Hielscher Ultrasonics
We bespreken graag uw proces.
Bel ons: +49 3328 437-420
Mail ons: info@hielscher.com

Ultrasone eiwitextractie uit weefsel- en celculturen

  • Eiwitextractie is een essentiële monstervoorbereidingsstap in proteomics.
  • Eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit plantaardig en dierlijk weefsel, gisten en micro-organismen.
  • Sonificatie is een betrouwbare, efficiënte methode voor eiwitextractie die een hoge eiwitopbrengst geeft binnen een korte extractietijd.

Eiwitwinning uit weefsels en cellen

Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is een essentiële monstervoorbereidingsstap die wordt uitgevoerd tijdens veel biochemische en analytische technieken zoals ELISA, PAGE, Western blotting, massaspectrometrie of eiwitzuivering. Ultrasone celdisruptie, -lyse en -extractie is een nauwkeurig regelbare, niet-thermische techniek om een hoge opbrengst aan eiwitten te garanderen.

Informatieaanvraag




Let op onze privacybeleid.




Sonde-type ultrasone apparaten zoals de UP200St zijn betrouwbare weefselhomogenisatoren en worden veel gebruikt voor monstervoorbereiding in genetisch en proteomisch onderzoek.

Eiwitextractie uit cellen met de ultrasone sonde UP200St

Voordelen van ultrasone lysis en eiwitextractie
 

  • Snel
  • hoge opbrengsten
  • Zeer efficiënt
  • Nauwkeurige controle over parameters
  • reproduceerbare resultaten
  • lineaire schaalbaarheid

Algemene instructies voor ultrasone lysis en eiwitextractie

  • Temperatuurregeling: Om een hoge eiwitopbrengst zonder thermische denaturatie te garanderen, moet de temperatuur tijdens de extractie worden geregeld. Hielscher's ultramoderne ultrasone homogenisatoren – ook ultrasone desintegrator of ultrasone reiniger genoemd – zijn nauwkeurig regelbaar. Ze worden geleverd met een insteekbare temperatuursensor. In de instelopties van de ultrasone homogenisator kan een maximumtemperatuur worden ingesteld. Als deze maximumtemperatuur is bereikt, stopt de ultrasone homogenisator automatisch totdat het monster is afgekoeld.
  • Buffer: De keuze van een geschikte buffer en het juiste volume buffer varieert van weefsel tot weefsel en moet proefondervindelijk worden bepaald.
  • Isolatie / zuivering: Eiwitlysaten kunnen een overmaat aan biomoleculen bevatten, zoals DNA of koolhydraten, die verwijderd kunnen worden door eiwitneerslag (deoxycholaat-trichloorazijnzuur) of bufferwisseling.

Chittapalo en Noomhorm (2009) rapporteerden in hun onderzoek dat de eiwitopbrengst toenam door gebruik te maken van sonicatie en dat het ultrasone weefselhomogenisatie- en lysisproces bestaande extractieprocessen aanzienlijk kan verbeteren. – nieuwe commerciële ontginningsmogelijkheden mogelijk maken.
 

Ultrasone CupHorn voor het gelijktijdig prepareren van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden voor eiwitisolatie en DNA-fragmentatie.

Ultrasone kopHoorn voor de gelijktijdige, zeer efficiënte preparatie van meerdere monsters onder dezelfde omstandigheden voor eiwitisolatie en DNA-fragmentatie.

