Hielscher Echografietechniek

Ultrasone Eiwitextractie van Tissue en Cell Cultures

  • Eiwitextractie is een essentiële stap in monstervoorbereiding proteomics.
  • Eiwitten kunnen worden geëxtraheerd uit plantaardige en dierlijk weefsel, gisten en micro-organismen.
  • Sonicatie is een betrouwbare, efficiënte proteïne-extractie methode die eiwitrijk opbrengsten binnen een korte extractietijd.

 

Eiwitwinning uit weefsels en cellen

Eiwitextractie van weefsels en gekweekte cellen is essentieel monstervoorbereiding stap die wordt uitgevoerd gedurende vele biochemische en technieken zoals ELISA, PAGE, Western blotting, Massaspectrometrie of eiwitzuivering. ultrasonore celdisruptie, lysis en extractie is een nauwkeurig regelbaar techniek naar hoge opbrengsten aan eiwit.

Eiwitextractie uit dierlijk weefsel

Voor de vervaardiging van weefsel van volledige grootte (bijv. Nier, hart, longen, spieren enz.), Moet het weefsel in zeer kleine stukjes worden gesneden met schoon gereedschap, bij voorkeur op ijs en zo snel mogelijk om afbraak door proteasen (bijv. lysisbuffer zoals RIPA of hypotonische lysisbuffer bevattende cocktail van protease en fosfatase-remmer). Na het ontleden wordt het monster ondergedompeld in vloeibare stikstof voor snelvriezen. Het monster kan worden bewaard bij -80 ° C voor later gebruik of op ijs worden bewaard voor onmiddellijke homogenisatie. Direct voor de ultrasone extractie wordt ijskoude lysisbuffer (met proteaseremmers DTT, leupeptine en aprotinine) snel aan de monsterbuis toegevoegd (per ~ 10 mg weefsel wordt ongeveer - 600 μL buffer aanbevolen). Ong. Per monsterbuis wordt 20-60 mg weefsel aanbevolen.
Ultrasone homogenisatie, lysis en extractie wordt uitgevoerd met een ultrasone homogenisator zoals de Uf200 ः t of UP200St, Uitgerust met een micro-tip sonotrode. duur Sonicatie 60-90 sec. met een ultrasone cyclusmodus van 15 sec. sonificatie en 10 sec. rusttijd. Het monster moet in ijs worden gehouden de hele tijd.
Na ultrasoon homogenisatie / extractie wordt het lysaat gecentrifugeerd bij 27.000 g gedurende ca.. 20 minuten. Daarna werd het supernatans opgevangen, waardoor de eiwitconcentratie door eiwitbepaling kan worden bepaald zoals Pierce BCA-eiwitbepaling.

Eiwitconcentratie is een belangrijke methode van monstervoorbereiding

Ultrasone proteïne-extractie uit cellen met UP200St

Informatieaanvraag




Let op onze Privacybeleid.


Eiwitextractie uit bloedserum

Voor een homogeen mengsel van het serum en de fosfaatbuffer wordt het monster eerst gewerveld voor lysis van de ultrasone cel. Voor de ultrasone lysis wordt het monster gesoniceerd met een ultrasone laboratoriumhomogenisator zoals de UP100H 8 cycli bij 20% amplitude gedurende cycli van 5 seconden aan en 15 seconden uit. Sonocation wordt uitgevoerd door sonicationg cyclisch en door het monster op ijs, zodat een oververhitting en thermische afbraak van het monster voorkomen worden. Aangezien serum bevat een grote hoeveelheid hoogmoleculaire eiwitten (zoals albumine, α1-antitrypsine, transferrine, haptoglobulin, immunoglobuline G en immunoglobuline A), die interfereren met de scheiding van eiwitten met laag molecuulgewicht bij IEF wordt aanbevolen om ze afbreken uit het serum met behulp van een depletie kolom.

