Proteomische workflows met eiwitdigestie met hoge verwerkingscapaciteit

Proteomica is een essentieel vakgebied voor het begrijpen van biologische processen en systemen, waarbij eiwitdigestie een cruciale stap in de workflows vormt. Traditioneel wordt eiwitdigestie in oplossing uitgevoerd met proteolytische enzymen zoals trypsine, dat specifiek peptidebindingen bij lysine- en arginineresiduen hydrolyseert. Dit proces levert peptiden op die zeer geschikt zijn voor ionisatie en fragmentatie in toepassingen met massaspectrometrie (MS). Conventionele digestiemethoden hebben echter 12–24 uur nodig om volledig te verlopen, wat aanzienlijke knelpunten in proteomische workflows veroorzaakt.
Ultrasone behandeling biedt een krachtig alternatief en verkort de digestietijd drastisch van uren tot slechts enkele minuten. In combinatie met geavanceerde sonicators voor meerdere monsters, zoals de Hielscher CupHorn, VialTweeter en de sonicator voor platen met 96 wells UIP400MTP, maakt ultrasone behandeling versnelde proteomica met hoge verwerkingscapaciteit mogelijk. Deze technologieën stroomlijnen workflows, verkorten de monstervoorbereidingstijd en verhogen de efficiëntie zonder de reproduceerbaarheid of gegevenskwaliteit aan te tasten.

De rol van ultrasone energie bij eiwitdigestie

Ultrasone behandeling gebruikt gerichte ultrasone golven om cavitatie te creëren – plaatselijke microbelletjes die imploderen en daarbij intense afschuifkrachten opwekken. Dit verschijnsel verbetert de massaoverdracht, bevordert het mengen van enzymen met substraten en ontvouwt eiwitstructuren, waardoor splitsingsplaatsen toegankelijk worden voor proteolytische enzymen zoals trypsine.
Het resultaat? Een aanzienlijke verkorting van de digestietijd zonder de efficiëntie of reproduceerbaarheid aan te tasten.

Ultrasoon versterkte proteolytische digestie: methodologie en resultaten

Protocol voor versnelde digestie

Ultrasoon ondersteunde digestie combineert proteolytische enzymen en ultrasone energie om workflows te versnellen. Bij gebruik van de Hielscher UP200St-CupHorn (200 W, 26 kHz) verloopt de digestieworkflow bijvoorbeeld als volgt:

1. Reductie: eiwitmonsters (0,5 mg/mL, 20 µL) worden behandeld met DTT (2 µL, 110 mM) in ammoniumbicarbonaatbuffer (12,5 mM). Sonicatie wordt gedurende 5 minuten toegepast bij 50% amplitude.
2. Alkylering: na toevoeging van IAA (2 µL, 400 mM) wordt de sonicatie onder dezelfde omstandigheden herhaald.
3. Digestie: monsters worden verdund en geïncubeerd met nanodeeltjes met geïmmobiliseerde trypsine. Een laatste sonicatieronde (5 minuten) voltooit de digestie. Peptiden worden gescheiden, gedroogd en opgeslagen voor analyse met MS.

Deze ultrasone methode verkort de totale voorbereidingstijd van 12 uur tot minder dan 30 minuten. Ondanks het versnelde proces blijven de peptideopbrengst en -kwaliteit vergelijkbaar met die van traditionele methoden die een nacht duren.

Efficiëntie van ultrasone eiwitdigestie

In vergelijkende onderzoeken met proteomen van E. coli:

• Eiwitidentificatie: Met ultrasoon gedigesteerde monsters werden in 5 minuten 777 eiwitten geïdentificeerd, tegenover 817 in 12 uur. De overlap in eiwitidentificaties bedroeg meer dan 70%.
• Reproduceerbaarheid: Herhaalde analyses lieten binnen elke methode correlatiewaarden boven 98% zien, wat de betrouwbaarheid aantoont.
• Selectiviteit: Elke methode digesteerde bepaalde eiwitten bij voorkeur: ultrasone digestie gaf de voorkeur aan 65 eiwitten en digestie gedurende een nacht aan 54 eiwitten. Dergelijke subtiele verschillen onderstrepen het unieke potentieel van ultrasone behandeling voor specifieke toepassingen.

Resultaten van labelvrije eiwitkwantificatie van zeven eiwitten die aan een monster van E. coli
zijn toegevoegd. De volgende eiwitten werden op twee verschillende niveaus toegevoegd, zoals vermeld in de kolom
met de naam “Theo Ratio”. Theo Ratio is de theoretische verhouding tussen de twee niveaus die in dit
experiment werden gebruikt. Runderserumalbumine (ALBU), β-lactoglobuline (LACB), α-S1-caseïne (CASA1),
α-S2-caseïne (CASA2), cytochroom c (CYC), ovalbumine (OVAL) en koolzuuranhydrase 2
(CAH2). De verhoudingen werden berekend met LFQ-eiwitintensiteiten die werden verkregen door analyse met MaxQuant.
De t-toets van Student werd toegepast om de met elke methode verkregen waarden te vergelijken (p>0,01, n=3, t-theoretical=4,6).
Onderzoek en afbeelding: © Martins et al., 2019)

Op nanodeeltjes geïmmobiliseerde trypsine

De combinatie van nanodeeltjes met geïmmobiliseerde trypsine (bijv. T-FMNPs) met ultrasone behandeling verbetert proteomische workflows verder. Deze nanodeeltjes bieden een groot oppervlak voor interacties tussen enzymen en substraten, waardoor de efficiëntie toeneemt. Bij toepassing op complexe proteomen, zoals die van E. coli, bereikt de gecombineerde methode:

• Snelheid: Volledige digestie binnen 5 minuten.
• Nauwkeurigheid: Eiwitkwantificatie die vergelijkbaar is met traditionele methoden (p > 0,01, n=3).
• Schaalbaarheid: Aanpassing aan multiwellplatforms zoals de UIP400MTP maakt verwerking met hoge verwerkingscapaciteit mogelijk.

