Ultrasone lysis voor Western Blotting
- De western blot is een analytische procedure voor de detectie van specifieke eiwitten in een monster van weefselhomogenaat of celextract.
- Voor het uitvoeren van een Western blot of het meten van enzymactiviteit is voor veel assays toegang nodig tot het materiaal (bijv. eiwitten, DNA, subcellulaire fragmenten) dat in de cel opgesloten zit.
- Sonificatie is een betrouwbare en gemakkelijk te hanteren methode voor gecontroleerde celdisruptie en -lyse.
Ultrasone celonderbreking
Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is de eerste stap voor veel biologische, biochemische en analytische technieken (PAGE, Western blotting, ELISA, massaspectrometrie, enz.) of eiwitzuivering. Om een hoge eiwitopbrengst te verkrijgen, moet het celmateriaal en weefsel efficiënt ontleed/gelyseerd worden. Of het nu gaat om plantencellen of dierlijk weefsel, sonicatie is de methode om uw cellysaat eenvoudig en snel te bereiden.
Voordelen van Sonicatie
- Snel & Efficiënt
- Eenvoudige bediening
- hoge eiwitopbrengst
- reproduceerbaar/ herhaalbaar
- nauwkeurig gecontroleerd
- schaalbaar

VialTweeter sonicator voor ultrasone monsterpreparatie zoals celdisruptie en eiwitisolatie
Immunoprecipitatieprotocol voor Western Immunoblotting
A. Reagentia
Gebruik voor de bereiding van de oplossingen gezuiverd water zoals Milli-Q.
- 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
- 1X cellysebuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml Leupeptine.
Belangrijk: Voeg vlak voor gebruik 1 mM PMSF toe. - 15 pl Eiwit A + 15 pl Eiwit G is voldoende voor IP, maar het kan afhangen van uw primaire antilichaam en monstervolume. U kunt ook gebruik maken van vooraf gemengde eiwit A / G agarose (bijvoorbeeld eiwit A voor konijn IgG pull-down en eiwit G voor muis IgG pull-down)
- 3X SDS-monsterbuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bij 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v broomfenolblauw
B. Bereiding van cellysaten
- Oogst de cellen. Om cellen te oogsten onder niet-ondenaturerende omstandigheden, verwijdert u de media en spoelt u de cellen eenmaal met ijskoud PBS.
- Verwijder PBS en voeg 0,5 ml ijskoude 1X cellysebuffer toe aan elke plaat (10 cm) en incubeer de platen 5 minuten op ijs.
- Schraap de cellen van de platen en breng ze over in microcentrifugebuizen. Bewaar op ijs.
- Sonificeer tweemaal gedurende 10 seconden in ijskoude immunoprecipitatiebuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 en de proteaseremmer mix). Voor sonicatie werd de VialTweeter of een sonde-ultrasone zoals de UP100H of UP200Ht zijn het meest geschikt.
- Centrifugeer de lysaten bij 15.000 g gedurende 10 minuten bij 4°C.
- Breng het supernatant over in een nieuwe buis. (Indien nodig kan het lysaat bewaard worden bij -80°C.)
- Voeg het primaire antilichaam toe aan het supernatant. Het supernatant met het primaire antilichaam wordt gedurende 1 uur bij 4°C geïncubeerd onder licht schudden. Primair antilichaam wordt meestal toegevoegd in een hoeveelheid die 10x meer geconcentreerd is dan wordt gebruikt voor western blotting. (Je kunt beginnen met 1μg per 100μL.)
- Het supernatant wordt vervolgens verder geïncubeerd met het mengsel van gelijke hoeveelheden proteïne A-agarose (Invitrogen) en proteïne G-agarose gedurende nog eens 1 uur.
- Was de agarosepellets driemaal met IP-buffer. Extraheer daarna de gebonden eiwitten met de SDS-PAGE laadbuffer door 5 minuten te verwarmen bij 95°C.
C. Immunoprecipitatie
- Neem 200 μl cellysaat en voeg primair antilichaam toe. Incubeer met voorzichtig schudden overnacht bij 4°C.
- Voeg proteïne A- of G-agarosekorrels toe (20 μl 50% korrelslurry). Incubeer met voorzichtig schudden gedurende 1-3 uur bij 4 °C.
- Microcentrifugeer gedurende 30 seconden bij 4°C. Was de pellet vijf keer met 500 µl 1X cellysebuffer. Bewaar op ijs tijdens het wassen.
- Resuspendeer de pellet met 20 μl 3X SDS monsterbuffer. Vortexen en vervolgens 30 seconden microcentrifugeren.
- Verwarm het monster gedurende 2-5 minuten tot 95-100 °C en microcentrifugeer 1 minuut bij 14.000 Xg.
- Laad het monster (15-30 μl) op SDS-PAGE-gel (12-15%).
- Analyseer het monster door Western blotting.
Western Blot Analyse met de Sonicator UP50H
Het volgende protocol met de sonde-type sonicator UP50H werd gebruikt in het onderzoek van Kriebisch et al. (2011):
Totaal eiwit werd geïsoleerd uit MC3T3-E1 cellen behandeld met 1,25(OH)2D3 (10-8 M) of medium. De cellen werden gelyseerd met een buffer met 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) en 0,5% natriumdeoxycholaat (Merck). Het cellysaat werd gedurende 2 × 10 s gesonitiseerd bij cyclus 1 en amplitude 80 met de UP50H Ultrasone Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland). Daarna werd het materiaal gedurende 10 minuten bij 14.000 rpm gecentrifugeerd en het supernatant werd gebruikt voor Western blotting. Vijfentwintig μg eiwit werd gekookt in monsterbuffer en reductiemiddel (Invitrogen) en vervolgens gescheiden door SDS-PAGE met behulp van 4-12% polyacrylamide gels (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (GE health care). Het membraan werd 1 uur geblokkeerd met TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) met 1% caseïne (Sigma-Aldrich) en 1% Tris (1 M). Na blokkeren werd het membraan onder licht schudden overnacht bij 4°C geïncubeerd met het primaire antilichaam (konijn anti-humaan CBS 1/500, ontwikkeld in het lab van Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, USA). Incubatie met een mierikswortelperoxidase (HPR)-geconjugeerd secundair antilichaam (Dako) werd uitgevoerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Alle blots werden ontwikkeld met versterkte chemiluminescentie (Perkin Elmer).
Klik hier om meer te lezen over best practices voor ultrasone cellyse en -extractie, lysaatbereiding en aanbevelingen voor procesverbeteringen!
De onderstaande tabel geeft een indicatie van de verwerkingscapaciteit van onze ultrasone apparaten op laboratoriumformaat:
Aanbevolen apparaten | Batchvolume | Debiet |
---|---|---|
UIP400MTP sonificator voor 96-wells platen | multi-well/microtiterplaten | n.v.t. |
Ultrasone kopHoorn | CupHorn voor flesjes of bekerglas | n.v.t. |
GDmini2 | ultrasone microstroomreactor | n.v.t. |
VialTweeter | 0.5 tot 1.5mL | n.v.t. |
UP100H | 1 tot 500 ml | 10 tot 200 ml/min |
UP200Ht, UP200St | 10 tot 1000 ml | 20 tot 200 ml/min |
UP400St | 10 tot 2000 ml | 20 tot 400 ml/min |
Ultrasone zeefschudder | n.v.t. | n.v.t. |
Neem contact met ons op! / Vraag het ons!