Eiwitwinning uit dierlijk weefsel

Ultrasonicator UP100H is een laboratoriumhomogenisator die vaak wordt gebruikt voor monstervoorbereiding van celkweekplaten.Voor de bereiding van weefsel van hele afmetingen (bv. nier, hart, long, spier enz.) moet het weefsel in zeer kleine stukjes worden ontleed met schoon gereedschap, bij voorkeur op ijs en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen te voorkomen (bv. lysisbuffer zoals RIPA of hypotone lysisbuffer met protease- en fosfataseremmercocktail). Na het ontleden wordt het monster ondergedompeld in vloeibare stikstof voor snap freeze. Het monster kan worden opgeslagen bij -80°C voor later gebruik of worden bewaard op ijs voor onmiddellijke homogenisatie. Onmiddellijk voor de ultrasone extractie wordt ijskoude lysisbuffer (met proteaseremmers DTT, leupeptine en aprotinine) snel toegevoegd in de monsterbuis (per ~ 10 mg weefsel ca. ~ 600 ul buffer worden aanbevolen). Ca. 20-60 mg weefsel wordt aanbevolen per monsterbuis.
Ultrasone homogenisatie, lysis en extractie worden uitgevoerd met een ultrasone homogenisator zoals de UP100H of UP200Ht, uitgerust met een microtip sonotrode. De duur van de sonificatie is 60-90 sec. bij een ultrasone cyclusmodus van 15 sec. sonificatie en 10 sec. rusttijd. Het monster moet de hele tijd in ijs worden bewaard.
Na ultrasone homogenisatie / extractie wordt het lysaat gecentrifugeerd bij 27.000 g gedurende ongeveer 20 minuten. Daarna wordt het supernatent verzameld, zodat de eiwitconcentratie kan worden bepaald met een eiwitassay zoals Pierce protein assay BCA.

Eiwitwinning uit bloedserum

Voor een homogeen mengsel van het serum en de fosfaatbuffer wordt het monster eerst gevortexd vóór de ultrasone cellyse. Voor de ultrasone lysis wordt het monster gesonitiseerd met een ultrasone laboratoriumhomogenisator zoals de UP100H gedurende 8 cycli bij 20% amplitude, gedurende cycli van telkens 5 seconden aan en 15 seconden uit. Eiwitextractie wordt uitgevoerd door in cycli te sonificeren (pulsatiemodus) en door het monster op ijs te plaatsen zodat oververhitting en thermische degradatie van het monster wordt voorkomen. Aangezien serum een grote hoeveelheid eiwitten met een hoog molecuulgewicht bevat (zoals albumine, α1-antitrypsine, transferrine, haptoglobuline, immunoglobuline G en immunoglobuline A), die interfereren met de scheiding van eiwitten met een laag molecuulgewicht tijdens IEF, wordt aanbevolen deze uit het serum te verwijderen met behulp van een depletiekolom.

Eiwitwinning uit plantenweefsel

Vers, zacht plantenweefsel, bijvoorbeeld mos, kan eenvoudig worden ontleed door het fijngehakte monstermateriaal in lysisbuffer te plaatsen voor sonicatie. Taai, ligenachtig plantenweefsel, zoals zaden, dennennaalden etc., moet droog vermalen worden. Sommige harde, houtachtige plantmaterialen moeten worden bevroren en vermalen in vloeibare stikstof voordat ze met sonicatie worden geëxtraheerd. Voor celsuspensies van planten is een ultrasone behandeling tussen 30 en 150 seconden in een lysisbuffer meestal voldoende. Taaiere materialen zoals pompoenpitten vereisen een intensievere sonicatie zoals hieronder beschreven.
 

Deze tutorial legt uit welk type sonicator het beste is voor uw taken op het gebied van monstervoorbereiding, zoals lysis, celdisruptie, eiwitisolatie, DNA- en RNA-fragmentatie in laboratoria, analyse en onderzoek. Kies het ideale type sonicator voor uw toepassing, monstervolume, aantal monsters en verwerkingscapaciteit. Hielscher Ultrasonics heeft de ideale ultrasone homogenisator voor u!

