de ultrasone CupHorn.
De onderstaande tabel geeft u een overzicht van onze ultrasone apparaten voor monstervoorbereiding, celdisruptie en -extractie. Klik op het type apparaat voor meer informatie over elke ultrasone homogenisator. Onze goed opgeleide en langdurig ervaren technische medewerkers helpen u graag bij het kiezen van de meest geschikte ultrasoonapparaat voor uw monstervoorbereiding!
| batch Volume | Stroomsnelheid | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| tot 10 flesjes of buisjes | na | VialTweeter |
| multiwell- / microtiterplaten | na | UIP400MTP |
| meerdere buizen/vaten | na | Cuphorn |
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml / min | UP100H |
| 10 tot 1000 ml | 20 tot 200 mL/min | Uf200 ः t, UP200St |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml / min | UP400St |
Afhankelijk van de toepassing, materiaal en sample volume, dan raden wij u de meest geschikte instellingen voor uw sample prep. Contacteer ons vandaag nog!
Neem contact met ons op! / Vraag ons!
Hielscher digitale ultrasone apparaten beschikken over een browser-afstandsbediening en automatische dataprotocollering op een geïntegreerde SD-kaart.
VialTweeter voor indirecte ultrasoonapparaat.
Feiten die de moeite waard zijn om te weten
proteomics
Proteomics is het onderzoeksveld dat eiwitten en het proteoom onderzoekt. Eiwitten fullfil een breed scala van vitale functies binnen organismen. Het proteoom is het geheel van eiwitten door een genoom, cel, weefsel of organisme tot expressie gebracht op een bepaald tijdstip. Het proteoom varieert met de tijd en verschillende vereisten of benadrukt dat een cel of organisme ondergaat. Meer specifiek is de verzameling van tot expressie gebrachte eiwitten in een bepaald soort cel of organisme op een bepaald moment onder gedefinieerde omstandigheden. De term is een mengsel van eiwitten en genoom. Proteomics is de studie van het proteoom.
Eiwit
Eiwitten zijn zijn grote biomoleculen, zogenaamde macromoleculen – die zijn samengesteld uit één of meer lange ketens van aminozuurresiduen. Eiwitten zijn aanwezig in alle organismen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong en ze zijn cruciaal voor de meeste biologische functies. Omdat eiwitten veel biologische informatie bevatten, worden ze voor analytische doeleinden geëxtraheerd, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek. De belangrijkste functie die door eiwitten wordt uitgeoefend, is de katalyse van metabole reacties, DNA-replicatie, reactie op stimuli en het transport van moleculen van de ene locatie naar de andere. Eiwitten verschillen hoofdzakelijk van elkaar in hun sequentie van aminozuren, wat wordt gedicteerd door de nucleotidesequentie van hun genen en die gewoonlijk resulteert in eiwitvouwing in een specifieke driedimensionale structuur die de activiteit ervan bepaalt. Eiwitten zijn – naast peptiden – een van de belangrijkste onderdelen van voedsel. Daarom, proteomics is een krachtig instrument in voedsel wetenschap om processen, voedselveiligheid en voedingswaarde assessment te optimaliseren.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction is een pre-analytische procedure om analyten te scheiden en te preconcetreren. In combinatie met ultrasoonbehandeling kan wolkpuntextractie worden geïntensiveerd, waardoor het proces efficiënter, sneller en milieuvriendelijker wordt. Met ultrasone trillingen is wolkenpuntextractie een aanzienlijk efficiëntere methode om analyten voor te bereiden. Lees meer over ultrasoon ondersteunde wolkenpuntextractie!gel Elektroforese
Gelelektroforese belangrijke werkwijze voor de scheiding en analyse van macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten en hun fragmenten, op basis van hun grootte en lading. Het wordt gebruikt in klinische chemie eiwitten door lading en / of grootte gescheiden (IEF agarose, voornamelijk de maat onafhankelijk) en biochemie, moleculaire biologie en proteomics een gemengde populatie van DNA- en RNA-fragmenten gescheiden op lengte, de grootte van DNA schatten en RNA fragmenten of eiwitten te scheiden van lading.
Celculturen
Celkweek is de gecontroleerde groeiproces waarbij cellen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt. Celcultuur omstandigheden variëren voor elk type cel. Over het algemeen de omgeving van een celkweek uit een geschikt vat (bijvoorbeeld petrischaal) met substraat of medium dat essentiële voedingsstoffen (aminozuren, koolhydraten, vitaminen, mineralen), groeifactoren, hormonen levert en gassen (CO2, The2) En reguleert de fysiochemische milieu (pH-buffer, osmotische druk, temperatuur). De meeste cellen hebben een oppervlak of kunstmatig substraat, terwijl andere vrije celkweken kan worden gekweekt drijven in kweekmedium (suspensiekweek, celsuspensie).
