キノコからのキチン・キトサン生産

超音波処理は、キノコなどの菌類からキチンやキトサンを放出させるための非常に効率的な方法である。高品質なバイオポリマーを得るためには、キチンやキトサンを下流工程で解重合・脱アセチル化する必要がある。超音波アシストによる解重合・脱アセチル化は、非常に効率的で、簡便かつ迅速な技術であり、その結果、高分子量でバイオアベイラビリティに優れた高品質のキトサンが得られる。

超音波処理によるキノコ由来のキチンおよびキトサン

食用および薬用のキノコとしては、Lentinus edodes（シイタケ）、Ganoderma lucidum（霊芝）、Inonotus obliquus（チャーガ）、Agaricus bisporus（ボタンタケ）、Hericium erinaceus（ライオンズたてがみ）、Cordyceps sinensis（イモムシタケ）などがある、Grifola frondosa (hen-of-the-wood), Trametes versicolor (Coriolus versicolor, Polyporus versicolor, turkeytail)、その他多くの菌類が、食品として、また生理活性化合物の抽出に広く利用されている。これらのキノコや加工残渣（キノコ廃棄物）は、キトサンの生産に利用できる。超音波処理は、真菌の細胞壁構造からのキチンの遊離を促進するだけでなく、超音波アシストによる解重合と脱アセチル化によって、キチンを貴重なキトサンに変換する。

キチンのキトサンへの解重合と脱アセチル化は超音波処理によって促進される

プローブ型超音波装置を用いた強力な超音波照射は、キチンの解重合と脱アセチル化を促進し、キトサンの生成につながる技術である。キチンは、甲殻類や昆虫の外骨格、ある種の菌類の細胞壁などに見られる天然由来の多糖類である。キトサンは、キチン分子からアセチル基を除去することにより、キチンから誘導される。

真菌キチンからキトサンへの超音波変換手順

キチンからキトサンを製造するために高強度超音波処理を適用する場合、キチン懸濁液は、通常20kHzから30kHzの範囲の高強度低周波超音波で超音波処理される。この工程では、激しい音響キャビテーションが発生する。キャビテーションとは、液体中の微細な真空気泡の形成、成長、崩壊を指す。キャビテーションは、キャビテーション気泡を取り囲む液体中に、局所的な高せん断力、高温（数千℃まで）、高圧（数百気圧まで）を発生させる。これらの極限状態は、キチン・ポリマーの分解とそれに続く脱アセチル化に寄与する。
 

a)L.vellereusのキチン、b)P.ribisのキチン、c)L.vellereusのキトサン、d)P.ribisのキトサン。
写真と研究：© Erdoğan et al, 2017

キチンの超音波解重合

キチンの解重合は、マイクロストリーミングや液体ジェットなどの機械的な力と、キャビテーション中に生成されるフリーラジカルやその他の反応性種によって誘発される超音波開始化学反応との複合効果によって起こる。キャビテーション中に発生する高圧波により、キチン鎖はせん断応力を受け、その結果、ポリマーはより小さな断片に分裂する。

キチンの超音波脱アセチル化

脱重合に加えて、強い超音波処理もキチンの脱アセチル化を促進する。脱アセチル化では、キチン分子からアセチル基が除去され、キトサンが形成される。強力な超音波エネルギー、特にキャビテーション中に発生する高温高圧は、脱アセチル化反応を促進する。キャビテーションによって生じる反応条件により、キチンのアセチル結合が切断され、酢酸が放出され、キチンがキトサンに変換される。
全体として、強力な超音波照射は、キチンポリマーを分解し、キトサンへの変換を促進するために必要な機械的および化学的エネルギーを提供することにより、解重合および脱アセチル化プロセスの両方を強化する。この技術は、キチンからキトサンを製造するための迅速で効率的な方法を提供し、医薬品、農業、生物医学工学を含む様々な産業で数多くの応用が可能である。

パワー超音波によるキノコからの工業用キトサン製造

商業的なキチンおよびキトサンの生産は、主に海洋産業（漁業、貝類採取など）の廃棄物に基づいている。原料の供給源が異なれば、キチンやキトサンの品質も異なり、季節的な漁獲量の変動により生産量や品質が変動する。さらに、真菌由来のキトサンは、海洋由来のキトサンと比較して、均質なポリマー長や高い溶解性などの優れた特性を有すると報告されている。(Ghormade et al., 2017参照）均一なキトサンを供給するために、真菌種からのキチンの抽出は安定した代替生産となっている。真菌からのキチンおよびシチオサン生産は、超音波抽出および脱アセチル化技術を用いることで、容易かつ確実に達成できる。強力な超音波処理により細胞構造を破壊してキチンを遊離させ、水性溶媒中での物質移動を促進することで、優れたキチン収率と抽出効率を実現する。その後の超音波脱アセチル化により、キチンは貴重なキトサンに変換される。超音波キチン抽出とキトサンへの脱アセチル化の両方は、あらゆる商業生産レベルまでリニアにスケールアップすることができる。