Eiwitextractie uit plantenweefsel

Verse, zachte plantenweefsel, b.v. mos etc., kan gemakkelijk worden verstoord door gewoon de gehakte monstermateriaal in lysisbuffer sonicatie. Taaie, ligenous plantenweefsels, zoals zaden, dennennaalden enz., Moet droog worden gemalen. Sommige vaste, houtachtige plantaardige materiaal moet worden ingevroren en gemalen in vloeibare stikstof voordat geëxtraheerd door sonicatie. Voor plantencelcultuur suspensies, een ultrasone behandeling van 30 en 150 seconden in een lysisbuffer meestal voldoende. Strengere materiaal zoals pompoenpitten vereisen een meer intense ultrasoonapparaat zoals hieronder beschreven.

Protocol voor ultrasone extractie van albumine uit pompoenpitten

Ultrasone weefselhomogenisator UP400St met S24d40 - voor het eiwit extractie uit plantaardig en dierlijk weefsel (klik om te vergroten!)Voor het ultrasone eiwitextractie albumine uit fijngemalen pompoenpitten poeder, 10 g ontvet pompoenzaad poeder en 100 ml gedeïoniseerd water als oplosmiddel worden toegevoegd in een 250 ml bekerglas. De eiwitextractie bestaat uit twee stappen: Eerst wordt het monster gesonificeerd met een probe-type ultrasonicator UP400St (400W, 24kHz) met gemonteerde sonotrode S24d7. Het bekerglas werd in een koud waterbad gedurende de ultrasone homogenisatie. De de instelling van de ultrasonicator UP400St met de plugbare temperatuursensor zorgt ervoor dat de temperatuur van het monster altijd onder de 30 ° C wordt gehouden. Door de precieze temperatuurregeling tijdens sonicatie wordt een denaturatie van albumine vermeden. Ten tweede werd extractie uitgevoerd met een menger bij 200 rpm snelheid en bij 30 ° C. Daarna wordt de beker overgebracht in een thermostatische schudinrichting. Globuline wordt verwijderd via dialyse met gedestilleerd water. Na de verwijdering van globuline kan het eiwitextract worden bemonsterd voor bepaling van het albumineprofiel en wordt vervolgens aangepast tot pI = 3,0 met 0,1 M HCl voor albumine-coagulatie. De vaste fase wordt gescheiden door centrifugatie bij 5000 g, 20 ° C en opnieuw opgelost in gedeïoniseerd water. Albumine-coagulatie wordt tweemaal uitgevoerd om de eiwitverhouding in het albumineconcentraat te verhogen.

Ultrasone alkaline eiwitextractie voor de bereiding van eiwitconcentraat uit rijstzemelen blijkt dat de ultrasone behandeling resulteert in hogere opbrengst eiwit in een significant kortere extractietijd – vergeleken met conventionele extractiewerkwijzen.

Ultrasoon apparaat VialTweeter voor eiwit-extractie uit weefselmonsters (klik om te vergroten!)

VialTweeter voor indirecte ultrasoonapparaat.

voordelen

  • snel
  • hoge opbrengsten
  • zeer efficiënt
  • Nauwkeurige controle over parameters
  • reproduceerbare resultaten
  • lineaire schaalbaarheid

Monstervoorbereiding protocol voor functionele iNOS enzym

Volledig functioneel iNOS enzym (bijvoorbeeld voor drug discovery) te verkrijgen, wordt het volgende protocol aanbevolen: De celsuspensie moet op ijs en ultrasone trillingen worden gebracht met een UP100H bij 10 urn amplitude bij cyclusmodus van 5 sec. sonificatie en 25 sec. rusten op ijs. De procedure moet ongeveer worden herhaald. Drie keer. De rusttijd tussen sonicatie cycli verlaagt de temperatuurverhoging en daardoor het risico van denaturatie.

Ultrasone Protein Het oplosbaar

De sonicatie kan het eiwit oplosbaar proces, dat gewoonlijk verscheidene uren vergt versnellen. Om het monster niet oververhit raken en gaan eiwitafbraak en modificaties in oplossingen die ureum, moeten de ultrasone bursts niet langer dan enkele seconden.

