Ultrasone eiwitextractie uit weefsel- en celculturen
- Eiwitextractie is een essentiële monstervoorbereidingsstap in proteomics.
- Eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit plantaardig en dierlijk weefsel, gisten en micro-organismen.
- Sonificatie is een betrouwbare, efficiënte methode voor eiwitextractie die een hoge eiwitopbrengst geeft binnen een korte extractietijd.
Eiwitwinning uit weefsels en cellen
Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is een essentiële monstervoorbereidingsstap die wordt uitgevoerd tijdens veel biochemische en analytische technieken zoals ELISA, PAGE, Western blotting, massaspectrometrie of eiwitzuivering. Ultrasone celdisruptie, -lyse en -extractie is een nauwkeurig regelbare, niet-thermische techniek om een hoge opbrengst aan eiwitten te garanderen.
Eiwitextractie uit cellen met de ultrasone sonde UP200St
- Snel
- hoge opbrengsten
- Zeer efficiënt
- Nauwkeurige controle over parameters
- reproduceerbare resultaten
- lineaire schaalbaarheid
Algemene instructies voor ultrasone lysis en eiwitextractie
- Temperatuurregeling: Om een hoge eiwitopbrengst zonder thermische denaturatie te garanderen, moet de temperatuur tijdens de extractie worden geregeld. Hielscher's ultramoderne ultrasone homogenisatoren – ook ultrasone desintegrator of ultrasone reiniger genoemd – zijn nauwkeurig regelbaar. Ze worden geleverd met een insteekbare temperatuursensor. In de instelopties van de ultrasone homogenisator kan een maximumtemperatuur worden ingesteld. Als deze maximumtemperatuur is bereikt, stopt de ultrasone homogenisator automatisch totdat het monster is afgekoeld.
- Buffer: De keuze van een geschikte buffer en het juiste volume buffer varieert van weefsel tot weefsel en moet proefondervindelijk worden bepaald.
- Isolatie / zuivering: Eiwitlysaten kunnen een overmaat aan biomoleculen bevatten, zoals DNA of koolhydraten, die verwijderd kunnen worden door eiwitneerslag (deoxycholaat-trichloorazijnzuur) of bufferwisseling.
Chittapalo en Noomhorm (2009) rapporteerden in hun onderzoek dat de eiwitopbrengst toenam door gebruik te maken van sonicatie en dat het ultrasone weefselhomogenisatie- en lysisproces bestaande extractieprocessen aanzienlijk kan verbeteren. – nieuwe commerciële ontginningsmogelijkheden mogelijk maken.
Ultrasone kopHoorn voor de gelijktijdige, zeer efficiënte preparatie van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden voor eiwitisolatie en DNA-fragmentatie.
Eiwitwinning uit dierlijk weefsel
Voor de bereiding van weefsel van hele afmetingen (bv. nier, hart, long, spier enz.) moet het weefsel in zeer kleine stukjes worden ontleed met schoon gereedschap, bij voorkeur op ijs en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen te voorkomen (bv. lysisbuffer zoals RIPA of hypotone lysisbuffer met protease- en fosfataseremmercocktail). Na het ontleden wordt het monster ondergedompeld in vloeibare stikstof voor snap freeze. Het monster kan worden opgeslagen bij -80°C voor later gebruik of worden bewaard op ijs voor onmiddellijke homogenisatie. Onmiddellijk voor de ultrasone extractie wordt ijskoude lysisbuffer (met proteaseremmers DTT, leupeptine en aprotinine) snel toegevoegd in de monsterbuis (per ~ 10 mg weefsel ca. ~ 600 ul buffer worden aanbevolen). Ca. 20-60 mg weefsel wordt aanbevolen per monsterbuis.
Ultrasone homogenisatie, lysis en extractie worden uitgevoerd met een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht, uitgerust met een microtip sonotrode. De duur van de sonificatie is 60-90 sec. bij een ultrasone cyclusmodus van 15 sec. sonificatie en 10 sec. rusttijd. Het monster moet de hele tijd in ijs worden bewaard.
Na ultrasone homogenisatie / extractie wordt het lysaat gecentrifugeerd bij 27.000 g gedurende ongeveer 20 minuten. Daarna wordt het supernatent verzameld, zodat de eiwitconcentratie kan worden bepaald met een eiwitassay zoals Pierce protein assay BCA.
