Proteomische workflows met snelle eiwitontsluiting

Proteomics is een essentieel veld voor het begrijpen van biologische processen en systemen, waarbij eiwitvertering een kritieke stap in de workflows vormt. Traditioneel wordt eiwitvertering uitgevoerd in oplossing met behulp van proteolytische enzymen zoals trypsine, dat specifiek peptidebindingen op lysine- en arginineresten hydrolyseert. Dit proces genereert peptiden die zeer geschikt zijn voor ionisatie en fragmentatie in massaspectrometrietoepassingen (MS). Conventionele verteringsmethoden vereisen echter 12-24 uur om te voltooien, wat aanzienlijke knelpunten oplevert in proteomische workflows.
Ultrasoontechniek biedt een krachtig alternatief, waarbij de digestietijd drastisch wordt verkort van uren tot slechts enkele minuten. In combinatie met geavanceerde multi-sample sonicators zoals de Hielscher CupHorn, VialTweeter en de 96-well plaat sonicator UIP400MTP, maakt ultrasoonbehandeling versnelde proteomics met hoge doorvoer mogelijk. Deze technologieën stroomlijnen workflows, verkorten de monstervoorbereidingstijd en verhogen de efficiëntie zonder afbreuk te doen aan de reproduceerbaarheid of gegevenskwaliteit.

De rol van ultrasone energie bij eiwitvertering

Ultrasoon maken gebruik van gefocuste ultrasone geluidsgolven om cavitatie te creëren - gelokaliseerde microbelletjes die samenklappen om intense schuifkrachten te genereren. Dit fenomeen verbetert de massaoverdracht, bevordert het mengen van enzymen met substraten en ontvouwt eiwitstructuren, waardoor splitsingsplaatsen worden blootgesteld aan proteolytische enzymen zoals trypsine.
Het resultaat? Een aanzienlijke verkorting van de digestietijd zonder afbreuk te doen aan de efficiëntie of reproduceerbaarheid.

Ultrasoon-ondersteunde proteolytische vertering: Methodologie en resultaten

Protocol voor versnelde vertering

Ultrasone digestie combineert proteolytische enzymen en ultrasone energie om de workflow te versnellen. Bij gebruik van de Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) verloopt de digestieworkflow bijvoorbeeld als volgt:

1. Vermindering: Eiwitmonsters (0,5 mg/mL, 20 µL) worden behandeld met DTT (2 µL, 110 mM) in ammoniumbicarbonaatbuffer (12,5 mM). Sonicatie wordt toegepast bij 50% amplitude gedurende 5 minuten.
2. Alkylering: Na toevoeging van IAA (2 µL, 400 mM) wordt de sonicatie herhaald onder dezelfde omstandigheden.
3. Digestie: Monsters worden verdund en geïncubeerd met geïmmobiliseerde trypsine nanodeeltjes. Een laatste sonicatieronde (5 minuten) voltooit de digestie. Peptiden worden gescheiden, gedroogd en opgeslagen voor MS-analyse.

Deze ultrasone methode verkort de totale prepareertijd van 12 uur tot minder dan 30 minuten. Ondanks het versnelde proces blijven de opbrengst en kwaliteit van het peptide consistent met de traditionele nachtelijke methoden.

Efficiëntie van ultrasone eiwitvergisting

In vergelijkende studies met proteomen van E. coli:

• Eiwitidentificatie: Ultrasoon gedigesteerde monsters identificeerden 777 eiwitten in 5 minuten, vergeleken met 817 in 12 uur. Gedeelde proteïne-identificaties overschreden de 70%.
• Reproduceerbaarheid: Herhalingsanalyses toonden correlatiewaarden boven de 98% binnen elke methode, wat betrouwbaarheid aantoont.
• Selectiviteit: Bepaalde eiwitten werden bij voorkeur verteerd door elke methode, waarbij ultrasone vertering de voorkeur gaf aan 65 eiwitten en nachtelijke vertering aan 54 eiwitten. Dergelijke genuanceerde verschillen onderstrepen het unieke potentieel van ultrasoon voor specifieke toepassingen.

Labelvrije eiwitkwantificatieresultaten van zeven geïnjecteerde eiwitten in een E. coli
monster. De volgende eiwitten werden toegevoegd op twee verschillende niveaus, zoals aangegeven in de kolom
genaamd "Theo Ratio". De Theo Ratio is de theoretische verhouding tussen de twee niveaus die in deze
experiment. Boviene serumalbumine (ALBU), β-lactoglobuline (LACB), α-S1 caseïne (CASA1),
α-S2 caseïne (CASA2), cytochroom c (CYC), ovalbumine (OVAL) en koolzuuranhydrase 2
(CAH2). Verhoudingen werden berekend met behulp van LFQ-eiwitintensiteiten verkregen uit MaxQuant
analysis. The student’s t test was applied to compare the values obtained with each method (p>0.01, n=3, t-theoretical=4.6).
Studie en grafiek: © Martins et al., 2019)

Nanodeeltje-geïmmobiliseerde trypsine

De integratie van geïmmobiliseerde trypsine nanodeeltjes (bijv. T-FMNP's) met ultrasoonbehandeling verbetert proteomics workflows nog verder. Deze nanodeeltjes bieden een groot oppervlak voor enzym-substraatinteracties, waardoor de efficiëntie toeneemt. Toegepast op complexe proteomen, zoals E. coli, bereikt de gecombineerde methode:

• Snelheid: Volledige vertering binnen 5 minuten.
• Nauwkeurigheid: Comparable protein quantification to traditional methods (p > 0.01, n=3).
• Schaalbaarheid: Aanpassing aan platforms met meerdere putjes zoals de UIP400MTP maakt verwerking met hoge doorvoer mogelijk.

