キチンからキトサンへの超音波脱アセチル化

キトサンはキチン由来のバイオポリマーで、医薬品、食品、農業、工業の分野で多くの用途があります。キチンからキトサンへの超音波脱アセチル化は処理を大幅に促進し、優れた品質のキトサンを高収率で得られる、効率的で迅速なプロセスを実現します。

超音波によるキトサン製造

キトサンはキチンのN-脱アセチル化によって得られます。従来の脱アセチル化では、キチンをアルカリ水溶液（通常は40–50% (w/w) NaOH）に浸漬します。浸漬工程には100–120ºCの高温が必要で、非常に時間がかかる一方、各浸漬工程で得られるキトサンの収率は低くなります。高出力超音波の適用はキチンの脱アセチル化を大幅に促進し、より低い温度での迅速な処理によって、低分子量キトサンを高収率で得られます。超音波脱アセチル化によって得られる優れた品質のキトサンは、食品や医薬品の成分、肥料、その他多くの工業用途に使用されます。
超音波処理はキチンのアセチル化度（DA）に顕著な変化をもたらし、DA≥90のキチンからDA≤10のキトサンへとアセチル化度を低下させます。
多くの研究が、キチンをキトサンへ変換する超音波脱アセチル化の有効性を確認しています。Weiss J. et al. (2008)は、超音波処理によってキチンからキトサンへの変換が飛躍的に改善されることを見いだしました。キチンの超音波処理は、必要な処理時間を12–24時間から数時間へ短縮し、大幅な時間節約をもたらします。さらに、完全な変換に必要な溶媒量が少なくなるため、使用済みまたは未反応の溶媒、すなわち濃厚NaOHの廃棄・処分に伴う環境負荷が低減されます。

超音波処理はキチンからキトサンへの脱アセチル化を促進します

UIP4000hdT – 出力4kWの超音波システム

キトサンの超音波処理の動作原理

高出力・低周波の超音波処理（∼20–26kHz）は、液体やスラリー中に音響キャビテーションを発生させます。高出力超音波は、溶媒（例：NaOH）が固体キチン粒子を断片化して内部に浸透することで表面積を拡大し、固相と液相の間の物質移動を改善するため、キチンからキトサンへの変換を促進します。さらに、超音波キャビテーションの強いせん断力によってフリーラジカルが生成され、加水分解中の試薬（すなわちNaOH）の反応性が高まります。非加熱処理技術である超音波処理は、熱劣化を防止し、高品質のキトサンを生成します。超音波は、甲殻類からキチンを抽出するのに必要な処理時間を短縮するとともに、従来の処理条件よりも純度の高いキチン（したがって、その後に得られるキトサンも）をもたらします。このため、キチンおよびキトサンの製造において、超音波は製造コストの低減、処理時間の短縮、製造工程の制御性の向上、および工程廃棄物による環境負荷の低減を可能にする潜在力があります。

超音波によるキトサン製造の利点

キトサン収率の向上
優れた品質
時間の短縮
処理温度の低下
効率の向上
容易で安全な操作
環境に優しい

キチンからキトサンへの超音波脱アセチル化 – 手順

1) キチンの調製：
カニの殻を原料として使用する場合、可溶性の有機物や、土壌・タンパク質を含む付着した不純物を除去するため、殻を十分に洗浄する必要があります。その後、殻の原料を完全に乾燥させなければなりません（例：オーブン内で60ºC、24h）。乾燥した殻を粉砕し（例：ハンマーミルを使用）、アルカリ性媒体中で脱タンパク処理し（例：濃度0.125–5.0 MのNaOH）、酸で脱ミネラル処理します（例：希塩酸）。
2) 超音波脱アセチル化
典型的な超音波脱アセチル化反応を行うには、β-キチン粒子（0.125 mm < d < 0.250 mm）を40% (w/w) NaOH水溶液に、β-キチン/NaOH水溶液の比率が1/10(g mL^-1)となるように懸濁し、この懸濁液を二重壁ガラスビーカーに移して、Hielscher UP400St 超音波ホモジナイザーを用いて超音波処理します。キチンの超音波脱アセチル化反応を行う際には、以下のパラメーター（Fiamingo et al. 2016参照）を一定に保ちます：(i) 超音波プローブ（ソノトロードHielscher S24d22D、先端直径 = 22 mm）；(ii) 超音波処理のパルスモード（IP = 0.5sec）；(iii) 超音波表面強度
(I = 52.6 W cm^-2)、(iv) 反応温度（60ºC ±1ºC）、(v) 反応時間（50 min）、(vi) β-キチン重量/40% (w/w)水酸化ナトリウム水溶液体積の比率（BCHt/NaOH = 1/10 g mL^-1)；(vii) β-キチン懸濁液の体積（50mL）。
最初の反応は、一定の磁気撹拌下で50min進行させた後、懸濁液を0ºCまで急冷することで停止します。その後、希塩酸を加えてpH 8.5に調整し、試料CHs1をろ過によって分離し、脱イオン水で十分に洗浄して、周囲環境条件下で乾燥させます。CHs1に対して第二段階として同じ超音波脱アセチル化を繰り返すと、試料CHs2が得られます。

a) イカの軟甲、b) 超音波処理したイカの軟甲、c) β-キチン、d) 超音波処理したβ-キチン、e) キトサンの倍率100×の走査電子顕微鏡（SEM）画像（出典：Preto et al. 2017）