Eiwitwinning uit bloedserum
Voor een homogeen mengsel van het serum en de fosfaatbuffer wordt het monster eerst gevortexd vóór de ultrasone cellyse. Voor de ultrasone lysis wordt het monster gesonitiseerd met een ultrasone laboratoriumhomogenisator zoals de UP100H gedurende 8 cycli bij 20% amplitude, gedurende cycli van telkens 5 seconden aan en 15 seconden uit. Eiwitextractie wordt uitgevoerd door in cycli te sonificeren (pulsatiemodus) en door het monster op ijs te plaatsen zodat oververhitting en thermische degradatie van het monster wordt voorkomen. Aangezien serum een grote hoeveelheid eiwitten met een hoog molecuulgewicht bevat (zoals albumine, α1-antitrypsine, transferrine, haptoglobuline, immunoglobuline G en immunoglobuline A), die interfereren met de scheiding van eiwitten met een laag molecuulgewicht tijdens IEF, wordt aanbevolen deze uit het serum te verwijderen met behulp van een depletiekolom.
Eiwitwinning uit plantenweefsel
Vers, zacht plantenweefsel, bijvoorbeeld mos, kan eenvoudig worden ontleed door het fijngehakte monstermateriaal in lysisbuffer te plaatsen voor sonicatie. Taai, ligenachtig plantenweefsel, zoals zaden, dennennaalden etc., moet droog vermalen worden. Sommige harde, houtachtige plantmaterialen moeten worden bevroren en vermalen in vloeibare stikstof voordat ze met sonicatie worden geëxtraheerd. Voor celsuspensies van planten is een ultrasone behandeling tussen 30 en 150 seconden in een lysisbuffer meestal voldoende. Taaiere materialen zoals pompoenpitten vereisen een intensievere sonicatie zoals hieronder beschreven.
Protocol voor ultrasone extractie van albumine uit pompoenpitten
Voor de ultrasone eiwitextractie van albumine uit fijngemalen pompoenzaadpoeder worden 10 g ontvet pompoenzaadpoeder en 100 ml gedeïoniseerd water als oplosmiddel toegevoegd in een glazen bekerglas van 250 ml. De eiwitextractie bestaat uit twee stappen: Eerst wordt het monster gesonitiseerd met een ultrasone sensor UP400St (400 W, 24 kHz) uitgerust met sonotrode S24d7. Het glazen bekerglas wordt tijdens de ultrasone homogenisatie in een koud waterbad geplaatst. De insteekbare temperatuursensor en temperatuurregelingsinstellingen van de ultrasoon UP400St zorgen ervoor dat de temperatuur van het monster altijd onder 30°C wordt gehouden. Door de nauwkeurige temperatuurregeling tijdens sonicatie wordt denaturatie van albumine voorkomen. Ten tweede werd de extractie uitgevoerd met een mixer op een snelheid van 200 rpm en bij 30°C. Daarna wordt het bekerglas overgebracht in een thermostatisch schudapparaat. Globuline wordt verwijderd via dialyse met gedestilleerd water. Na de globulineverwijdering kan het eiwitextract worden bemonsterd voor het bepalen van het albuminegehalte en wordt het vervolgens met 0,1 M HCl voor albuminecoagulatie op pI=3,0 gebracht. De vaste fase wordt gescheiden door centrifugeren bij 5000g, 20°C en opnieuw opgelost in gedeïoniseerd water. De albuminecoagulatie wordt twee keer uitgevoerd om de eiwitverhouding in het albumineconcentraat te verhogen.
Ultrasone alkalische eiwitextractie voor de bereiding van eiwitconcentraat uit rijstzemelen toont aan dat de ultrasone behandeling resulteert in een hogere eiwitopbrengst in een aanzienlijk kortere extractietijd. – vergeleken met conventionele extractiemethoden.
Monsterbereidingsprotocol voor functioneel iNOS-enzym
Om volledig functioneel iNOS-enzym te verkrijgen (bijvoorbeeld voor het screenen van geneesmiddelen), wordt het volgende protocol aanbevolen: De celsuspensie moet op ijs worden geplaatst en wordt gesoneerd met een UP100H met een amplitude van 10 µm bij een cyclusmodus van 5 sec. sonicatie en 25 sec. rust op ijs. De procedure moet ongeveer 3 keer worden herhaald. De rusttijd tussen de sonicatiecycli vermindert de temperatuurstijging en verkleint daardoor het risico op denaturatie.
