고순도 스키조필란 베타글루칸의 초음파 생산

스키조필란은 면역 조절 특성이 있는 진균 유래 β-글루칸이다. 높은 약리 활성을 나타내려면 스키조필란은 분자량이 낮아야 하며, 이를 통해 향상된 생체이용률을 나타낼 수 있다. 초음파 처리는 스키조필란의 분자량을 감소시키는 것으로 입증되었다. 신뢰할 수 있고 효과적인 방법인 초음파 처리는 저분자량 스키조필란 생산에 쉽게 적용할 수 있다.

치마버섯속 버섯과 초음파 베타글루칸 추출

치마버섯속(Schizophyllum) 버섯 종은 자연에서 우기가 지난 후 썩어가는 나무에서 자란다. 자실체는 이어지는 건기에 채집한다. 치마버섯속 종은 글루칸과 같은 생화학적 화합물이 풍부하므로 특히 열대 국가에서 식품과 약재로 소비된다. 치마버섯(Schizophyllum commune)은 면역 조절, 항진균, 항종양 및 항바이러스 특성으로 인해 생명공학 기업과 제약 기업의 관심을 끌고 있다.
시조피란, 소니필란 또는 시조필란으로도 알려진 다당류 스키조필란은 치마버섯속 버섯에서 발견되는 주요 β-글루칸이며, 이 버섯은 효능이 매우 높은 생리활성 β-글루칸인 스키조필란을 제공한다.
치마버섯은 자연에서 나무 위에 자라며, 균사체는 발효 배양액에서도 배양할 수 있다. 의약품 및 화장품 용도에서는 저분자량 스키조필란이 고분자량 스키조필란보다 훨씬 더 효과적이다. 이는 저분자량 스키조필란이 유의하게 더 높은 생체이용률과 흡수율을 나타내기 때문이다. 또한 고분자량 스키조필란은 수용액의 점도를 높이므로 응용 시 문제가 되는 경우가 많다.
초음파에 의한 크기 감소는 스키조필란의 분자량을 낮추고 이를 통해 β-글루칸 분자의 품질을 높이는 매우 효과적이고 신뢰할 수 있는 기술이다.

저분자량 스키조필란 생산 프로토콜

저분자량 스키조필란은 생체이용률과 응용 특성이 현저히 더 우수하므로, Smirnou 연구팀은 β-글루칸 분자인 스키조필란의 절단과 크기 감소를 위한 초음파 처리를 연구하였다.

스키조필란의 초음파 처리

β-1.3(1.6)-글루칸 스키조필란(SPG)은 자당을 기질로 사용하여 생물반응기에서 S. commune 진균을 액중 배양하여 생산하였다.
배양이 끝난 후 배양액을 탈염수로 희석하여 스키조필란 농도를 2 g/L로 조정한 다음, 초음파 처리 장치 UIP2000hdT (Hielscher Ultrasonics GmbH, 독일)를 사용하여 다음 매개변수와 조건에서 재순환 모드로 초음파 처리하였다: 배지 유량 50 mL/s, 주파수 20 kHz, 출력 2000 W, 소노트로드 유형 BS2d22, 부스터 유형 B2-1.4 및 진폭 100%. 초음파 처리 시작 시 배양액 온도는 25°C였다. 초음파 처리한 배양액(비에너지 투입량 100 Ws/mL)을 40°C에서 1.5 bar의 압력으로 Seitz HS800 심층 필터를 통해 여과하였다. 화학적 특성 분석을 위한 초음파 처리 스키조필란(uSPG)은 실험실 온도에서 여액에 세 배 양의 이소프로필알코올을 첨가하여 침전시킨 후, 60°C에서 12h 동안 건조하였다. 면역학적 연구를 위한 uSPG 용액은 다음과 같이 준비하였다: (1) 초음파 처리한 배양액의 여액을 0.8 bar에서 0.1m2 Pall Centramate T-series PES 카세트(분획분자량 100 kDa)를 통해 정용여과하고, 잔류액의 전도도가 20 μS/cm가 될 때까지 정용여과를 계속하였다; (2) 용액을 정용여과하여 uSPG 농도가 1 g/L가 되도록 농축하고 120°C/20 min 조건에서 고압증기멸균하였다. 변성 uSPG는 유사한 방식으로 준비하되, 배양액 여액에 NaOH를 0.2 M 농도로 첨가하고 알칼리화한 용액을 정용여과 전에 실험실 온도에서 30 min 동안 정치하였다.

