Idratazione del film sottile assistita da ultrasuoni per la preparazione di liposomi

I liposomi sono vescicole sferiche composte da uno o più doppi strati fosfolipidici che racchiudono un nucleo acquoso. Grazie alla loro capacità di incapsulare composti idrofili, lipofili e anfifili, i liposomi sono ampiamente utilizzati in applicazioni farmaceutiche, nutraceutiche, cosmetiche e alimentari. La loro biodegradabilità, biocompatibilità e natura non immunogenica li rendono sistemi di veicolazione particolarmente interessanti.
Tra i vari metodi di produzione dei liposomi, l’idratazione del film sottile (TFH) rimane una delle tecniche più consolidate e versatili. Combinato con una sonicazione controllata, questo metodo consente di produrre liposomi di dimensioni nanometriche con una migliore omogeneità, efficienza di incapsulamento e stabilità.

Ruolo degli ultrasuoni nell’idratazione del film sottile

L’idratazione del film sottile produce inizialmente soprattutto vescicole multilamellari (MLV) con diametri relativamente grandi e ampie distribuzioni dimensionali. A causa delle loro dimensioni, queste vescicole presentano un assorbimento cellulare limitato e una biodisponibilità ridotta, in particolare nelle applicazioni che richiedono un’interazione efficiente con le membrane o la penetrazione nei tessuti. Pertanto, la sonicazione a sonda viene applicata come fase controllata di riduzione dimensionale per convertire le MLV in piccoli liposomi unilamellari o di dimensioni nanometriche con un indice di polidispersità più basso. I nanoliposomi le cui dimensioni sono state ridotte mediante ultrasuoni offrono un rapporto superficie/volume sostanzialmente più elevato, una migliore stabilità colloidale e una maggiore internalizzazione cellulare, con conseguente miglioramento della biodisponibilità e delle prestazioni di veicolazione.

1. Meccanismo d’azione
   Gli ultrasuoni ad alta intensità generano cavitazione acustica – formazione e collasso di bolle microscopiche – producendo forze di taglio localizzate, microcorrenti e gradienti transitori di pressione elevati.

   Questi effetti determinano:

   • Disgregazione delle grandi vescicole multilamellari
   • Frammentazione e riorganizzazione del doppio strato
   • Formazione di piccole vescicole unilamellari (SUV)
   • Distribuzione dimensionale delle particelle più stretta

   Nei sistemi nanoliposomiali preparati mediante film sottile + dispersione a ultrasuoni, si ottengono in modo affidabile diametri medi delle particelle dell’ordine di ~80 nm con una bassa polidispersità.

2. Vantaggi del processo
   La TFH assistita da ultrasuoni offre:
   • Dimensioni ridotte delle particelle (intervallo nanometrico)
   • Indice di polidispersità (PDI) più basso
   • Maggiore efficienza di incapsulamento
   • Migliore stabilità colloidale
   • Maggiore stabilità termica e ossidativa dei composti incapsulati

   Questi miglioramenti sono fondamentali per stabilizzare composti bioattivi sensibili all’ossidazione, come gli acidi grassi polinsaturi.

Dopo la formazione di un film lipidico e la successiva reidratazione, la sonicazione viene utilizzata per favorire l’intrappolamento dei principi attivi nei liposomi. Inoltre, la sonicazione consente di ottenere le dimensioni desiderate dei liposomi.

Istruzioni generali: preparazione di liposomi mediante idratazione del film sottile assistita da ultrasuoni

1. Materiali e formulazione
   1. Selezionare il fosfolipide (ad es., lecitina / fosfatidilcolina) ed eventualmente il colesterolo.
   2. Scegliere il rapporto tra i lipidi in base alle esigenze di stabilità.

   Un rapporto lecitina/colesterolo di circa 40:20 ha prodotto nanoliposomi stabili con un potenziale zeta elevato e un PDI basso in un sistema destinato ad applicazioni alimentari.

2. Dissoluzione dei lipidi (fase organica)
   1. Sciogliere fosfolipide + colesterolo in un solvente organico volatile (ad es., cloroformio).
   2. Se gli additivi funzionali richiedono un cosolvente, scioglierli separatamente (ad es., in metanolo) e unire le soluzioni.

   Questo approccio è descritto esplicitamente per i liposomi preparati mediante idratazione del film sottile utilizzando cloroformio (lipidi) e metanolo (additivo).

3. Formazione del film sottile
   1. Trasferire la soluzione lipidica in un pallone a fondo tondo.
   2. Rimuovere i solventi mediante evaporazione rotante a temperatura moderata (ad es., 40 °C) sotto pressione ridotta fino alla formazione di un film asciutto e omogeneo.
4. Idratazione del film lipidico
   1. Idratare il film lipidico con una fase acquosa contenente il principio attivo (o con un tampone se si producono liposomi vuoti).
   2. Idratare sotto agitazione e a temperatura elevata (se necessario, al di sopra della temperatura di transizione di fase dei lipidi).