ソニケーションは真菌キトサンの生産を強化し、生産をより効率的かつ経済的にする。
(写真と研究：© Zhu et al, 2019）

超音波によるキチン・キトサンの脱アセチル化に関する研究成果

Zhuら（2018）は彼らの研究で、超音波脱アセチル化が決定的なブレークスルーであることが証明され、反応温度を下げて83～94％の脱アセチル化率でβ-キチンをキトサンに変換したと結論付けている。左の写真は、超音波脱アセチル化キトサンのSEM像である（90 W、15分、20 w/v% NaOH、1:15（g:mL））。 (写真と研究：© Zhu et al.）
彼らのプロトコールでは、NaOHフレークを純水に溶解してNaOH溶液（20 w/v %）を調製した。このアルカリ溶液をGLSP沈殿物（0.5 g）に固液比1:20（g: mL）で遠沈管に加えた。キトサンをNaCl（40 mL、0.2 M）と酢酸（0.1 M）に1:1の溶液量比で加えた。次に、この懸濁液を、プローブ型超音波発生装置（250W、20kHz）を用いて、25℃の温和な温度で60分間超音波にかけた。(cf Zhu et al., 2018)
 
Panditら（2021）は、キトサン溶液の分解速度は、ポリマーを可溶化するために利用した酸の濃度にはほとんど影響されず、ポリマーを溶解するために使用した媒体の温度、超音波の強度、イオン強度に大きく依存することを見出した。(Panditら、2021参照）。
 
別の研究で、Zhuら（2019）は、真菌原料として霊芝胞子粉末を用い、超音波支援脱アセチル化と、超音波処理時間、固液比、NaOH濃度、照射パワーなどの処理パラメーターがキトサンの脱アセチル化度（DD）に及ぼす影響について調べた。最も高いDD値が得られたのは、80Wで20分間の超音波処理、10%(g:ml)のNaOH、1:25(g:ml)の超音波処理であった。超音波処理で得られたキトサンの表面形態、化学基、熱安定性、結晶性をSEM、FTIR、TG、XRDを用いて調べた。その結果、脱アセチル化度（DD）、動的粘度（[η]）、分子量（Mv¯）が大幅に向上した。この結果は、真菌の超音波脱アセチル化技術がキトサンの強力な製造法であり、生物医学的応用に適していることを強調した。(参照：Zhu et al.）

超音波解重合と脱アセチル化による優れたキトサン品質

超音波駆動によるキチン／キトサンの抽出・解重合プロセスは精密に制御可能であり、超音波プロセスパラメーターは原料や目標とする最終製品の品質（分子量、脱アセチル化度など）に合わせて調整することができる。これにより、超音波プロセスを外的要因に適応させ、優れた結果と効率を得るための最適なパラメーターを設定することができる。
超音波で脱アセチル化されたキトサンは、優れたバイオアベイラビリティと生体適合性を示す。超音波で調製されたキトサン生体高分子を、熱で調製されたキトサンと生物医学的特性に関して比較すると、超音波で製造されたキトサンは、繊維芽細胞（L929細胞）の生存率が著しく改善され、大腸菌（E. coli）と黄色ブドウ球菌（S. aureus）の両方に対する抗菌活性が向上した。
(参照：Zhu et al.）
 

a)グラディウス、b)超音波処理グラディウス、c)β-キチン、d)超音波処理β-キチン、e)キトサンの走査型電子顕微鏡（SEM）像（出典：Preto et al.）

キチン・キトサン加工用高性能超音波装置

キチンの断片化やキトサンへの脱セチル化には、高振幅を供給でき、プロセスパラメーターの正確な制御が可能で、高負荷や過酷な環境下でも24時間365日稼働できる、強力で信頼性の高い超音波装置が必要です。Hielscher Ultrasonicsの製品群は、これらの要件を確実に満たします。傑出した超音波性能に加え、Hielscherの超音波装置は高いエネルギー効率を誇り、経済的にも大きな利点があります。 – 特に商業的な大規模生産に採用される場合は。
Hielscher社製超音波発生装置は、お客様のプロセスニーズに最適に対応するため、ソノトロード、ブースター、リアクター、フローセルなどのアクセサリーを装備できる高性能システムです。デジタルカラーディスプレイ、超音波処理のプリセットオプション、内蔵SDカードへの自動データ記録、リモートブラウザコントロール、その他多くの機能を備えたHielscherの超音波発生装置は、最高のプロセスコントロールと使いやすさを保証します。Hielscher社製超音波処理装置は、堅牢性と高い耐荷重性により、生産現場での信頼性の高い作業馬となります。キチンの断片化と脱アセチル化には、目的とする変換と高品質の最終キトサン製品を得るために強力な超音波が必要です。特にキチンフレークの破砕と解重合／脱アセチル化のステップでは、高い振幅と高い圧力が重要です。Hielscher Ultrasonicsの工業用超音波プロセッサーは、非常に高い振幅を容易に実現します。最大200µmの振幅を24時間365日連続運転することができます。さらに高い振幅を得るためには、カスタマイズされた超音波ソノトロードが利用可能です。Hielscher社製超音波システムの出力容量により、安全でユーザーフレンドリーなプロセスで、効率的かつ迅速に解重合と脱アセチル化を行うことができます。
 

