Ultrasone lysis voor westernblotting

• De westernblot is een analytische procedure voor de detectie van specifieke eiwitten in een monster van een weefselhomogenaat of celextract.
• Om een westernblot uit te voeren of de enzymactiviteit te meten, vereisen veel assays toegang tot de materialen (bijv. eiwitten, DNA, subcellulaire fragmenten) die in de cel opgesloten zitten.
• Sonicatie is een betrouwbare en eenvoudig toe te passen methode voor gecontroleerde celontsluiting en lysis.

Ultrasone celontsluiting

Eiwitextractie uit weefsels en gekweekte cellen is de eerste stap voor veel biologische, biochemische en analytische technieken (PAGE, westernblotting, ELISA, massaspectrometrie enz.) of eiwitzuivering. Om een hoge eiwitopbrengst te verkrijgen, moeten het celmateriaal en het weefsel efficiënt worden ontsloten/ gelyseerd. Of het nu om een plantencel of dierlijk weefsel gaat, sonicatie is de methode om uw cellysaat eenvoudig en snel te bereiden.

Voordelen van sonicatie

• snel & efficiënt
• eenvoudige bediening
• hoge eiwitopbrengst
• reproduceerbaar/ herhaalbaar
• nauwkeurig gecontroleerd
• schaalbaar

Immunoprecipitatieprotocol voor westernimmunoblotting

A. Reagentia

Gebruik voor de bereiding van de oplossingen gezuiverd water, zoals Milli-Q.

• 1X fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)
• 1X cellysisbuffer: 20 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM β-glycerofosfaat, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml leupeptine
  Belangrijk: voeg onmiddellijk vóór gebruik 1 mM PMSF toe.
• 15 μl proteïne A+15 μl proteïne G is voldoende voor IP, maar dit kan afhangen van uw primaire antilichaam en monstervolume. U kunt ook voorgemengde agarose met proteïne A/ G gebruiken (bijv. proteïne A voor de pull-down van konijnen-IgG en proteïne G voor de pull-down van muizen-IgG)
• 3X SDS-monsterbuffer: 187,5 mM Tris-HCl (pH 6,8 bij 25°C), 6% w/v SDS, 30% glycerol, 150 mM DTT, 0,03% w/v broomfenolblauw

B. Bereiding van cellysaten

• Oogst de cellen. Om cellen onder niet-denaturerende omstandigheden te oogsten, verwijdert u de media en spoelt u de cellen eenmaal met ijskoude PBS.
• Verwijder de PBS, voeg aan elke plaat (10 cm) 0,5 ml ijskoude 1X cellysisbuffer toe en incubeer de platen gedurende 5 minuten op ijs.
• Schraap de cellen van de platen en breng ze over naar microcentrifugebuisjes. Houd ze op ijs.
• Soniceer tweemaal gedurende 10 seconden in ijskoude immunoprecipitatiebuffer (IP-buffer: 50 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,1% NP-40 en het mengsel van proteaseremmers). Voor sonicatie zijn de VialTweeter of een ultrasone sonicator met sonde, zoals de UP100H of UP200Ht het meest geschikt.
• Centrifugeer de lysaten gedurende 10 minuten bij 15.000 g en 4°C.
• Breng de bovenstaande vloeistof over naar een nieuw buisje. (Indien nodig kan het lysaat bij –80°C worden bewaard.)
• Voeg het primaire antilichaam toe aan de bovenstaande vloeistof. De bovenstaande vloeistof met het primaire antilichaam wordt gedurende 1 h bij 4°C onder licht schudden geïncubeerd. Het primaire antilichaam wordt doorgaans toegevoegd in een concentratie die 10x hoger is dan bij westernblotting. (U kunt beginnen met 1μg per 100μL.)
• De bovenstaande vloeistof wordt vervolgens nog 1 h verder geïncubeerd met het mengsel van gelijke hoeveelheden proteïne A-agarose (Invitrogen) en agarose met proteïne G.
• Was de agarosepellets driemaal met IP-buffer. Extraheer daarna de gebonden eiwitten met de SDS-PAGE-laadbuffer door gedurende 5 minuten bij 95°C te verwarmen.