UIP400MTP platen sonicator voor high-throughput sonicatie van 96-well platen
Over Western Blotting
Blots zijn analytische procedures waarbij DNA, RNA en eiwitten op een drager worden overgebracht zodat ze gescheiden kunnen worden.
De Southern blot wordt gebruikt voor de detectie van DNA, de Northern blot voor RNA en de Western blot voor eiwitten.
Western blotting wordt ook wel eiwit immunoblotting genoemd omdat een antilichaam wordt gebruikt om specifiek het antigeen te detecteren. Western blotting is een van de belangrijkste analysemethoden om specifieke eiwitten in het monster te detecteren. Bij Western blotting worden de eiwitten geïmmobiliseerd op membranen om ze te detecteren met monoklonale of polyklonale antilichamen.
Door SDS-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) worden natieve eiwitten gescheiden door 3-D structuur of gedenatureerde eiwitten door de lengte van het polypeptide. De eiwitten worden vervolgens overgebracht op een membraan (meestal nitrocellulose of PVDF), waar ze worden gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor het doeleiwit. De gelelektroforesestap is opgenomen in western blotanalyse om het probleem van kruisreactiviteit van antilichamen op te lossen.
Daarna worden de afgescheiden eiwitten op een matrix (meestal op een nitrocellulose- of PVDF-membraan) gemerkt met antilichamen. De antilichamen werken als een probe en worden specifiek geselecteerd op het doeleiwit. De analyse van de locatie en intensiteit van de specifieke reactie onthult expressiedetails van de doeleiwitten in het betreffende monster. Western blotting kan doeleiwit detecteren dat zo laag is als 1ng dankzij de hoge resolutie van de gelelektroforese en de sterke specificiteit en hoge gevoeligheid van de immunoassay. De Western blot methode wordt gebruikt in moleculaire biologie, biochemie, immunogenetica en andere moleculaire onderzoeksgebieden.
Andere verwante technieken zijn dot blot analyse, immunohistochemie en immunocytochemie waarbij antilichamen worden gebruikt om eiwitten in weefsels en cellen te detecteren door middel van immunokleuring, en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Literatuur / Referenties
- Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
- Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
- Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.

VialTweeter sonicator voor gelijktijdige monstervoorbereiding van meerdere flacons