Klik hier voor het gedetailleerde protocol met stapsgewijze instructies!
(vgl. Martins et al., 2019)

Proteolytische digestie met hoge snelheid en hoge verwerkingscapaciteit met sonicators van Hielscher

De beste sonicatormodellen voor proteomica

Hielscher Ultrasonics biedt verschillende sonicatormodellen voor de gelijktijdige voorbereiding van meerdere monsters, die workflows met hoge verwerkingscapaciteit ondersteunen. Of u nu werkt met monsterflesjes, reageerbuizen, multiwellplaten (bijv. platen met 6, 24 of 96 wells) of petrischalen – wij bieden u de ideale sonicators voor uw experimenten.

Sonicator voor multiwellplaten UIP400MTP

Voor de ultieme verwerkingscapaciteit biedt de UIP400MTP de mogelijkheid om platen met 96 wells ultrasoon te behandelen. De UIP400MTP is compatibel met elke standaard microplaat, vereist geen dure leveranciersgebonden wegwerpartikelen en geeft u de vrijheid om de beste multiwellplaat voor uw onderzoek te kiezen. Door de energie gelijkmatig over de plaat te verdelen, maakt het apparaat snelle reductie, alkylering en digestie van maximaal 200 complexe proteomen in slechts 1 uur mogelijk. Dit niveau van automatisering en efficiëntie is cruciaal voor proteomica met hoge verwerkingscapaciteit en klinische toepassingen. Lees meer over de sonicator voor multiwellplaten!

VialTweeter

De VialTweeter is afgestemd op laboratoria die gelijktijdige sonicatie van maximaal 10 monsterflesjes of reageerbuizen nodig hebben. De niet-invasieve aanpak elimineert de risico’s op kruisbesmetting en zorgt tegelijkertijd voor reproduceerbare eiwitdigestie. Dit apparaat is ideaal voor onderzoekers die met beperkte monstervolumes of uiteenlopende monstertypen werken.
Lees meer over de sonicator voor meerdere buizen VialTweeter!

Hielscher UP200St-CupHorn

De sonicator CupHorn is een krachtig apparaat dat is ontworpen voor de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters in afgesloten houders. Het zorgt voor een gelijkmatige verdeling van ultrasone energie en nauwkeurige temperatuurregeling. De mogelijkheid om maximaal vijf monsters gelijktijdig te verwerken, gecombineerd met de geschiktheid voor workflows met reductie, alkylering en digestie, maakt de CupHorn tot een betrouwbaar hulpmiddel voor proteomica op basis van MS.
Lees meer over de CupHorn SonoReactor!

Stapsgewijs protocol voor ultrasoon ondersteunde proteolytische digestie met op nanodeeltjes geïmmobiliseerde trypsine

Dit protocol van Martins et al. (2019) is geoptimaliseerd voor snelle eiwitdigestie met ultrasone energie en op nanodeeltjes geïmmobiliseerde trypsine (T-FMNPs). De beschreven stappen zorgen voor efficiënte reductie, alkylering en proteolyse die geschikt zijn voor toepassingen met massaspectrometrie (MS).
Protocolstappen

1. Reductie van disulfidebindingen
   • Voeg 2 µL DTT-oplossing (110 mM) toe aan het eiwitmonster van 20 µL (0,5 mg/mL) in AmBic-buffer.
   • Plaats de monsterbuis in de sonoreactor UP200St-CupHorn.
   • Soniceer het monster gedurende 2,5 minuten bij 50% amplitude (200 W, 26 kHz).
   • Pauzeer kort om afkoeling mogelijk te maken en soniceer vervolgens nog eens 2,5 minuten onder dezelfde omstandigheden.
2. Alkylering van gereduceerde cysteïneresiduen
   • Voeg 2 µL IAA-oplossing (400 mM) toe aan het gereduceerde eiwitmonster.
   • Soniceer gedurende 2,5 minuten bij 50% amplitude om de alkylering te bevorderen.
   • Pauzeer om afkoeling mogelijk te maken en soniceer vervolgens nog eens 2,5 minuten.

   Opmerking: beperk de blootstelling van het gealkyleerde monster aan licht tot een minimum om afbraak van IAA te voorkomen.

3. Monsterverdunning
   • Verdun het gealkyleerde eiwitmonster tot een eindvolume van 100 µL met 25 mM AmBic-buffer die 4% acetonitril (v/v) bevat.
   • Meng grondig door voorzichtig te pipetteren.
4. Proteolytische digestie met op nanodeeltjes geïmmobiliseerde trypsine
   • Voeg 20 µL T-FMNP-oplossing (3 mg/mL) toe aan het verdunde eiwitmonster.
   • Soniceer het mengsel in de sonoreactor gedurende 2,5 minuten bij 50% amplitude.
   • Pauzeer om afkoeling mogelijk te maken en soniceer vervolgens nog eens 2,5 minuten onder dezelfde omstandigheden.
5. Scheiding van nanodeeltjes met trypsine
   • Gebruik een magneet om de T-FMNPs te scheiden van het supernatant met de door digestie verkregen peptiden.
   • Breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
6. Voorbereiding van peptiden voor analyse met MS
   • Droog het supernatant met de peptiden in een vacuümcentrifuge.
   • Bewaar de gedroogde peptiden bij -20°C tot verdere analyse met massaspectrometrie.