De perfecte Sonicator vinden voor celdisruptie en eiwitextractie in wetenschap en analyse

Video miniatuur

 

Protocol voor ultrasone extractie van albumine uit pompoenpitten

Ultrasone weefselhomogenisator UP400St met S24d40 - voor eiwitextractie uit plantaardig en dierlijk weefsel (Klik om te vergroten!)Voor de ultrasone eiwitextractie van albumine uit fijngemalen pompoenzaadpoeder worden 10 g ontvet pompoenzaadpoeder en 100 ml gedeïoniseerd water als oplosmiddel toegevoegd in een glazen bekerglas van 250 ml. De eiwitextractie bestaat uit twee stappen: Eerst wordt het monster gesonitiseerd met een ultrasone sensor UP400St (400 W, 24 kHz) uitgerust met sonotrode S24d7. Het glazen bekerglas wordt tijdens de ultrasone homogenisatie in een koud waterbad geplaatst. De insteekbare temperatuursensor en temperatuurregelingsinstellingen van de ultrasoon UP400St zorgen ervoor dat de temperatuur van het monster altijd onder 30°C wordt gehouden. Door de nauwkeurige temperatuurregeling tijdens sonicatie wordt denaturatie van albumine voorkomen. Ten tweede werd de extractie uitgevoerd met een mixer op een snelheid van 200 rpm en bij 30°C. Daarna wordt het bekerglas overgebracht in een thermostatisch schudapparaat. Globuline wordt verwijderd via dialyse met gedestilleerd water. Na de globulineverwijdering kan het eiwitextract worden bemonsterd voor het bepalen van het albuminegehalte en wordt het vervolgens met 0,1 M HCl voor albuminecoagulatie op pI=3,0 gebracht. De vaste fase wordt gescheiden door centrifugeren bij 5000g, 20°C en opnieuw opgelost in gedeïoniseerd water. De albuminecoagulatie wordt twee keer uitgevoerd om de eiwitverhouding in het albumineconcentraat te verhogen.

Ultrasone alkalische eiwitextractie voor de bereiding van eiwitconcentraat uit rijstzemelen toont aan dat de ultrasone behandeling resulteert in een hogere eiwitopbrengst in een aanzienlijk kortere extractietijd. – vergeleken met conventionele extractiemethoden.

Deze videoclip toont de Hielscher ultrasone homogenisator UP100H, een ultrasoonapparaat dat veel wordt gebruikt voor monstervoorbereiding in laboratoria.

Ultrasone Homogenisator UP100H

Video miniatuur

Monsterbereidingsprotocol voor functioneel iNOS-enzym

Om volledig functioneel iNOS-enzym te verkrijgen (bijvoorbeeld voor het screenen van geneesmiddelen), wordt het volgende protocol aanbevolen: De celsuspensie moet op ijs worden geplaatst en wordt gesoneerd met een UP100H met een amplitude van 10 µm bij een cyclusmodus van 5 sec. sonicatie en 25 sec. rust op ijs. De procedure moet ongeveer 3 keer worden herhaald. De rusttijd tussen de sonicatiecycli vermindert de temperatuurstijging en verkleint daardoor het risico op denaturatie.

Ultrasone eiwitoplosbaarheid

Sonificatie kan het proces van eiwitoplosbaarheid, dat gewoonlijk enkele uren in beslag neemt, versnellen. Om het monster niet te oververhitten en afbraak van eiwitten en modificaties in oplossingen met ureum te voorkomen, mogen de ultrasone uitbarstingen niet langer dan enkele seconden duren.

De VialTweeter is een uniek ultrasoon systeem voor gelijktijdige sonificatie van maximaal 10 flacons onder exact dezelfde omstandigheden zonder kruisbesmetting.

UP200St met VialTweeter voor sonificatie van gesloten flacons

Video miniatuur

Ultrasone UP200Ht met microtip S26d2 voor ultrasone lysis van biologische monsters

Ultrasone UP200Ht met 2 mm microtip S26d2 voor sonicatie van kleine monsters.