Ultrasone eiwitoplosbaarheid
Sonificatie kan het proces van eiwitoplosbaarheid, dat gewoonlijk enkele uren in beslag neemt, versnellen. Om het monster niet te oververhitten en afbraak van eiwitten en modificaties in oplossingen met ureum te voorkomen, mogen de ultrasone uitbarstingen niet langer dan enkele seconden duren.
Ultrasone UP200Ht met 2 mm microtip S26d2 voor sonicatie van kleine monsters.
Ultrasone apparatuur voor eiwitextractie
Hielscher Ultrasonics biedt een breed assortiment ultrasone homogenisatoren voor het desintegreren van cellen, weefsels, bacteriën, micro-organismen, gist en sporen.
Hielscher laboratorium ultrasone apparaten zijn krachtig en eenvoudig te bedienen. Ze zijn gebouwd voor 24/7 gebruik en ontworpen als robuuste en efficiënte laboratorium- en tafelmodellen. Voor alle apparaten geldt dat de energieafgifte en de amplitude nauwkeurig kunnen worden geregeld. Het brede assortiment accessoires biedt nog meer instelmogelijkheden. De digitale ultrasone apparaten zoals de VialTweeter, UP200Ht, UP200St en UP400St hebben een geïntegreerde temperatuurregeling en een ingebouwde SD-kaart voor automatische gegevensregistratie.
Voor indirecte, kruisbesmettingsvrije en gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters bieden we de VialTweeter of de ultrasone CupHorn.
De onderstaande tabel geeft je een overzicht van onze ultrasone apparaten voor monstervoorbereiding, celdisruptie en -extractie. Klik op het apparaattype voor meer informatie over elke ultrasone homogenisator. Onze goed opgeleide en ervaren technische medewerkers helpen je graag bij het kiezen van de meest geschikte ultrasoonapparaat voor jouw monstervoorbereiding!
| Batchvolume | Debiet | Aanbevolen apparaten |
|---|---|---|
| tot 10 flesjes of buisjes | n.v.t. | VialTweeter |
| multiwell/microtiterplaten | n.v.t. | UIP400MTP |
| meerdere buizen/vaten | n.v.t. | kopshoorn |
| 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min | UP100H |
| 10 tot 1000 ml | 20 tot 200 ml/min | UP200Ht, UP200St |
| 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min | UP400St |
Afhankelijk van je toepassing, materiaal en monstervolume zullen we je de meest geschikte opstelling aanbevelen voor je monstervoorbereiding. Neem vandaag nog contact met ons op!
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!
Hielscher digitale ultrasone apparaten zijn voorzien van een browser-afstandsbediening en automatische gegevensprotocollering op een geïntegreerde SD-kaart.
VialTweeter voor indirecte sonicatie.
Wetenswaardigheden
proteomica
Proteomics is het onderzoeksveld dat eiwitten en het proteoom onderzoekt. Eiwitten vervullen een groot aantal vitale functies in organismen. Het proteoom is de volledige verzameling eiwitten die op een bepaald moment tot expressie komen in een genoom, cel, weefsel of organisme. Het proteoom varieert met de tijd en de verschillende eisen, of stressfactoren, die een cel of organisme ondergaat. Meer specifiek is het de verzameling eiwitten die tot expressie komen in een bepaald type cel of organisme, op een bepaald moment, onder bepaalde omstandigheden. De term is een mix van eiwitten en genoom. Proteomics is de studie van het proteoom.
eiwit
Eiwitten zijn grote biomoleculen, zogenaamde macromoleculen – die zijn samengesteld uit een of meer lange ketens van aminozuurresiduen. Eiwitten zijn aanwezig in alle organismen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong en ze zijn cruciaal voor de meeste biologische functies. Omdat eiwitten veel biologische informatie bevatten, worden ze geëxtraheerd voor analytische doeleinden, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek. De belangrijkste functies die eiwitten uitvoeren zijn de katalyse van metabolische reacties, DNA replicatie, reactie op stimuli en het transport van moleculen van de ene locatie naar de andere. Eiwitten verschillen voornamelijk van elkaar door hun volgorde van aminozuren, die wordt bepaald door de nucleotidevolgorde van hun genen, en die meestal resulteert in eiwitvouwing tot een specifieke driedimensionale structuur die de activiteit bepaalt. Eiwitten zijn – naast peptiden – een van de belangrijkste bestanddelen van voedsel. Daarom is proteomics een krachtig hulpmiddel in de voedingswetenschap voor het optimaliseren van processen, voedselveiligheid en voedingsbeoordeling.