超音波処理による相乗的キチン処理の改善

従来の化学的および酵素的キチン脱アセチル化の欠点（すなわち、低い効率、高いエネルギーコスト、長い処理時間、有毒な溶媒）を克服するために、高強度超音波がキチンおよびキトサン処理に統合されてきた。高強度超音波処理とその結果生じる音響キャビテーションの効果は、ポリマー鎖の迅速な切断をもたらし、多分散性を低下させ、キトサンの合成を促進する。さらに、超音波せん断力により溶液中の物質移動が促進され、化学反応、加水分解反応、酵素反応が促進される。超音波キチン処理は、化学的方法、加水分解、酵素的手順などの既存のキチン処理技術と組み合わせることができる。

超音波アシスト化学的脱アセチル化と脱重合

キチンは非反応性で不溶性の生体高分子であるため、可溶性で生物学的に利用可能なキトサンを得るためには、脱灰、脱タンパク質化、脱重合／脱アセチル化という工程を経る必要がある。これらの工程は、HClのような強酸やNaOHやKOHのような強塩基による処理を伴う。これらの従来の工程は非効率的で時間がかかり、高いエネルギーを必要とするため、超音波処理によって工程を強化することで、キトサンの生産が大幅に改善される。パワー超音波の適用により、キトサンの収率と品質が向上し、工程が数日から数時間に短縮され、より穏やかな溶媒が使用できるようになり、工程全体がよりエネルギー効率的になります。

超音波によるキチンの脱タンパク質化の改善

Vallejo-Dominguezら（2021年）は、キチン脱タンパク質化の研究で、以下のことを発見した。 “バイオポリマーの製造に超音波を適用することで、キチン中のタンパク質含量と粒子径が減少した。脱アセチル化度が高く、分子量が中程度のキトサンが超音波の補助によって製造された。”

超音波加水分解によるキチン分解

化学的加水分解では、キチンを脱アセチル化するために酸またはアルカリが使用されるが、アルカリ脱アセチル化（例えば、水酸化ナトリウムNaOH）がより広く使用されている。酸加水分解は従来の化学的脱アセチル化に代わる方法で、有機酸溶液を用いてキチンやキトサンを解重合する。酸加水分解法は、キチンやキトサンの分子量が均一でなければならない場合に主に使用される。この従来の加水分解プロセスは、時間がかかり、エネルギーとコストがかかることで知られている。強酸、高温、高圧を必要とすることが、加水分解キトサンプロセスを非常に高価で時間のかかる手順にしている要因である。使用される酸は、中和や脱塩などの下流工程を必要とする。
高出力超音波を加水分解プロセスに組み込むことで、キチンおよびキトサンの加水分解開裂に必要な温度と圧力を大幅に下げることができる。さらに、超音波処理により、酸濃度を低くしたり、より穏やかな酸を使用したりすることができる。これにより、プロセスはより持続可能で、効率的で、費用対効果が高く、環境に優しいものとなる。

超音波アシスト化学的脱アセチル化

キチンおよびキトサンの化学的分解および脱アクチル化は、主にキチンまたはキトサンを鉱酸（塩酸HClなど）、亜硝酸ナトリウム（NaNO₂)、または過酸化水素(H₂O₂).超音波は脱アセチル化速度を向上させるので、目標とする脱アセチル化度を得るのに必要な反応時間を短縮できる。このことは、超音波処理によって、12～24時間必要な処理時間が数時間に短縮されることを意味する。さらに、超音波処理により、薬液濃度を大幅に下げることができ、例えば、超音波処理では40％(w/w)の水酸化ナトリウムが必要であるのに対し、超音波処理では65％(w/w)が必要である。

超音波-酵素的脱アセチル化

酵素的脱アセチル化は温和で環境に優しい処理形態であるが、その効率とコストは不経済である。最終製品からの酵素の単離と精製が複雑で、労力とコストがかかるため、酵素的キチン脱アセチル化は商業生産には使われず、科学研究室でのみ使用されている。
酵素脱アセチル化前の超音波による前処理は、キチン分子を断片化することで表面積を拡大し、酵素が利用できる表面を増やす。高性能の超音波処理は、酵素的脱アセチル化を改善し、プロセスをより経済的にします。