C. Immunoprecipitatie

• Neem 200 μl cellysaat en voeg het primaire antilichaam toe. Incubeer een nacht bij 4°C onder zacht schommelen.
• Voeg agaroseparels met proteïne A of G toe (20 μl van een 50% parelsuspensie). Incubeer gedurende 1–3 uur bij 4°C onder zacht schommelen.
• Centrifugeer gedurende 30 seconden in een microcentrifuge bij 4°C. Was de pellet vijfmaal met 500 µl 1X cellysisbuffer. Houd de pellet tijdens het wassen op ijs.
• Resuspendeer de pellet met 20 μl 3X SDS-monsterbuffer. Meng met een vortexmixer en centrifugeer vervolgens gedurende 30 seconden in een microcentrifuge.
• Verwarm het monster gedurende 2–5 minuten tot 95–100°C en centrifugeer gedurende 1 minuut in een microcentrifuge bij 14.000 X g.
• Breng het monster (15–30 μl) aan op een SDS-PAGE-gel (12–15%).
• Analyseer het monster met westernblotting.

Westernblotanalyse met de sonicator UP50H

Het volgende protocol met de sonicator met sonde UP50H werd gebruikt in het onderzoek van Kriebisch et al. (2011):
Totaal eiwit werd geïsoleerd uit MC3T3-E1-cellen die werden behandeld met 1,25(OH)₂D₃ (10⁻⁸ M) of vehiculum. De cellen werden gelyseerd met een buffer die 50 mM Tris HCl, pH 8 (Sigma-Aldrich); 150 mM NaCl (Fisher Scientific); 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) (Fisher Scientific); 1% IGEPAL CA-630 (Sigma-Aldrich) en 0,5% natriumdeoxycholaat (Merck) bevatte. Het cellysaat werd gedurende 2 × 10 s gesoniceerd met cyclus 1 en amplitude 80 met de UP50H Ultrasonic Processor (Hielscher, Ultrasound Technology, Teltow, Duitsland). Daarna werd het materiaal gedurende 10 min bij 14.000 rpm gecentrifugeerd en werd de bovenstaande vloeistof gebruikt voor westernblotting. Vijfentwintig μg eiwit werd gekookt in monsterbuffer en reductiemiddel (Invitrogen), vervolgens gescheiden door SDS-PAGE met 4–12% polyacrylamidegels (Invitrogen) en overgebracht naar een nitrocellulosemembraan (GE health care). Het membraan werd gedurende 1 h geblokkeerd met TBS (10 mM Tris-HCl; pH 7,6; 150 mM NaCl) met 1% caseïne (Sigma-Aldrich) en 1% Tris (1 M). Na het blokkeren werd het membraan een nacht bij 4°C onder licht schudden geïncubeerd met het primaire antilichaam (konijnenantilichaam tegen humaan CBS 1/500, ontwikkeld in het laboratorium van Prof. R. Banerjee, Ann Arbor, MI, VS). Incubatie met een secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase (HPR) (Dako) werd gedurende 1 h bij kamertemperatuur uitgevoerd. Alle blots werden ontwikkeld met versterkte chemiluminescentie (Perkin Elmer).
 

Klik hier om meer te lezen over de beste werkwijzen voor ultrasone cellysis en extractie, lysaatbereiding en aanbevelingen voor procesverbeteringen!
 
De onderstaande tabel geeft u een indicatie van de geschatte verwerkingscapaciteit van onze ultrasone apparaten op laboratoriumschaal:

Literatuur / Referenties

• Koch RJ, Barrette AM, Stern AD, et al. Validating Antibodies for Quantitative Western Blot Measurements with Microwestern Array. Sci Rep. 2018;8(1):11329. Published 2018 Jul 27. doi:10.1038/s41598-018-29436-0
• Carsten Kriebitzsch, Lieve Verlinden, Guy Eelen, Natasja M. van Schoor, Karin Swart, Paul Lips, Mark B. Meyer, J Wesley Pike, Steven Boonen, Carsten Carlberg, Victor Vitvitsky, Roger Bouillon, Ruma Banerjee, and Annemieke Verstuyf (2011): 1,25-dihydroxyvitamin D3 influences cellular homocysteine levels in murine pre-osteoblastic MC3T3-E1 cells by direct regulation of cystathionine β-synthase. J Bone Miner Res. 26(12), 2011. 2991–3000.
• Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012): Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4(9), 2012. 429-434.