Klik hier voor het gedetailleerde protocol met stapsgewijze instructies!
(cf. Martins et al., 2019)

Proteolytische digestie met hoge snelheid en hoge doorvoer met Hielscher sonicators

De beste Sonicator-modellen voor proteomics

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende sonicatormodellen voor gelijktijdige preparatie van meerdere monsters om een snelle workflow mogelijk te maken. Of u nu werkt met flacons, reageerbuizen, platen met meerdere putjes (bijv. 6-, 24-, 96-wells platen) of petrischalen – bieden wij u de ideale sonicators voor uw experimenten.

UIP400MTP sonicator voor meerdere wells

Voor de ultieme verwerkingscapaciteit biedt de UIP400MTP de mogelijkheid om 96-well platen ultrasoon te verwerken. De UIP400MTP is compatibel met elke standaard microtiterplaat, vereist geen dure eigen disposables en geeft u de vrijheid om de beste multi-well plaat voor uw onderzoek te kiezen. Door het leveren van uniforme energie over de hele plaat, maakt het een snelle reductie, alkylering en digestie mogelijk van tot wel 200 complexe proteomen in slechts 1 uur. Dit niveau van automatisering en efficiëntie is cruciaal voor high-throughput proteomics en klinische toepassingen. Meer informatie over de multi-well plate sonicator!

VialTweeter

De VialTweeter is op maat gemaakt voor laboratoria die gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 flacons of reageerbuizen nodig hebben. De niet-invasieve aanpak elimineert het risico op kruisbesmetting en zorgt voor een reproduceerbare eiwitvertering. Dit apparaat is ideaal voor onderzoekers die werken met beperkte monstervolumes of verschillende monstertypes.
Meer informatie over de VialTweeter multi-tube sonicator!

Hielscher UP200St-KopHoorn

De CupHorn sonicator is een krachtig apparaat dat ontworpen is voor gelijktijdige verwerking van meerdere monsters in afgesloten containers. Het zorgt voor een gelijkmatige verdeling van de ultrasone energie en een nauwkeurige temperatuurregeling. De mogelijkheid om tot vijf monsters tegelijkertijd te verwerken, gekoppeld aan de compatibiliteit met gereduceerde, gealkyleerde en verteerde workflows, maakt de CupHorn een betrouwbaar hulpmiddel voor MS-gebaseerde proteomics.
Meer informatie over de CupHorn SonoReactor!

Stap-voor-stap protocol voor ultrasone trillingen ondersteund Proteolytische Digestie met behulp van nanodeeltjes geïmmobiliseerde trypsine

Dit protocol van Martins et al. (2019) is geoptimaliseerd voor snelle eiwitvertering met behulp van ultrasone energie en nanodeeltjes-geïmmobiliseerde trypsine (T-FMNP's). De geschetste stappen zorgen voor efficiënte reductie, alkylering en proteolyse geschikt voor massaspectrometrietoepassingen (MS).
Protocol Stappen

1. Reductie van disulfidebindingen
   • Voeg 2 µL DTT-oplossing (110 mM) toe aan de 20 µL eiwitmonster (0,5 mg/mL) in AmBic-buffer.
   • Plaats de monsterbuis in de sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Sonificeer het monster gedurende 2,5 minuten bij 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Pauzeer kort om af te koelen en soniceer vervolgens nog 2,5 minuut onder dezelfde omstandigheden.
2. Alkylering van gereduceerde cysteïneresten
   • Voeg 2 µL IAA-oplossing (400 mM) toe aan het gereduceerde eiwitmonster.
   • Sonificeer gedurende 2,5 minuten bij 50% amplitude om alkylering te vergemakkelijken.
   • Pauzeer om af te koelen en soniceer vervolgens nog 2,5 minuut.

   Opmerking: Minimaliseer blootstelling van het gealkyleerde monster aan licht om afbraak van IAA te voorkomen.

3. Monsterverdunning
   • Verdun het gealkyleerde eiwitmonster tot een eindvolume van 100 µL met 25 mM AmBic-buffer met 4% acetonitril (v/v).
   • Meng grondig door voorzichtig te pipetteren.
4. Proteolytische vertering met geïmmobiliseerde trypsine in nanodeeltjes
   • Voeg 20 µL T-FMNP-oplossing (3 mg/mL) toe aan het verdunde eiwitmonster.
   • Sonificeer het mengsel in de sonoreactor gedurende 2,5 minuten bij een amplitude van 50%.
   • Pauzeer om af te koelen en soniceer dan nog eens 2,5 minuten onder dezelfde omstandigheden.
5. Scheiding van trypsine nanodeeltjes
   • Gebruik een magneet om de T-FMNP's te scheiden van het supernatant met verteerde peptiden.
   • Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis.
6. Peptidevoorbereiding voor MS-analyse
   • Droog het supernatant met peptiden in een vacuümcentrifuge.
   • Bewaar de gedroogde peptiden bij -20°C tot verdere analyse met massaspectrometrie.