Massa kweken van dierlijke cellijnen worden gebruikt in industriële productie van virale vaccins en andere biotechnologisch afgeleide producten. Menselijke stamcellen zijn gekweekt om het aantal cellen expanderen en differentiëren de cellen in verschillende somatische celsoorten voor transplantatiedoeleinden.
weefselmonsters
De term weefsel beschrijft een cellulair tussenproduct, waarbij het celmateriaal op organisatorisch tussen cellen en één volledig orgaan. In weefsel soortgelijke cellen van dezelfde oorsprong die tezamen een specifieke functie verrichten, worden geassembleerd. Door de functionele groepering van meerdere weefsels, worden de complexe structuren van organen gevormd.
Weefsel wordt bemonsterd voor onderzoek in de biologie, histologie / histopathologie, parasitologie, biochemie, immunohistochemie en te cultiveren en te extraheren DNA. Hij onderscheidt tussen dieren (onderverdeling: zoogdier weefsel) en plantenweefsel. Dierlijke weefsels worden gegroepeerd in vier basistypen van bindweefsel, spier-, zenuw- en epitheelweefsel. Plantenweefsel wordt onderverdeeld in de volgende drie weefselsystemen: de epidermis, de grond weefsel en het vaatweefsel.
Weefselmonsters kunnen worden bereid uit dierlijke of plantendelen, b.v. botten, spieren, bladeren, enz.
Lichaamssappen
Bloed, serum, plasma, cerebrospinale vloeistof, speeksel en synoviale fluïdum lichaamsvloeistoffen, die een grote bron van diagnostisch relevante informatie geven. Derhalve is een verfijnde bereiding van lichaamsvloeistofmonsters voor analyse is belangrijk. De eerste moeilijkheid is gekoppeld aan het brede dynamische bereik van bestanddelen van lichaamsvloeistoffen.
Bepaling van proteïneconcentratie
Bradford assay Lowry assay en bicinchoninezuur (BCA) assay gemeenschappelijk assays om de concentratie van eiwitten te bepalen. Runderserumalbumine (BSA) is een van de meest gebruikte eiwitstandaard.
lysis Buffer
Lysis buffer moet worden gekozen in overeenstemming met het celmateriaal of weefsel (weefselkweek, planten, bacteriën, schimmels, enz), en of de cellen in een structuur en het type structuur. Een breed scala aan lysis buffers voor de extractie van eiwitten, membranen en organellen worden geformuleerd met één of meer detergentia. Het detergens wordt gewoonlijk gekozen via trial-and-error tests of – indien beschikbaar – volgens een bestaand eiwit extractieprotocol. Het wasmiddel moet compatibel zijn met de weefselbron en eiwitten. In het algemeen is de mildste reinigingsmiddel dat werkt voor een specifiek weefsel / eiwit is gekozen om de maximale functionaliteit van het extract te behouden. Ook bij een extractie van membranen en organellen, zachte zeep houdt het membraan intact. Algemeen gebruikte detergentia lysis buffers zijn meestal niet-ionogene of zwitterionogene, b.v. CHAPS, deoxycholaat, Triton ™ X-100, NP40, en Tween 20.
Bijvoorbeeld weefsels zoals hersenen, lever, darmen, nier, milt etc. eenvoudig worden gebufferd met RIPA – echter proteaseremmers en DTT (bijvoorbeeld voor gelelektroforese) worden opgenomen.
Lysisbuffer skeletspierweefsel (ijskoud): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol gesupplementeerd met protease en fosfatase-inhibitor cocktail
Tabel zachte buffers en hun pH-gebied. In het algemeen worden deze buffers gewoonlijk gebruikt in concentraties van 20-50 mM.
| Buffer | pH-bereik |
|---|---|
| Citroenzuur – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumcitraat – Citroenzuur | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetaat – azijnzuur | 3.6 – 5.6 |
| Kakodylzuur natriumzout – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MIJN – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdiwaterstoffosfaat – dinatriumwaterstoffosfaat | 5.8 – 8.0 |
| imidazool – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| triethanolamine hydrochloride – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| natriumtetraboraat – boorzuur | 7.6 – 9.2 |
| bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
De meeste buffers vertonen een pH-afhankelijkheid van de temperatuur. Dit geldt vooral voor Tris buffers. De pKa verandert van 8,06 bij 25 ° C tot 8,85 bij 0 ° C.
(PH en pKa van de buffer: pH meet de concentratie van waterstofionen in een waterige oplossing pKa (= zuurdissociatieconstante) is een verwante, maar specifieker maatregel, dat helpt te voorspellen hoe een molecuul zal optreden op een bepaald. PH waarde.)
TRIzol
TRIzol een chemische oplossing gebruikt om RNA / DNA / eiwit los wanneer de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Het gebruik van ultrasoon bijgestaan TRIzol extractieresultaten hoge DNA, RNA en eiwit opbrengst van hetzelfde monster en blinkt daardoor andere extractiemethoden.
Literatuur / Referenties
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.