분석 방법

균사체 수율은 중량법으로 추정하였다. 배양액을 물로 1:4로 희석한 후 25°C에서 10,000 × g로 20 min 동안 원심분리하고, 침전물을 세 배 양의 물로 세척한 다음 60°C에서 건조하고 무게를 측정하였다. 상등액에 세 배 양의 이소프로필 알코올을 첨가하여 스키조필란을 침전시키고, 60°C에서 24h 동안 건조한 후 중량법으로 수율을 측정하였다. 배양액의 pO2는 광학 프로브 Hamilton-Visiferm DO 120(Hamilton, 스위스)으로 측정하였다.
배양액의 점성계수는 HAAKE Visco Tester 6L에 스핀들 1L 및 2L을 장착하여 4°C, 회전 속도 30 rpm에서 측정하였다. 여과 속도는 1.5 bar의 압력과 40°C에서 배양액 500 mL를 200 × 200 mm Seitz HS800(Pall, 미국) 심층 필터로 여과하는 데 걸린 시간으로 계산하였다.
uSPG의 분자량은 PL aquagel OH60 및 PL aquagel OH40 컬럼을 직렬로 연결한 HPLC 시스템 Alliance(Waters)에서 SEC-MALLS로 측정하였으며, 검출기 miniDAWN TREOS(Wyatt)는 정용여과로 uSPG 농도 1 g/L까지 농축하고 120°C/20 min 조건에서 고압증기멸균하였다. 변성 uSPG도 유사한 방식으로 제조하였으나, 배양액 여과액에 NaOH를 0.2 M 농도로 첨가하고 알칼리화된 용액을 실험실 온도에서 30 min 동안 유지한 후 정용여과하였다.

결과:
SPG의 후속 공정을 용이하게 하기 위해 균사체가 포함된 S. commune의 144시간 배양액에 초음파 처리를 직접 적용하였다.
 
초음파 처리된 스키조필란의 특성: 초음파 처리한 스키조필란(uSPG)을 배양액 여액에서 알코올로 침전시킨 후 특성을 분석하였다. SEC-MALLS로 추정한 uSPG의 Mw는 약 1 MDa였다. 액체 발효로 얻은 스키조필란의 평균 분자량은 약 5 MDa이며, 고체 배양에서는 최대 10 MDa에 이를 수 있다. 초음파 처리한 스키조필란의 분자량을 처리하지 않은 천연 스키조필란의 분자량과 비교하면, 초음파 처리로 분자량이 5–10배 감소함을 관찰할 수 있다.
초음파 처리한 다당류 uSPG에는 단백질 0.7%w/w와 강열 후 잔류물 1.0%w/w가 포함되어 있었다. uSPG 가수분해물은 99%를 초과하는 비율의 포도당으로 구성되어 있었다. 분석 결과는 초음파 처리가 β-글루칸의 주사슬을 무작위로 절단하고 곁사슬은 온전하게 유지하여 스키조필란의 크기와 분자량을 감소시킴을 나타낸다. 단백질과 내독소가 사실상 없는 uSPG에 대한 면역학적 연구에서는 초음파 처리한 저분자량 스키조필란이 뚜렷한 면역 조절 활성을 보이는 것으로 나타났다.

 
점도 감소: 초음파 처리로 배양액의 점도가 크게 감소하였다. 초음파 처리 중 배양액의 점도는 비선형적으로 변하였다. 초음파 처리 초기에는 점도가 빠르게 감소했으나 이후에는 감소 속도가 느려졌다. 비에너지 투입량 100 Ws/mL는 배양액의 점도를 거의 7배 감소시키기에 충분하였다.

여과 개선: 초음파 처리된 배양액은 고분자 SPG를 함유한 미처리 배양액(비에너지 투입량 0 Ws/mL)보다 필터를 더 빠르게 통과했다. 또한 초음파 처리는 여과 중 제품 손실을 크게 줄였다. 고분자 SPG를 함유한 미처리 배양액(비에너지 투입량 0 Ws/mL)의 여액에는 0.3 ± 0.07 g/L의 SPG가 포함되어 있었으며, 심층 여과 전 SPG 농도는 2 g/L였다. 반면, 100 Ws/mL로 초음파 처리된 배양액의 여액에는 2.2 ± 0.2 g/L 농도의 SPG가 포함되어 있었으며, 이는 제품 손실이 거의 없었음을 의미한다.

결론: 연구팀은 결론에서 초음파 처리가 저분자량 스키조필란 제조에 효율적인 기술이며, 이렇게 제조된 스키조필란은 화장품과 의약품에 사용될 수 있다고 요약한다. 균사체를 포함한 배양액 전체에 초음파 처리를 적용하면 스키조필란 생산에 몇 가지 이점이 있다. 후속 공정 중 제품 손실을 줄이고 한외여과를 효율적으로 활용할 수 있게 하여 고순도 다당류 생산을 가능하게 한다.
또한 연구진은 스키조필란의 초음파 처리가 쉽게 규모를 확대할 수 있음을 확인했다. 파일럿 플랜트용 초음파 파쇄기 UIP2000hdT 한 대는 유동 모드에서 배양액 1 리터를 110 s 만에 처리했다. 초음파 장치를 추가로 순차 연결하면 시스템의 생산성을 쉽게 높일 수 있다.

 
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아래 표는 당사 초음파 장치의 대략적인 처리 용량을 보여줍니다: