Ultrasone Lysis voor Western Blotting

  • De Western blot is een analytische werkwijze voor de detectie van specifieke eiwitten in een monster van weefsel homogenaat of celextract.
  • Een Western blot uit te voeren of om enzymactiviteit te meten, veel assays is toegang tot de materialen (bijvoorbeeld eiwitten, DNA, subcellulaire fragmenten) ingesloten in de cel.
  • Sonicatie is een betrouwbare en eenvoudig te hanteren methode voor gecontroleerde cel verstoring en lysis.

Ultrasone Cell Verstoring

Eiwitextractie van weefsels en gekweekte cellen is de eerste stap voor vele biologische, biochemische en analytische technieken (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspectrometrie, enz.) Of eiwitzuivering. Een eiwitrijk opbrengst, moet het celmateriaal en weefsels efficiënt worden verstoord / gelyseerd. Of plantencel of dierlijk weefsel, sonicatie is de methode om de voorbereiding van uw cellysaat gemakkelijk en snel.

Voordelen van de Ultrasoonbehandeling

  • Snel & doeltreffend
  • gemakkelijke operatie
  • eiwitrijke yield
  • reproduceerbare / herhaalbaar
  • nauwkeurig gecontroleerde
  • schaalbaar

Immunoprecipitatie Protocol Voor West Immunoblottingtest

A. Reagentia

Voor de bereiding van oplossingen, gebruikt gezuiverd water zoals Milli-Q.

  • 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
  • 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptine
    Belangrijk: Voeg 1 mM PMSF onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.
  • 15 ul Proteïne A + 15 pl Proteïne G is voldoende voor IP, maar het kan afhankelijk van uw primaire antilichaam en het monster volume. Kunt u ook voorgemengd proteïne A / G agarose (bijvoorbeeld Proteïne A voor konijnen IgG afbreken en proteïne G voor muizen IgG pull down)
  • 3X SDS-monsterbuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bij 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% gew / vol broomfenolblauw

B. Bereiding van cellysaten

  • Oogst de cellen. Om cellen te oogsten onder denaturerende omstandigheden, verwijder de media en spoel cellen eenmaal met ijskoude PBS.
  • Verwijderen PBS en voeg 0,5 ml ijskoude 1X cellysis buffer aan elke plaat (10 cm) en incubeer de platen op ijs gedurende 5 minuten.
  • Schraap cellen van de platen en transfer naar microcentrifugebuizen. Houd op het ijs.
  • Sonificeer tweemaal gedurende 10 seconden in ijskoude buffer immunoprecipitatie (IP buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 en de proteaseremmer mix). Voor ultrasoonapparaat, de VialTweeter of een probe ultrasonicator zoals UP100H of Uf200 ः t zijn het meest geschikt.
  • Centrifugeer de lysaten bij 15.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
  • Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe buis. (Eventueel kan lysaat worden bewaard bij -80 ° C.)
  • Voeg het primaire antilichaam aan de bovenstaande vloeistof. Het supernatant met het primaire antilichaam gedurende 1 uur bij 4 ° C onder licht roeren. Primaire antilichaam wordt kenmerkend toegevoegd in een hoeveelheid 10x meer geconcentreerd dan wordt gebruikt voor western blotting. (U kunt beginnen met 1 pg per 100 pi.)
  • De bovenstaande vloeistof wordt dan verder geïncubeerd met het mengsel van gelijke hoeveelheden proteïne A-agarose (Invitrogen) en proteïne G agarose nog 1 uur geroerd.
  • Was de agarose pellets driemaal met IP buffer. Daarna extraheer de gebonden eiwitten met de SDS-PAGE laadbuffer door verhitting bij 95 ° C gedurende 5 minuten.

C. Immunoprecipitatie

  • Neem 200 ul cellysaat en voeg primair antilichaam. Incubeer onder rustig schommelen overnacht bij 4 ° C.
  • Voeg ofwel proteïne A of G agarose parels (20 ui 50% kraal slurry). Incubeer onder rustig schommelen gedurende 1-3 uur bij 4 ° C.
  • Microcentrifuge gedurende 30 seconden bij 4 ° C. Was pellet vijfmaal met 500 pi 1X cellysis buffer. Houd op het ijs tijdens wasbeurten.
  • Resuspendeer de pellet met 20 pl 3X SDS monsterbuffer. Vortex, dan microcentrifuge gedurende 30 seconden.
  • Verwarm het monster tot 95-100 ° C gedurende 2-5 minuten en microcentrifuge gedurende 1 minuut bij 14.000 x g.
  • Laad het monster (15-30 ui) op ​​SDS-PAGE gel (12-15%).
  • Analyseer steekproef door Western blotting.