Ultrasone apparatuur voor eiwitextractie

Hielscher Ultrasonics biedt een breed assortiment ultrasone homogenisatoren voor het desintegreren van cellen, weefsels, bacteriën, micro-organismen, gist en sporen.
Hielscher laboratorium ultrasone apparaten zijn krachtig en eenvoudig te bedienen. Ze zijn gebouwd voor 24/7 gebruik en ontworpen als robuuste en efficiënte laboratorium- en tafelmodellen. Voor alle apparaten geldt dat de energieafgifte en de amplitude nauwkeurig kunnen worden geregeld. Het brede assortiment accessoires biedt nog meer instelmogelijkheden. De digitale ultrasone apparaten zoals de VialTweeter, UP200Ht, UP200St en UP400St hebben een geïntegreerde temperatuurregeling en een ingebouwde SD-kaart voor automatische gegevensregistratie.
Voor indirecte, kruisbesmettingsvrije en gelijktijdige sonicatie van meerdere monsters bieden we de VialTweeter of de ultrasone CupHorn.
De onderstaande tabel geeft je een overzicht van onze ultrasone apparaten voor monstervoorbereiding, celdisruptie en -extractie. Klik op het apparaattype voor meer informatie over elke ultrasone homogenisator. Onze goed opgeleide en ervaren technische medewerkers helpen je graag bij het kiezen van de meest geschikte ultrasoonapparaat voor jouw monstervoorbereiding!
 

Batchvolume Debiet Aanbevolen apparaten
tot 10 flesjes of buisjes n.v.t. VialTweeter
multiwell/microtiterplaten n.v.t. UIP400MTP
meerdere buizen/vaten n.v.t. kopshoorn
1 tot 500 ml 10 tot 200 ml/min UP100H
10 tot 1000 ml 20 tot 200 ml/min UP200Ht, UP200St
10 tot 2000 ml 20 tot 400 ml/min UP400St

Afhankelijk van je toepassing, materiaal en monstervolume zullen we je de meest geschikte opstelling aanbevelen voor je monstervoorbereiding. Neem vandaag nog contact met ons op!

Neem contact met ons op! / Vraag het ons!

Meer informatie aanvragen

Gebruik het onderstaande formulier om meer informatie aan te vragen over ultrasone homogenisatoren, toepassingen in biotech en proteomics en prijzen. We bespreken graag uw celdisruptie- en eiwitextractieproces met u en bieden u een ultrasone homogenisator die aan uw eisen voldoet!









Let op onze privacybeleid.




 

De video toont het ultrasone monstervoorbereidingssysteem UIP400MTP, waarmee op betrouwbare wijze monsters kunnen worden voorbereid van standaard multi-well platen met ultrasoon geluid van hoge intensiteit. Typische toepassingen van de UIP400MTP zijn cellyse, DNA-, RNA- en chromatineafschuiving en eiwitextractie.

Ultrasone UIP400MTP voor sonicatie van multi-wellplaten

Video miniatuur

Hielscher ultrasone machines kunnen op afstand worden bediend via browserbesturing. Sonicatieparameters kunnen worden bewaakt en nauwkeurig worden aangepast aan de procesvereisten.

Hielscher digitale ultrasone apparaten zijn voorzien van een browser-afstandsbediening en automatische gegevensprotocollering op een geïntegreerde SD-kaart.

Ultrasoon apparaat VialTweeter voor eiwitextractie uit weefselmonsters (Klik om te vergroten!)

VialTweeter voor indirecte sonicatie.



Wetenswaardigheden

proteomica

Proteomics is het onderzoeksveld dat eiwitten en het proteoom onderzoekt. Eiwitten vervullen een groot aantal vitale functies in organismen. Het proteoom is de volledige verzameling eiwitten die op een bepaald moment tot expressie komen in een genoom, cel, weefsel of organisme. Het proteoom varieert met de tijd en de verschillende eisen, of stressfactoren, die een cel of organisme ondergaat. Meer specifiek is het de verzameling eiwitten die tot expressie komen in een bepaald type cel of organisme, op een bepaald moment, onder bepaalde omstandigheden. De term is een mix van eiwitten en genoom. Proteomics is de studie van het proteoom.

eiwit

Eiwitten zijn grote biomoleculen, zogenaamde macromoleculen – die zijn samengesteld uit een of meer lange ketens van aminozuurresiduen. Eiwitten zijn aanwezig in alle organismen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong en ze zijn cruciaal voor de meeste biologische functies. Omdat eiwitten veel biologische informatie bevatten, worden ze geëxtraheerd voor analytische doeleinden, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek. De belangrijkste functies die eiwitten uitvoeren zijn de katalyse van metabolische reacties, DNA replicatie, reactie op stimuli en het transport van moleculen van de ene locatie naar de andere. Eiwitten verschillen voornamelijk van elkaar door hun volgorde van aminozuren, die wordt bepaald door de nucleotidevolgorde van hun genen, en die meestal resulteert in eiwitvouwing tot een specifieke driedimensionale structuur die de activiteit bepaalt. Eiwitten zijn – naast peptiden – een van de belangrijkste bestanddelen van voedsel. Daarom is proteomics een krachtig hulpmiddel in de voedingswetenschap voor het optimaliseren van processen, voedselveiligheid en voedingsbeoordeling.

Cloud Point Extraction

Cloud Point Extraction is een pre-analytische procedure om analyten te scheiden en vooraf te concetreren. In combinatie met ultrasone trillingen kan wolkpuntextractie worden geïntensiveerd, waardoor het proces efficiënter, sneller en milieuvriendelijker wordt. Met ultrasoon is wolkpuntextractie een aanzienlijk efficiëntere methode om analyten voor te bereiden. Lees meer over ultrasoon ondersteunde wolkenpuntextractie!

Gelelektroforese

Gelelektroforese is de belangrijkste methode voor scheiding en analyse van macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten en hun fragmenten op basis van hun grootte en lading. Het wordt gebruikt in de klinische chemie om eiwitten te scheiden op basis van lading en/of grootte (IEF agarose, in wezen grootteonafhankelijk) en in de biochemie, moleculaire biologie en proteomica om een gemengde populatie van DNA- en RNA-fragmenten te scheiden op basis van lengte, om de grootte van DNA- en RNA-fragmenten te schatten of om eiwitten te scheiden op basis van lading.

celculturen

Celkweek is het gecontroleerde groeiproces waarbij cellen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt. De omstandigheden voor celkweek verschillen per celtype. Over het algemeen bestaat de omgeving van een celkweek uit een geschikt vat (bijvoorbeeld een petrischaal) met substraat of medium dat de essentiële voedingsstoffen (aminozuren, koolhydraten, vitaminen, mineralen), groeifactoren, hormonen en gassen (CO2, O2) en regelt de fysiochemische omgeving (pH-buffer, osmotische druk, temperatuur). De meeste cellen hebben een oppervlak of kunstmatig substraat nodig, terwijl andere celculturen vrij zwevend in een kweekmedium kunnen worden gekweekt (suspensiekweek, celsuspensie).
Massakweken van dierlijke cellijnen worden gebruikt bij de industriële productie van virale vaccins en andere biotechnologisch afgeleide producten. Menselijke stamcellen worden gekweekt om het aantal cellen uit te breiden en de cellen te differentiëren in verschillende somatische celtypen voor transplantatiedoeleinden.

Weefselmonsters

De term weefsel beschrijft een cellulaire tussenvorm, waarbij het celmateriaal zich op een organisatieniveau bevindt tussen cellen en een compleet orgaan. In weefsel worden gelijksoortige cellen, van dezelfde oorsprong die samen een specifieke functie uitvoeren, samengevoegd. Door de functionele groepering van meerdere weefsels worden de complexe structuren van organen gevormd.
Weefsel wordt afgenomen voor onderzoek in de biologie, histologie/histopathologie, parasitologie, biochemie, immunohistochemie en om DNA te kweken en te extraheren. Er kan onderscheid worden gemaakt tussen dierlijk (onderverdeling: weefsel van zoogdieren) en plantaardig weefsel. Dierlijke weefsels worden gegroepeerd in de vier basistypen bindweefsel, spierweefsel, zenuwweefsel en epitheelweefsel. Plantenweefsel wordt onderverdeeld in de volgende drie weefselsystemen: de opperhuid, het grondweefsel en het vaatweefsel.
Weefselmonsters kunnen bereid worden uit dierlijke of plantaardige delen, bijvoorbeeld botten, spieren, bladeren, enz.

