Ultrasone lysis voor Western Blotting

• De western blot is een analytische procedure voor de detectie van specifieke eiwitten in een monster van weefselhomogenaat of celextract.
• Voor het uitvoeren van een Western blot of het meten van enzymactiviteit is voor veel assays toegang nodig tot het materiaal (bijv. eiwitten, DNA, subcellulaire fragmenten) dat in de cel opgesloten zit.
• Sonificatie is een betrouwbare en gemakkelijk te hanteren methode voor gecontroleerde celdisruptie en -lyse.

Ultrasone celonderbreking

Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is de eerste stap voor veel biologische, biochemische en analytische technieken (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspectrometrie, enz.) of eiwitzuivering. Om een hoge eiwitopbrengst te verkrijgen, moet het celmateriaal en weefsel efficiënt ontleed/gelyseerd worden. Of het nu gaat om plantencellen of dierlijk weefsel, sonicatie is de methode om uw cellysaat eenvoudig en snel te bereiden.

Voordelen van Sonicatie

• Snel & Efficiënt
• Eenvoudige bediening
• hoge eiwitopbrengst
• reproduceerbaar/ herhaalbaar
• nauwkeurig gecontroleerd
• schaalbaar

Immunoprecipitatieprotocol voor Western Immunoblotting

A. Reagentia

Gebruik voor de bereiding van de oplossingen gezuiverd water zoals Milli-Q.

• 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
• 1X cellysebuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptine.
  Belangrijk: Voeg vlak voor gebruik 1 mM PMSF toe.
• 15 pl Eiwit A + 15 pl Eiwit G is voldoende voor IP, maar het kan afhangen van uw primaire antilichaam en monstervolume. U kunt ook gebruik maken van vooraf gemengde eiwit A / G agarose (bijvoorbeeld eiwit A voor konijn IgG pull-down en eiwit G voor muis IgG pull-down)
• 3X SDS-monsterbuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bij 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v broomfenolblauw

B. Bereiding van cellysaten

• Oogst de cellen. Om cellen te oogsten onder niet-ondenaturerende omstandigheden, verwijdert u de media en spoelt u de cellen eenmaal met ijskoud PBS.
• Verwijder PBS en voeg 0,5 ml ijskoude 1X cellysebuffer toe aan elke plaat (10 cm) en incubeer de platen 5 minuten op ijs.
• Schraap de cellen van de platen en breng ze over in microcentrifugebuizen. Bewaar op ijs.
• Sonificeer tweemaal gedurende 10 seconden in ijskoude immunoprecipitatiebuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 en de proteaseremmer mix). Voor sonicatie werd de VialTweeter of een sonde-ultrasone zoals de UP100H of UP200Ht zijn het meest geschikt.
• Centrifugeer de lysaten bij 15.000 g gedurende 10 minuten bij 4°C.
• Breng het supernatant over in een nieuwe buis. (Indien nodig kan het lysaat bewaard worden bij -80°C.)
• Voeg het primaire antilichaam toe aan het supernatant. Het supernatant met het primaire antilichaam wordt gedurende 1 uur bij 4°C geïncubeerd onder licht schudden. Primair antilichaam wordt meestal toegevoegd in een hoeveelheid die 10x meer geconcentreerd is dan wordt gebruikt voor western blotting. (Je kunt beginnen met 1μg per 100μL.)
• Het supernatant wordt vervolgens verder geïncubeerd met het mengsel van gelijke hoeveelheden proteïne A-agarose (Invitrogen) en proteïne G-agarose gedurende nog eens 1 uur.
• Was de agarosepellets driemaal met IP-buffer. Extraheer daarna de gebonden eiwitten met de SDS-PAGE laadbuffer door 5 minuten te verwarmen bij 95°C.

C. Immunoprecipitatie

• Neem 200 μl cellysaat en voeg primair antilichaam toe. Incubeer met voorzichtig schudden overnacht bij 4°C.
• Voeg proteïne A- of G-agarosekorrels toe (20 μl 50% korrelslurry). Incubeer met voorzichtig schudden gedurende 1-3 uur bij 4 °C.
• Microcentrifugeer gedurende 30 seconden bij 4°C. Was de pellet vijf keer met 500 µl 1X cellysebuffer. Bewaar op ijs tijdens het wassen.
• Resuspendeer de pellet met 20 μl 3X SDS monsterbuffer. Vortexen en vervolgens 30 seconden microcentrifugeren.
• Verwarm het monster gedurende 2-5 minuten tot 95-100 °C en microcentrifugeer 1 minuut bij 14.000 Xg.
• Laad het monster (15-30 μl) op SDS-PAGE-gel (12-15%).
• Analyseer het monster door Western blotting.

Western Blot Analyse met de Sonicator UP50H

Het volgende protocol met de sonde-type sonicator UP50H werd gebruikt in het onderzoek van Kriebisch et al. (2011):
Totaal eiwit werd geïsoleerd uit MC3T3-E1 cellen behandeld met 1,25(OH)₂D₃ (10^-8 M) of medium. De cellen werden gelyseerd met een buffer met 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) en 0,5% natriumdeoxycholaat (Merck). Het cellysaat werd gedurende 2 × 10 s gesonitiseerd bij cyclus 1 en amplitude 80 met de UP50H Ultrasone Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland). Daarna werd het materiaal gedurende 10 minuten bij 14.000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd gebruikt voor Western blotting. Vijfentwintig μg eiwit werd gekookt in monsterbuffer en reductiemiddel (Invitrogen) en vervolgens gescheiden door SDS-PAGE met behulp van 4-12% polyacrylamide gels (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (GE health care). Het membraan werd 1 uur geblokkeerd met TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) met 1% caseïne (Sigma-Aldrich) en 1% Tris (1 M). Na blokkeren werd het membraan onder licht schudden overnacht bij 4°C geïncubeerd met het primaire antilichaam (konijn anti-humaan CBS 1/500, ontwikkeld in het lab van Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Incubatie met een mierikswortelperoxidase (HPR)-geconjugeerd secundair antilichaam (Dako) werd uitgevoerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Alle blots werden ontwikkeld met versterkte chemiluminescentie (Perkin Elmer).
 

Klik hier om meer te lezen over best practices voor ultrasone cellyse en -extractie, lysaatbereiding en aanbevelingen voor procesverbeteringen!
 
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone apparaten op laboratoriumformaat:

Literatuur / Referenties