Neem contact met ons op / vraag om meer informatie

Praat met ons over uw verwerking eisen. We zullen de meest geschikte configuratie en bewerkingsparameters aanbevelen voor uw project.





Let op onze Privacybeleid.


Meer Ultrasoonbehandeling Protocollen

Western Blot-analyse met ultrasonicator UP50H

Volgende protocol werd gebruikt in de studie van Kriebisch et al. (2011):
Totaal eiwit werd geïsoleerd uit MC3T3-E1 cellen behandeld met 1,25 (OH)2D3 (10-8 M) of drager. De cellen werden gelyseerd met een buffer die 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) en 0,5% natriumdeoxycholaat (Merck). Het cellysaat werd gesonificeerd 2 x 10 seconden bij 1 cyclus en amplitude 80 met de UP50H Ultrasone Bewerker (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland). Daarna werd het materiaal gedurende 10 minuten bij 14.000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd voor Western blotting gebruikt. Vijfentwintig μg eiwit werd gekookt in monsterbuffer en reductiemiddel (Invitrogen) en vervolgens gescheiden door SDS-PAGE met behulp van 4-12% polyacrylamidegelen (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (GE-gezondheidszorg). Het membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd met TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) dat 1% caseïne (Sigma-Aldrich) en 1% Tris (1 M) bevatte. Na blokkeren werd het membraan gedurende de nacht bij 4 ° C geïncubeerd met een lichte beweging met het primaire antilichaam (anti-mens-konijn-CBS 1/500, ontwikkeld in het laboratorium van Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, VS). Incubatie met een met mierikswortelperoxidase (HPR) geconjugeerd secundair antilichaam (Dako) werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd. Alle blots werden ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie (Perkin Elmer).

Literatuur / Referenties



Over Western Blotting

Vlekken zijn analytische procedures waarbij DNA, RNA en eiwitten worden overgebracht naar een drager, zodat ze kunnen gescheiden.
De Southern blot wordt gebruikt voor de detectie van DNA, de Northern blot van RNA en Western blot van eiwitten.
Western blotting wordt ook wel eiwit immunoblotting omdat een antilichaam wordt gebruikt om specifiek te detecteren zijn antigeen. De Western Blotting is één van de belangrijkste analysemethoden specifieke eiwitten in het monster te detecteren. In de Western blot worden de eiwitten geïmmobiliseerd op membranen zijn om ze met behulp van monoklonale of polyklonale antilichamen.
Door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) worden natieve eiwitten gescheiden door een 3-D-structuur of gedenatureerde eiwitten door de lengte van het polypeptide. De eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan (meestal nitrocellulose of PVDF), waar ze worden gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit. De gelelektroforesestap wordt omvat in western-blot-analyse om de kwestie van de kruisreactiviteit van antilichamen op te lossen.
Daarna worden de gescheiden eiwitten geblot op een matrix (meestal op een nitrocellulose- of PVDF-membraan), waar ze worden gekleurd met antilichamen. De antilichamen functioneren als een probe en worden specifiek geselecteerd voor het doeleiwit. De analyse van de locatie en intensiteit van de specifieke reactie onthult expressiedetails van de doeleiwitten in het gegeven monster. Western-blotting zou doeleiwit kunnen detecteren dat zo laag is als 1ng vanwege hoge resolutie van de gelelektroforese en sterke specificiteit en hoge gevoeligheid van de immunoassay. De Western-blot-methode wordt gebruikt in de moleculaire biologie, biochemie, immunogenetica en andere moleculaire onderzoeksgebieden.
Andere verwante technieken omvatten dot blot analyse, immunohistochemie en immunocytochemie waarbij antilichamen worden gebruikt om eiwitten in weefsels en cellen te detecteren door immunokleuring en enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA).

Hielscher's VialTweeter is is´deal for the lysis of multiple samples

VialTweeter ultrasoon sample prep

Neem contact met ons op! / Vraag ons!





Let op onze Privacybeleid.


Sonicatie is een belangrijke stap tijdens de voorbehandeling

UP200St met micro-tip voor monster ultrasoonapparaat