Lichaamsvloeistoffen

Bloed, serum, plasma, cerebrospinaal vocht, speeksel en gewrichtsvloeistof zijn lichaamsvloeistoffen die een grote bron van diagnostisch relevante informatie bieden. Daarom is een geavanceerde voorbereiding van lichaamsvloeistofmonsters voor analyse belangrijk. De eerste moeilijkheid heeft te maken met het brede dynamische bereik van componenten die aanwezig zijn in lichaamsvloeistoffen.

Bepaling van de eiwitconcentratie

Bradford assay, Lowry assay en Bicinchoninezuur (BCA) assay zijn veelgebruikte assays om de concentratie van eiwitten te bepalen. Bovine serum albumine (BSA) is een van de meest gebruikte eiwitstandaards.

lysisbuffer

De lysisbuffer moet gekozen worden in overeenstemming met het celmateriaal of weefsel (weefselkweek, plant, bacterie, schimmel, enz.), en of de cellen zich in een structuur bevinden en het type structuur. Een breed scala aan lysisbuffers voor extractie van eiwitten, membranen en organellen wordt geformuleerd met een of meer detergenten. Het detergens wordt meestal geselecteerd door middel van trial-and-error-tests of – indien beschikbaar – volgens een bestaand eiwitextractieprotocol. Het detergens moet compatibel zijn met de weefselbron en de eiwitten. In het algemeen wordt het mildste detergens gekozen dat werkt voor een specifiek weefsel/eiwit om de maximale functionaliteit van het extract te behouden. Bovendien, in het geval van extractie van membranen en organellen, houdt een mild detergens het membraan intact. Veel gebruikte detergenten in lysisbuffers zijn meestal niet-ionisch of zwitterionisch, bijvoorbeeld CHAPS, deoxycholaat, Triton™ X-100, NP40 en Tween 20.
Weefsels zoals hersenen, lever, darmen, nieren, milt enz. kunnen bijvoorbeeld eenvoudig worden gebufferd met RIPA – proteaseremmers en DTT (bijvoorbeeld voor gelelektroforese) moeten echter wel worden meegenomen.
Lysisbuffer voor skeletspierweefsel (ijskoud): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w/v) glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol aangevuld met protease- en fosfatase-inhibitorcocktail.
Tabel met veelgebruikte buffers en hun pH-bereik. Over het algemeen worden deze buffers gebruikt in concentraties van 20-50 mM.
 

buffer pH-bereik
Citroenzuur – NaOH 2.2 – 6.5
Natriumcitraat – Citroenzuur 3.0 – 6.2
Natriumacetaat – azijnzuur 3.6 – 5.6
Natriumzout van cacodylzuur – HCl 5.0 – 7.4
MES – NaOH 5.6 – 6.8
Natriumdiwaterstoffosfaat – dinatriumwaterstoffosfaat 5.8 – 8.0
imidazool – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
Triëthanolaminehydrochloride – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
Natriumtetraboraat – boorzuur 7.6 – 9.2
Bicine – NaOH 7.7 – 8.9
glycine – NaOH 8.6 – 10.6

De meeste buffers vertonen een pH-afhankelijkheid met de temperatuur. Dit geldt vooral voor Tris-buffers. De pKa verandert van 8,06 bij 25°C tot 8,85 bij 0°C.
(pH en pKa van een buffer: pH meet de concentratie van waterstofionen in een waterige oplossing. pKa (= zure dissociatieconstante) is een verwante, maar meer specifieke maat, in die zin dat het helpt om te voorspellen hoe een molecuul zich zal gedragen bij een specifieke pH-waarde).

TRIzol

TRIzol is een chemische oplossing die gebruikt wordt om RNA/DNA/eiwit te extraheren tijdens de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Het gebruik van ultrasoon geassisteerde TRIzol-extractie resulteert in een hoge DNA-, RNA- en eiwitopbrengst uit hetzelfde monster en overtreft daarmee andere extractiemethoden.

Literatuur/referenties

We bespreken graag uw proces.

Let's get in contact.