Algemene instructies

Temperatuurregeling: Om een ​​hoge opbrengst proteïne zonder thermische denaturatie te garanderen, moet de temperatuur tijdens de extractie worden geregeld. Hielscher state-of-art ultrasone homogenisatoren – ook wel ultrasone desintegrator of sonificator – zijn precies bestuurbaar. Ze hebben een inplugbare temperatuursensor. In de instelmogelijkheden van de ultrasone homogenisator, kan een maximale temperatuur instelbaar. Wanneer deze max is bereikt, de ultrasonicator automatisch gestopt totdat het monster afgekoeld.
Buffer: De keuze van een geschikte buffer en het juiste volume buffer varieert van weefsel tot weefsel en moet bedacht-out door trial-and-error tests.
Isolatie / zuivering: Proteïnelysaten kan een overmaat van biomoleculen zoals DNA of koolhydraten, die kunnen worden verwijderd door eiwitneerslag (deoxycholaat-trichloorazijnzuur) verwezen of bufferuitwisseling.

Chittapalo en Noomhorm (2009) dat eiwitrendement verhoogd middels sonicatie en de ultrasone weefsel homogenisatie en lysis werkwijze bestaande extractieproces aanzienlijk kan verbeteren – waardoor naar nieuwe commerciële winning kansen.

Klinken bescherming Hielscher's geluiddempende kap SPB-L en ultrasone inrichting UP200St. (Klik om te vergroten!)

Ultrasone weefselhomogenisator UP200St efficiënte eiwitextractie

Nauwkeurige controle van de ultrasone behandeling (klik om te vergroten!)

Browser controle voor nauwkeurige bediening en bewaking van de ultrasoonapparaat proces

Ultrasone apparatuur voor Protein Extraction

Hielscher Ultrasonics hebben een breed scala van ultrasone homogenisatoren voor de desintegratie van cellen, weefsel, bacteriën, micro-organismen, gisten en sporen.
Hielscher lab ultrasonicators zijn krachtig en eenvoudig te bedienen. Gebouwd voor 24/7 gebruik, ze zijn ontworpen als robuuste en efficiënte lab en bench-top apparaten. Voor alle inrichtingen, kan de energieopbrengst en de amplitude nauwkeurig worden geregeld. De brede Accessoires opent verder instellingsopties. De digitale apparaten, zoals VialTweeter, Uf200 ः t, UP200Sten UP400St een geïntegreerde temperatuurregeling en een ingebouwde SD kaart automatische gegevensregistratie.
Voor de indirecte, kruisbesmetting-vrij en gelijktijdige behandeling met ultrageluid van meerdere monsters, bieden wij de VialTweeter of de ultrasone CupHorn.
Afhankelijk van de toepassing, materiaal en sample volume, dan raden wij u de meest geschikte instellingen voor uw sample prep. Contacteer ons vandaag nog!

Neem contact met ons op! / Vraag ons!

Gebruik het onderstaande formulier als u aanvullende informatie wilt over ultrasone homogenisatie. We zullen u graag een ultrasoon systeem aanbieden dat aan uw eisen voldoet.









Let op onze Privacybeleid.


Literatuur / Referenties

  • Chittapalo T, Noomhorm A (2009): Ultrasone bijgestaan ​​alkalische extractie van proteïne uit ontvette rijstzemelen en eigenschappen van het eiwit concentraten. Int J Food Sci Technol 44: 1843-1849.
  • Simoes, André E.S:; Pereira, Diane M.; Amaral, Joan.; Nunes Ana M.; Gomes Sofia E.; Roberts, Peter M.; Lo, Adrian C.; D'Hooge, Rudi; Steer, Clifford J.; Thibodeau, Stephen C.; Borralho, Peter M.; Rodrigues, Cecilia M. P. (2013): Efficiënte terugwinning van eiwitten uit meerdere bronnen monsters na Trizol of Trizol LS RNA-extractie en langetermijnopslag. BMC Genomics, 2013, 14: 181.


Feiten die de moeite waard zijn om te weten

proteomics

Proteomics is het onderzoeksveld dat eiwitten en het proteoom onderzoekt. Eiwitten fullfil een breed scala van vitale functies binnen organismen. Het proteoom is het geheel van eiwitten door een genoom, cel, weefsel of organisme tot expressie gebracht op een bepaald tijdstip. Het proteoom varieert met de tijd en verschillende vereisten of benadrukt dat een cel of organisme ondergaat. Meer specifiek is de verzameling van tot expressie gebrachte eiwitten in een bepaald soort cel of organisme op een bepaald moment onder gedefinieerde omstandigheden. De term is een mengsel van eiwitten en genoom. Proteomics is de studie van het proteoom.