Fiamingo et al.は、β-キチンの超音波脱アセチル化によって、添加剤も不活性雰囲気も長い反応時間も必要とせずに、アセチル化度の低い高分子量キトサンを効率的に生成できることを見いだしました。この超音波脱アセチル化反応は、ほとんどの熱化学的脱アセチル化と比べて、より穏やかな条件、すなわち低い反応温度で行われるにもかかわらず。β-キチンの超音波脱アセチル化では、さまざまなアセチル化度（4% ≤ DA ≤ 37%）、高い重量平均分子量（900,000 g mol^-1 ≤ M_w ≤ 1,200,000 g mol^-1 )、および低い分散度（1.3 ≤ Ð ≤ 1.4）を持つ、ランダムに脱アセチル化されたキトサンを、60ºCで三回連続の反応（50 min/段階）を行うことで調製できます。

Hielscher Ultrasonicsは、音響化学用途向けの高性能超音波装置を製造しています。

ラボからパイロットおよび工業規模まで対応する高出力超音波プロセッサー。

キトサン製造用の高性能超音波システム

キチンの断片化とキチンからキトサンへの脱アセチル化には、高い振幅を供給でき、プロセスパラメーターを精密に制御でき、高負荷および過酷な環境下で24時間・週7日運転できる、強力で信頼性の高い超音波装置が必要です。Hielscher Ultrasonicsの製品ラインアップは、お客様とそのプロセス要件に対応します。Hielscherの超音波装置は高性能システムであり、プロセスのニーズに最適に適合させるため、ソノトロード、ブースター、リアクター、フローセルなどの付属品を装備できます。
デジタルカラーディスプレイ、超音波処理運転を事前設定するオプション、内蔵SDカードへの自動データ記録、ブラウザーによる遠隔制御、およびその他多くの機能により、最高水準のプロセス制御と使いやすさを確保します。堅牢性と高い耐負荷能力を兼ね備えたHielscherの超音波システムは、製造現場で頼りになる働き手です。
キチンの断片化と脱アセチル化では、目標とする変換と高品質の最終キトサン製品を得るために、強力な超音波が必要です。特にキチンフレークの断片化には、高い振幅と高圧が極めて重要です。Hielscher Ultrasonicsの工業用超音波プロセッサーは、非常に高い振幅を容易に供給できます。最大200µmの振幅で、24時間・週7日の連続運転が可能です。さらに高い振幅には、特注の超音波ソノトロードを利用できます。Hielscherの超音波システムの出力能力は、安全で使いやすいプロセスでの効率的かつ迅速な脱アセチル化を可能にします。

以下の表は、当社の超音波装置のおおよその処理能力を示しています：

バッチ容量	流量	推奨装置
1–500mL	10–200mL/min	UP100H
10–2000mL	20–400mL/min	UP200Ht, UP400St
0.1–20L	0.2–4L/min	UIP2000hdT
10–100L	2–10L/min	UIP4000hdT
n.a.	10–100L/min	UIP16000
n.a.	より大きな流量	クラスター構成の UIP16000

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文献・参考資料

Butnaru E., Stoleru E., Brebu M.A., Darie-Nita R.N., Bargan A., Vasile C. (2019): 食品保存のために乳化法で調製したキトサンベースのバイオナノコンポジットフィルム。Materials 2019, 12(3), 373.
Fiamingo A., de Moura Delezuk J.A., Trombotto St. David L., Campana-Filho S.P. (2016): β-キチンの多段階超音波支援脱アセチル化によって得られる高度に脱アセチル化された高分子量キトサン. Ultrasonics Sonochemistry 32, 2016. 79–85.
Kjartansson, G., Wu, T., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): 音響化学支援によるキチンからキトサンへの変換、USDA National Research Initiative Principal Investigators Meeting, New Orleans, LA, June 28th.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K. Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): 高強度超音波を前処理として用いたキチンからキトサンへの脱アセチル化における温度の影響、Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-18.
Kjartansson, G., Kristbergsson, K., Zivanovic, S., Weiss, J. (2008): キチンからキトサンへの変換を加速する高強度超音波の影響、Annual Meeting of the Institute of Food Technologists, New Orleans, LA, June 30th, 95-17.
Preto M.F., Campana-Filho S.P., Fiamingo A., Cosentino I.C., Tessari-Zampieri M.C., Abessa D.M.S., Romero A.F., Bordon I.C. (2017): 船舶用ディーゼル油のバイオ吸着材としての可能性を持つイカの軟甲とその誘導体。Environmental Science and Pollution Research (2017) 24:22,932–22,939.
Wijesena R.N., Tissera N., Kannangara Y.Y., Lin Y., Amaratunga G.A.J., de Silva K.M.N. (2015): キトサンナノ粒子およびナノファイバーをトップダウン方式で調製する方法. Carbohydrate Polymers 117, 2015. 731–738.
Wu, T., Zivanovic, S., Hayes, D.G., Weiss, J. (2008). 高強度超音波によるキトサン分子量の効率的な低減：基礎となる機構と処理パラメーターの影響。Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(13):5112-5119.
Yadav M.; Goswami P.; Paritosh K.; Kumar M.; Pareek N.; Vivekanand V. (2019): 水産廃棄物：商業的に利用可能なキチン/キトサン材料を調製するための原料。 Bioresources and Bioprocessing 6/8, 2019.

