• De Western blot is een analytische werkwijze voor de detectie van specifieke eiwitten in een monster van weefsel homogenaat of celextract.
• Een Western blot uit te voeren of om enzymactiviteit te meten, veel assays is toegang tot de materialen (bijvoorbeeld eiwitten, DNA, subcellulaire fragmenten) ingesloten in de cel.
• Sonicatie is een betrouwbare en eenvoudig te hanteren methode voor gecontroleerde cel verstoring en lysis.

Ultrasone Cell Verstoring

Eiwitextractie van weefsels en gekweekte cellen is de eerste stap voor vele biologische, biochemische en analytische technieken (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspectrometrie, enz.) Of eiwitzuivering. Een eiwitrijk opbrengst, moet het celmateriaal en weefsels efficiënt worden verstoord / gelyseerd. Of plantencel of dierlijk weefsel, sonicatie is de methode om de voorbereiding van uw cellysaat gemakkelijk en snel.

Voordelen van de Ultrasoonbehandeling

• Snel & doeltreffend
• gemakkelijke operatie
• eiwitrijke yield
• reproduceerbare / herhaalbaar
• nauwkeurig gecontroleerde
• schaalbaar

Immunoprecipitatie Protocol Voor West Immunoblottingtest

A. Reagentia

Voor de bereiding van oplossingen, gebruikt gezuiverd water zoals Milli-Q.

• 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
• 1X Cell Lysis Buffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 ug / ml leupeptine
  Belangrijk: Voeg 1 mM PMSF onmiddellijk voorafgaand aan gebruik.
• 15 ul Proteïne A + 15 pl Proteïne G is voldoende voor IP, maar het kan afhankelijk van uw primaire antilichaam en het monster volume. Kunt u ook voorgemengd proteïne A / G agarose (bijvoorbeeld Proteïne A voor konijnen IgG afbreken en proteïne G voor muizen IgG pull down)
• 3X SDS-monsterbuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bij 25 ° C), 6% w / v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% gew / vol broomfenolblauw

B. Bereiding van cellysaten

• Oogst de cellen. Om cellen te oogsten onder denaturerende omstandigheden, verwijder de media en spoel cellen eenmaal met ijskoude PBS.
• Verwijderen PBS en voeg 0,5 ml ijskoude 1X cellysis buffer aan elke plaat (10 cm) en incubeer de platen op ijs gedurende 5 minuten.
• Schraap cellen van de platen en transfer naar microcentrifugebuizen. Houd op het ijs.
• Sonificeer tweemaal gedurende 10 seconden in ijskoude buffer immunoprecipitatie (IP buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 en de proteaseremmer mix). Voor ultrasoonapparaat, de VialTweeter of een probe ultrasonicator zoals UP100H of Uf200 ः t zijn het meest geschikt.
• Centrifugeer de lysaten bij 15.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
• Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe buis. (Eventueel kan lysaat worden bewaard bij -80 ° C.)
• Voeg het primaire antilichaam aan de bovenstaande vloeistof. Het supernatant met het primaire antilichaam gedurende 1 uur bij 4 ° C onder licht roeren. Primaire antilichaam wordt kenmerkend toegevoegd in een hoeveelheid 10x meer geconcentreerd dan wordt gebruikt voor western blotting. (U kunt beginnen met 1 pg per 100 pi.)
• De bovenstaande vloeistof wordt dan verder geïncubeerd met het mengsel van gelijke hoeveelheden proteïne A-agarose (Invitrogen) en proteïne G agarose nog 1 uur geroerd.
• Was de agarose pellets driemaal met IP buffer. Daarna extraheer de gebonden eiwitten met de SDS-PAGE laadbuffer door verhitting bij 95 ° C gedurende 5 minuten.

C. Immunoprecipitatie

• Neem 200 ul cellysaat en voeg primair antilichaam. Incubeer onder rustig schommelen overnacht bij 4 ° C.
• Voeg ofwel proteïne A of G agarose parels (20 ui 50% kraal slurry). Incubeer onder rustig schommelen gedurende 1-3 uur bij 4 ° C.
• Microcentrifuge gedurende 30 seconden bij 4 ° C. Was pellet vijfmaal met 500 pi 1X cellysis buffer. Houd op het ijs tijdens wasbeurten.
• Resuspendeer de pellet met 20 pl 3X SDS monsterbuffer. Vortex, dan microcentrifuge gedurende 30 seconden.
• Verwarm het monster tot 95-100 ° C gedurende 2-5 minuten en microcentrifuge gedurende 1 minuut bij 14.000 x g.
• Laad het monster (15-30 ui) op ​​SDS-PAGE gel (12-15%).
• Analyseer steekproef door Western blotting.

Western Blot-analyse met ultrasonicator UP50H

Volgende protocol werd gebruikt in de studie van Kriebisch et al. (2011):
Totaal eiwit werd geïsoleerd uit MC3T3-E1 cellen behandeld met 1,25 (OH)₂D₃ (10^-8 M) of drager. De cellen werden gelyseerd met een buffer die 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) en 0,5% natriumdeoxycholaat (Merck). Het cellysaat werd gesonificeerd 2 x 10 seconden bij 1 cyclus en amplitude 80 met de UP50H Ultrasone Bewerker (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland). Daarna werd het materiaal gedurende 10 minuten bij 14.000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd voor Western blotting gebruikt. Vijfentwintig μg eiwit werd gekookt in monsterbuffer en reductiemiddel (Invitrogen) en vervolgens gescheiden door SDS-PAGE met behulp van 4-12% polyacrylamidegelen (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (GE-gezondheidszorg). Het membraan werd gedurende 1 uur geblokkeerd met TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) dat 1% caseïne (Sigma-Aldrich) en 1% Tris (1 M) bevatte. Na blokkeren werd het membraan gedurende de nacht bij 4 ° C geïncubeerd met een lichte beweging met het primaire antilichaam (anti-mens-konijn-CBS 1/500, ontwikkeld in het laboratorium van Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, VS). Incubatie met een met mierikswortelperoxidase (HPR) geconjugeerd secundair antilichaam (Dako) werd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur uitgevoerd. Alle blots werden ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie (Perkin Elmer).

Literatuur / Referenties