Eiwit

Eiwitten zijn zijn grote biomoleculen, zogenaamde macromoleculen – die zijn samengesteld uit één of meer lange ketens van aminozuurresiduen. Eiwitten zijn aanwezig in alle organismen van zowel plantaardige als dierlijke oorsprong en ze zijn cruciaal voor de meeste biologische functies. Omdat eiwitten veel biologische informatie bevatten, worden ze voor analytische doeleinden geëxtraheerd, bijvoorbeeld voor proteomisch onderzoek. De belangrijkste functie die door eiwitten wordt uitgeoefend, is de katalyse van metabole reacties, DNA-replicatie, reactie op stimuli en het transport van moleculen van de ene locatie naar de andere. Eiwitten verschillen hoofdzakelijk van elkaar in hun sequentie van aminozuren, wat wordt gedicteerd door de nucleotidesequentie van hun genen en die gewoonlijk resulteert in eiwitvouwing in een specifieke driedimensionale structuur die de activiteit ervan bepaalt. Eiwitten zijn – naast peptiden – een van de belangrijkste onderdelen van voedsel. Daarom, proteomics is een krachtig instrument in voedsel wetenschap om processen, voedselveiligheid en voedingswaarde assessment te optimaliseren.

gel Elektroforese

Gelelektroforese belangrijke werkwijze voor de scheiding en analyse van macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten en hun fragmenten, op basis van hun grootte en lading. Het wordt gebruikt in klinische chemie eiwitten door lading en / of grootte gescheiden (IEF agarose, voornamelijk de maat onafhankelijk) en biochemie, moleculaire biologie en proteomics een gemengde populatie van DNA- en RNA-fragmenten gescheiden op lengte, de grootte van DNA schatten en RNA fragmenten of eiwitten te scheiden van lading.

Celculturen

Celkweek is de gecontroleerde groeiproces waarbij cellen onder gecontroleerde omstandigheden worden gekweekt. Celcultuur omstandigheden variëren voor elk type cel. Over het algemeen de omgeving van een celkweek uit een geschikt vat (bijvoorbeeld petrischaal) met substraat of medium dat essentiële voedingsstoffen (aminozuren, koolhydraten, vitaminen, mineralen), groeifactoren, hormonen levert en gassen (CO2, The2) En reguleert de fysiochemische milieu (pH-buffer, osmotische druk, temperatuur). De meeste cellen hebben een oppervlak of kunstmatig substraat, terwijl andere vrije celkweken kan worden gekweekt drijven in kweekmedium (suspensiekweek, celsuspensie).
Massa kweken van dierlijke cellijnen worden gebruikt in industriële productie van virale vaccins en andere biotechnologisch afgeleide producten. Menselijke stamcellen zijn gekweekt om het aantal cellen expanderen en differentiëren de cellen in verschillende somatische celsoorten voor transplantatiedoeleinden.

weefselmonsters

De term weefsel beschrijft een cellulair tussenproduct, waarbij het celmateriaal op organisatorisch tussen cellen en één volledig orgaan. In weefsel soortgelijke cellen van dezelfde oorsprong die tezamen een specifieke functie verrichten, worden geassembleerd. Door de functionele groepering van meerdere weefsels, worden de complexe structuren van organen gevormd.
Weefsel wordt bemonsterd voor onderzoek in de biologie, histologie / histopathologie, parasitologie, biochemie, immunohistochemie en te cultiveren en te extraheren DNA. Hij onderscheidt tussen dieren (onderverdeling: zoogdier weefsel) en plantenweefsel. Dierlijke weefsels worden gegroepeerd in vier basistypen van bindweefsel, spier-, zenuw- en epitheelweefsel. Plantenweefsel wordt onderverdeeld in de volgende drie weefselsystemen: de epidermis, de grond weefsel en het vaatweefsel.
Weefselmonsters kunnen worden bereid uit dierlijke of plantendelen, b.v. botten, spieren, bladeren, enz.

Lichaamssappen

Bloed, serum, plasma, cerebrospinale vloeistof, speeksel en synoviale fluïdum lichaamsvloeistoffen, die een grote bron van diagnostisch relevante informatie geven. Derhalve is een verfijnde bereiding van lichaamsvloeistofmonsters voor analyse is belangrijk. De eerste moeilijkheid is gekoppeld aan het brede dynamische bereik van bestanddelen van lichaamsvloeistoffen.

Bepaling van proteïneconcentratie

Bradford assay Lowry assay en bicinchoninezuur (BCA) assay gemeenschappelijk assays om de concentratie van eiwitten te bepalen. Runderserumalbumine (BSA) is een van de meest gebruikte eiwitstandaard.

lysis Buffer

Lysis buffer moet worden gekozen in overeenstemming met het celmateriaal of weefsel (weefselkweek, planten, bacteriën, schimmels, enz), en of de cellen in een structuur en het type structuur. Een breed scala aan lysis buffers voor de extractie van eiwitten, membranen en organellen worden geformuleerd met één of meer detergentia. Het detergens wordt gewoonlijk gekozen via trial-and-error tests of – indien beschikbaar – volgens een bestaand eiwit extractieprotocol. Het wasmiddel moet compatibel zijn met de weefselbron en eiwitten. In het algemeen is de mildste reinigingsmiddel dat werkt voor een specifiek weefsel / eiwit is gekozen om de maximale functionaliteit van het extract te behouden. Ook bij een extractie van membranen en organellen, zachte zeep houdt het membraan intact. Algemeen gebruikte detergentia lysis buffers zijn meestal niet-ionogene of zwitterionogene, b.v. CHAPS, deoxycholaat, Triton ™ X-100, NP40, en Tween 20.
Bijvoorbeeld weefsels zoals hersenen, lever, darmen, nier, milt etc. eenvoudig worden gebufferd met RIPA – echter proteaseremmers en DTT (bijvoorbeeld voor gelelektroforese) worden opgenomen.
Lysisbuffer skeletspierweefsel (ijskoud): 20 mM Tris (pH 7,8), 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 1 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 10% (w / v) glycerol, 1 mM EDTA , 1 mM dithiothreitol gesupplementeerd met protease en fosfatase-inhibitor cocktail
Tabel zachte buffers en hun pH-gebied. In het algemeen worden deze buffers gewoonlijk gebruikt in concentraties van 20-50 mM.

Buffer pH-bereik
Citroenzuur – NaOH 2.2 – 6.5
Natriumcitraat – Citroenzuur 3.0 – 6.2
Natriumacetaat – azijnzuur 3.6 – 5.6
Kakodylzuur natriumzout – HCl 5.0 – 7.4
MIJN – NaOH 5.6 – 6.8
Natriumdiwaterstoffosfaat – dinatriumwaterstoffosfaat 5.8 – 8.0
imidazool – HCl 6.2 – 7.8
MOPS – KOH 6.6 – 7.8
triethanolamine hydrochloride – NaOH 6.8 – 8.8
Tris – HCl 7.0 – 9.0
HEPES – NaOH 7.2 – 8.2
Tricine – NaOH 7.6 – 8.6
natriumtetraboraat – boorzuur 7.6 – 9.2
bicine – NaOH 7.7 – 8.9
glycine – NaOH 8.6 – 10.6

De meeste buffers vertonen een pH-afhankelijkheid van de temperatuur. Dit geldt vooral voor Tris buffers. De pKa verandert van 8,06 bij 25 ° C tot 8,85 bij 0 ° C.
(PH en pKa van de buffer: pH meet de concentratie van waterstofionen in een waterige oplossing pKa (= zuurdissociatieconstante) is een verwante, maar specifieker maatregel, dat helpt te voorspellen hoe een molecuul zal optreden op een bepaald. PH waarde.)

TRIzol

TRIzol een chemische oplossing gebruikt om RNA / DNA / eiwit los wanneer de guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Het gebruik van ultrasoon bijgestaan ​​TRIzol extractieresultaten hoge DNA, RNA en eiwit opbrengst van hetzelfde monster en blinkt daardoor andere extractiemethoden.