Ripartizione trifasica potenziata dagli ultrasuoni

• La ripartizione trifasica (TPP) è una tecnica per estrarre, separare e purificare componenti, ad esempio lipidi, enzimi, polisaccaridi e altre biomolecole, da materiale biologico.
• La ripartizione trifasica assistita da ultrasuoni supera la ripartizione trifasica convenzionale grazie a una resa maggiore, una purezza migliore e una velocità eccezionale.
• La ripartizione trifasica a ultrasuoni è applicabile a piccoli e grandi volumi e può essere facilmente portata alla scala di produzione industriale.

Ripartizione trifasica a ultrasuoni

Ripartizione trifasica

La ripartizione trifasica (TPP) è un processo semplice ed efficiente, in un unico passaggio, per la separazione, la purificazione e la concentrazione di biomolecole quali enzimi, lipidi, polisaccaridi ecc. da miscele complesse.
La TPP viene eseguita mediante l’aggiunta sequenziale di una quantità sufficiente di sale (tipicamente solfato di ammonio) e di un solvente organico (principalmente t-butanolo/tert-butanolo). Sali come il solfato di ammonio vengono utilizzati a un determinato livello di saturazione per far precipitare la proteina. Un solvente organico come il t-butanolo viene aggiunto per formare tre strati di fase e rimuovere composti a basso peso molecolare come lipidi, composti fenolici e alcuni detergenti. Poiché il t-butanolo ha un punto di ebollizione elevato, ma è meno infiammabile dell’etanolo e del metanolo, il t-butanolo è il solvente preferito per la TPP.
Dopo il trattamento dell’estratto grezzo e la decantazione, la miscela si separa in tre fasi distinte: la fase superiore del solvente (t-butanolo) contiene composti apolari, separati dalla fase acquosa inferiore (contenente composti polari) da un precipitato proteico all’interfaccia. Le proteine desiderate si ripartiscono selettivamente in una fase e le altre proteine contaminanti nell’altra. Ciò determina una purificazione parziale e una concentrazione della proteina. Il processo di estrazione combina la precipitazione delle proteine per effetti cosmotropici, salting out, cosolvente isotonico ed effetti osmoliti.

Ripartizione trifasica potenziata dagli ultrasuoni

La sonicazione intensifica significativamente il processo di TPP. La ripartizione trifasica assistita da ultrasuoni viene applicata con successo per la separazione e la purificazione delle biomolecole. Un’ampia gamma di biomolecole è stata isolata con maggiore efficienza in tempi più brevi. Ad esempio, enzimi di origine vegetale (come bromelina, papaina, invertasi, polifenolossidasi e inibitori della tripsina), animale (come tripsina, α-chimotripsina, chimosina, pepsina e luciferasi) e microbica (come lipasi, α-amilasi, α-galattosidasi, serratiopeptidasi, ciclodestrina glicosiltransferasi ed enzimi fibrinolitici) sono stati purificati mediante TPP a ultrasuoni. Un ulteriore vantaggio della ripartizione trifasica a ultrasuoni è l’aumento dell’attività di vari enzimi, che si traduce in rese apparentemente maggiori (di circa il 100%), poiché l’enzima o la proteina di interesse precipita nello strato intermedio tra la fase organica e quella acquosa.
La ripartizione trifasica a ultrasuoni può essere utilizzata efficacemente con campioni grezzi e può essere facilmente portata a una scala maggiore.

Esempi di ripartizione trifasica a ultrasuoni (US-TPP)

TPP a ultrasuoni per l’estrazione dell’astaxantina

Per l’estrazione dell’astaxantina (AX), il trattamento combinato di TPP e sonicazione con il sonicatore Hielscher UP400S è una tecnica non solo semplice e facilmente applicabile, ma anche molto efficiente per isolare l’AX dalla biomassa batterica di Paracoccus NBRC 101723. Le variabili operative della sonicazione possono essere ottimizzate per ottenere risultati di estrazione ottimali. I parametri di trattamento a ultrasuoni, quali ampiezza, tempo, temperatura e recipiente di estrazione (dimensioni, forma), nonché la dimensione delle particelle della biomassa, influiscono significativamente sul rilascio dell’AX dalla biomassa mediante ultrasuoni. La sonicazione della biomassa umida offre risultati migliori rispetto alla TPP a ultrasuoni della biomassa essiccata per un’estrazione rapida ed efficiente dell’AX. La TPP a ultrasuoni consente un recupero dell’AX superiore del 37% rispetto all’estrazione convenzionale con solvente. (cfr. Chougle et al. 2013)

TPP a ultrasuoni per la separazione dell’andrografolide da Andrographis paniculata

L’andrografolide è un diterpenoide labdanico apprezzato per i suoi marcati effetti antinfiammatori, antiossidanti, epatoprotettivi, antitumorali e antidiabetici. Studi comparativi mostrano che la TPP a ultrasuoni non solo aumenta la resa dell’andrografolide, ma migliora anche l’attività antiossidante rispetto alla TPP convenzionale.

Sonicatori ad alte prestazioni per la ripartizione trifasica

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Bibliografia/Riferimenti

• Chougle, J.A: et al. (2013): Ripartizione trifasica assistita da ultrasuoni (UATPP): una nuova tecnica sviluppata per l’estrazione dell’astaxantina da Paracoccus NBRC 101723. CSBE/SCGAB 2013 – Annual Conference University of Saskatchewan, Saskatoon, 7–10 luglio 2013.
• Ketnawa, S. et al (2017): Ripartizione tra fasi per la separazione degli enzimi: panoramica e applicazioni recenti. International Food Research Journal 24(1), 2017. 1–24.
• Varakumar, S. et al. (2017): Estrazione potenziata dell’oleoresina dalla polvere di rizoma di zenzero (Zingiber officinale) mediante ripartizione trifasica assistita da enzimi. Food Chemistry 216, 2017. 27–36.
• Yan J.-K. et al. (2018): Ultrasuoni in sinergia con la ripartizione trifasica per l’estrazione e la separazione dei polisaccaridi di Corbicula fluminea e possibili meccanismi coinvolti. Ultrasonics Sonochemistry Vol. 40, Parte A, 2018. 128–134.