Cloud Point Extraction
Cloud Point Extraction is een pre-analytische procedure om analyten te scheiden en vooraf te concetreren. In combinatie met ultrasone trillingen kan wolkpuntextractie worden geïntensiveerd, waardoor het proces efficiënter, sneller en milieuvriendelijker wordt. Met ultrasoon is wolkpuntextractie een aanzienlijk efficiëntere methode om analyten voor te bereiden. Lees meer over ultrasoon ondersteunde wolkenpuntextractie!Gelelektroforese
Gelelektroforese is de belangrijkste methode voor scheiding en analyse van macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten en hun fragmenten op basis van hun grootte en lading. Het wordt gebruikt in de klinische chemie om eiwitten te scheiden op basis van lading en/of grootte (IEF agarose, in wezen grootteonafhankelijk) en in de biochemie, moleculaire biologie en proteomica om een gemengde populatie van DNA- en RNA-fragmenten te scheiden op basis van lengte, om de grootte van DNA- en RNA-fragmenten te schatten of om eiwitten te scheiden op basis van lading.
celculturen
Celkweek is het gecontroleerde groeiproces waarbij cellen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt. De omstandigheden voor celkweek verschillen per celtype. Over het algemeen bestaat de omgeving van een celkweek uit een geschikt vat (bijvoorbeeld een petrischaal) met substraat of medium dat de essentiële voedingsstoffen (aminozuren, koolhydraten, vitaminen, mineralen), groeifactoren, hormonen en gassen (CO2, O2) en regelt de fysiochemische omgeving (pH-buffer, osmotische druk, temperatuur). De meeste cellen hebben een oppervlak of kunstmatig substraat nodig, terwijl andere celculturen vrij zwevend in een kweekmedium kunnen worden gekweekt (suspensiekweek, celsuspensie).
Massakweken van dierlijke cellijnen worden gebruikt bij de industriële productie van virale vaccins en andere biotechnologisch afgeleide producten. Menselijke stamcellen worden gekweekt om het aantal cellen uit te breiden en de cellen te differentiëren in verschillende somatische celtypen voor transplantatiedoeleinden.
Weefselmonsters
De term weefsel beschrijft een cellulaire tussenvorm, waarbij het celmateriaal zich op een organisatieniveau bevindt tussen cellen en een compleet orgaan. In weefsel worden gelijksoortige cellen, van dezelfde oorsprong die samen een specifieke functie uitvoeren, samengevoegd. Door de functionele groepering van meerdere weefsels worden de complexe structuren van organen gevormd.
Weefsel wordt afgenomen voor onderzoek in de biologie, histologie/histopathologie, parasitologie, biochemie, immunohistochemie en om DNA te kweken en te extraheren. Er kan onderscheid worden gemaakt tussen dierlijk (onderverdeling: weefsel van zoogdieren) en plantaardig weefsel. Dierlijke weefsels worden gegroepeerd in de vier basistypen bindweefsel, spierweefsel, zenuwweefsel en epitheelweefsel. Plantenweefsel wordt onderverdeeld in de volgende drie weefselsystemen: de opperhuid, het grondweefsel en het vaatweefsel.
Weefselmonsters kunnen bereid worden uit dierlijke of plantaardige delen, bijvoorbeeld botten, spieren, bladeren, enz.
Lichaamsvloeistoffen
Bloed, serum, plasma, cerebrospinaal vocht, speeksel en gewrichtsvloeistof zijn lichaamsvloeistoffen die een grote bron van diagnostisch relevante informatie bieden. Daarom is een geavanceerde voorbereiding van lichaamsvloeistofmonsters voor analyse belangrijk. De eerste moeilijkheid heeft te maken met het brede dynamische bereik van componenten die aanwezig zijn in lichaamsvloeistoffen.