知っておきたい基礎知識

キチンの超音波脱アセチル化はどのように作用するのでしょうか？

高出力・低周波の超音波（例：20–26kHz）を液体やスラリーに結合させると、高圧/低圧の交互のサイクルが液体に作用し、圧縮と希薄化を生じさせます。この高圧/低圧の交互のサイクルの間に小さな真空気泡が生成され、複数の圧力サイクルにわたって成長します。真空気泡がそれ以上のエネルギーを吸収できなくなると、激しく崩壊します。この気泡の内破時には、局所的に極めて強烈な条件が発生します。最大5000Kの高温、最大2000atmの圧力、非常に高い加熱/冷却速度、および圧力差が生じます。気泡の崩壊は物質移動や熱移動より速いため、崩壊する空洞内のエネルギーは、「ホットスポット」とも呼ばれる非常に小さな領域に閉じ込められます。キャビテーション気泡の内破は、微小乱流、最大280m/sの速度の液体ジェット、およびそれに伴うせん断力も生じさせます。この現象は、超音波キャビテーションまたは音響キャビテーションとして知られています。
超音波処理された液体中の液滴や粒子には、これらのキャビテーション力が衝撃を与えます。加速された粒子が互いに衝突すると、粒子間衝突によって砕かれます。音響キャビテーションは、超音波粉砕、分散、乳化、および音響化学の動作原理です。
キチンの脱アセチル化では、高強度超音波が表面を活性化し、粒子と試薬の間の物質移動を促進することで、表面積を増大させます。

キトサン

キトサンは、修飾されたカチオン性の無毒な炭水化物ポリマーで、主成分であるβ-(1,4) glucosamine単位（>80%）とN-アセチルグルコサミン単位（<20%）が鎖に沿ってランダムに分布した、複雑な化学構造を持ちます。キトサンは、化学的または酵素的な脱アセチル化によってキチンから得られます。脱アセチル化度（DA）は構造内の遊離アミノ基の含有量を決定し、キチンとキトサンを区別するために用いられます。キトサンは希酢酸などの穏やかな溶媒に良好な溶解性を示し、活性部位として複数の遊離アミノ基を備えています。このため、多くの化学反応においてキトサンはキチンより有利です。
キトサンは、優れた生体適合性と生分解性、無毒性、良好な抗菌活性（細菌および真菌に対して）、酸素不透過性、およびフィルム形成特性によって評価されています。キチンと比較して、キトサンは水溶性であるという利点があり、そのため取り扱いや製剤への利用がより容易です。
キチンはセルロースに次いで二番目に豊富な多糖類であり、非常に豊富に存在するため、安価で持続可能な原料となります。

キトサンの製造

キトサンは二段階の工程で製造されます。第一段階では、甲殻類の殻（すなわちエビ、カニ、ロブスター）などの原料を脱タンパク処理、脱ミネラル処理、精製してキチンを得ます。第二段階では、キチンを強塩基（例：NaOH）で処理し、アセチル側鎖を除去してキトサンを得ます。従来のキトサン製造工程は、非常に時間がかかり、コストも高いことが知られています。

キチン

キチン (C₈H₁₃O₅N)_n はβ-1,4-N-acetylglucosamineの直鎖状ポリマーで、α-、β-、γ-キチンに分類されます。グルコースの誘導体であるキチンは、甲殻類や昆虫などの節足動物の外骨格、軟体動物の歯舌、頭足類のくちばし、魚類や現生両生類の鱗の主成分であり、真菌の細胞壁にも存在します。キチンの構造はセルロースに類似しており、結晶性ナノフィブリルやウィスカーを形成します。セルロースは世界で最も豊富な多糖類で、キチンはそれに次いで二番目に豊富な多糖類です。

グルコサミン

グルコサミン (C₆H₁₃NO₅) はアミノ糖であり、糖鎖修飾されたタンパク質や脂質の生化学的合成における重要な前駆体です。グルコサミンは自然界に豊富に存在する化合物で、多糖類であるキトサンとキチンの両方の構造の一部を構成しているため、最も豊富な単糖類の一つとなっています。市販のグルコサミンの大部分は、甲殻類の外骨格、すなわちカニやロブスターの殻の加水分解によって製造されます。
グルコサミンは主に栄養補助食品として使用され、硫酸グルコサミン、塩酸グルコサミン、またはN-アセチルグルコサミンの形で用いられます。硫酸グルコサミンのサプリメントは、軟骨の炎症、分解、最終的な消失によって引き起こされる痛みを伴う状態（変形性関節症）を治療するために経口投与されます。