Bepaling van de eiwitconcentratie
Bradford assay, Lowry assay en Bicinchoninezuur (BCA) assay zijn veelgebruikte assays om de concentratie van eiwitten te bepalen. Bovine serum albumine (BSA) is een van de meest gebruikte eiwitstandaards.
lysisbuffer
De lysisbuffer moet gekozen worden in overeenstemming met het celmateriaal of weefsel (weefselkweek, plant, bacterie, schimmel, enz.), en of de cellen zich in een structuur bevinden en het type structuur. Een breed scala aan lysisbuffers voor extractie van eiwitten, membranen en organellen wordt geformuleerd met een of meer detergenten. Het detergens wordt meestal geselecteerd door middel van trial-and-error-tests of – indien beschikbaar – volgens een bestaand eiwitextractieprotocol. Het detergens moet compatibel zijn met de weefselbron en de eiwitten. In het algemeen wordt het mildste detergens gekozen dat werkt voor een specifiek weefsel/eiwit om de maximale functionaliteit van het extract te behouden. Bovendien, in het geval van extractie van membranen en organellen, houdt een mild detergens het membraan intact. Veel gebruikte detergenten in lysisbuffers zijn meestal niet-ionisch of zwitterionisch, bijvoorbeeld CHAPS, deoxycholaat, Triton™ X-100, NP40 en Tween 20.
Weefsels zoals hersenen, lever, darmen, nieren, milt enz. kunnen bijvoorbeeld eenvoudig worden gebufferd met RIPA – proteaseremmers en DTT (bijvoorbeeld voor gelelektroforese) moeten echter wel worden meegenomen.
Lysisbuffer voor skeletspierweefsel (ijskoud): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol aangevuld met protease- en fosfatase-inhibitorcocktail.
Tabel met veelgebruikte buffers en hun pH-bereik. Over het algemeen worden deze buffers gebruikt in concentraties van 20-50 mM.
| buffer | pH-bereik |
|---|---|
| Citroenzuur – NaOH | 2.2 – 6.5 |
| Natriumcitraat – Citroenzuur | 3.0 – 6.2 |
| Natriumacetaat – azijnzuur | 3.6 – 5.6 |
| Natriumzout van cacodylzuur – HCl | 5.0 – 7.4 |
| MES – NaOH | 5.6 – 6.8 |
| Natriumdiwaterstoffosfaat – dinatriumwaterstoffosfaat | 5.8 – 8.0 |
| imidazool – HCl | 6.2 – 7.8 |
| MOPS – KOH | 6.6 – 7.8 |
| Triëthanolaminehydrochloride – NaOH | 6.8 – 8.8 |
| Tris – HCl | 7.0 – 9.0 |
| HEPES – NaOH | 7.2 – 8.2 |
| Tricine – NaOH | 7.6 – 8.6 |
| Natriumtetraboraat – boorzuur | 7.6 – 9.2 |
| Bicine – NaOH | 7.7 – 8.9 |
| glycine – NaOH | 8.6 – 10.6 |
De meeste buffers vertonen een pH-afhankelijkheid met de temperatuur. Dit geldt vooral voor Tris-buffers. De pKa verandert van 8,06 bij 25°C tot 8,85 bij 0°C.
(pH en pKa van een buffer: pH meet de concentratie van waterstofionen in een waterige oplossing. pKa (= zure dissociatieconstante) is een verwante, maar meer specifieke maat, in die zin dat het helpt om te voorspellen hoe een molecuul zich zal gedragen bij een specifieke pH-waarde).
TRIzol
TRIzol is een chemische oplossing die gebruikt wordt om RNA/DNA/eiwit te extraheren tijdens de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Het gebruik van ultrasoon geassisteerde TRIzol-extractie resulteert in een hoge DNA-, RNA- en eiwitopbrengst uit hetzelfde monster en overtreft daarmee andere extractiemethoden.
Literatuur/referenties
- Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates. Int J Food Sci Technol 44: 1843–1849.
- Simões, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joana D.; Nunes, Ana F.; Gomes, Sofia E.; Rodrigues, Pedro M.; Lo, Adrian C.; D’Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen N.; Borralho, Pedro M.; Rodrigues, Cecília M.P. (2013): Efficient recovery of proteins from multiple source samples after trizol or trizol LS RNA extraction and long-term storage. BMC Genomics 2013, 14:181.