   Esempio tratto da una formulazione biomedica: idratazione con tampone HEPES (pH 7,4) e agitazione a 60°C per 6 h.

5. Riduzione dimensionale mediante ultrasuoni
   Dopo l’idratazione, la dispersione contiene generalmente vescicole multilamellari le cui dimensioni devono essere ridotte.

   Raccomandazioni generali per la fase di sonicazione:

   • Utilizzare la sonicazione a sonda.
   • Applicare la sonicazione pulsata per controllare la temperatura.
   • Mantenere il campione in un bagno di ghiaccio o utilizzare un raffreddamento esterno.

   Esempio di protocollo di sonicazione con il sonicatore Hielscher UP200Ht:
   15 min totali, 10 s ON / 5 s OFF, 100 W, ampiezza del 100%. (cfr. Truszkowska et al., 2025 e Ahmadi et al, 2021)

6. Trattamento successivo facoltativo
   A seconda dell’applicazione:
   • Rimuovere il composto non incapsulato mediante centrifugazione/filtrazione.
   • Lavare e risospendere in tampone fresco.

   Esempio: per la purificazione dei liposomi viene descritta la rimozione del materiale non legato mediante centrifugazione e risospensione.

7. Caratterizzazione
   Gli studi allegati considerano sistematicamente i seguenti parametri come indicatori essenziali di qualità:
   • Dimensioni delle particelle (nm)
   • Indice di polidispersità (PDI)
   • Potenziale zeta
   • Efficienza di incapsulamento
   • Morfologia (TEM/SEM)
   • Stabilità durante la conservazione

   Tra i risultati esemplificativi che dimostrano una buona qualità dei nanoliposomi figurano:
   Dimensioni ≈82 nm, PDI ≈0,06, potenziale zeta ≈−56 mV, efficienza di incapsulamento ≈76,5%.

   Note pratiche
   Il colesterolo migliora la stabilità. Gli studi indicano esplicitamente che l’aggiunta di colesterolo può migliorare la stabilità dei liposomi inibendo la transizione di fase dei fosfolipidi.

Vantaggi dei sistemi a ultrasuoni Hielscher per la produzione di liposomi

Hielscher Ultrasonics offre processori a ultrasuoni avanzati progettati specificamente per la produzione di liposomi su scala di laboratorio, pilota e industriale. Questi sistemi sono particolarmente adatti all’idratazione del film sottile assistita da ultrasuoni, in cui il controllo preciso dell’energia acustica è fondamentale per ottenere dimensioni definite delle particelle, una distribuzione dimensionale stretta e una qualità del prodotto riproducibile.
Su scala di laboratorio, i sonicatori Hielscher offrono un controllo preciso dell’ampiezza, un apporto energetico riproducibile, un funzionamento pulsato programmabile e un monitoraggio integrato della temperatura. Questo livello di controllo garantisce un’intensità di cavitazione costante e dimensioni dei nanoliposomi altamente riproducibili, con un’eccellente uniformità tra i lotti. Questa stabilità del processo è essenziale durante lo sviluppo della formulazione, soprattutto quando si ottimizzano parametri chiave quali il tempo di sonicazione, la potenza acustica, la composizione lipidica e l’efficienza di incapsulamento.

Produzione industriale di liposomi

Per la produzione industriale, i sistemi Hielscher sono progettati per una scalabilità lineare, che consente di trasferire i parametri di processo definiti su scala di laboratorio alle unità pilota e di produzione, mantenendo una densità energetica e condizioni di processo equivalenti. I reattori a ultrasuoni a flusso continuo consentono la produzione di liposomi con un’elevata capacità produttiva, una distribuzione uniforme dell’energia e tempi di trattamento ridotti. I sistemi sono costruiti per un funzionamento affidabile 24/7, con un’elevata efficienza energetica e ridotte esigenze di manutenzione. Inoltre, possono essere integrati in ambienti produttivi conformi alle GMP, compresi sistemi a circuito chiuso, linee di processo automatizzate e installazioni in camere bianche. Queste caratteristiche rendono la tecnologia a ultrasuoni Hielscher adatta alla produzione di liposomi di grado farmaceutico, nutraceutico e alimentare su scala industriale.

L’idratazione del film sottile assistita da ultrasuoni rappresenta un metodo altamente efficiente, controllabile e scalabile per la produzione di nanoliposomi. Le evidenze scientifiche dimostrano che la combinazione di TFH e ultrasuoni migliora significativamente la distribuzione dimensionale delle particelle, l’efficienza di incapsulamento e la stabilità dei composti bioattivi sensibili.
I sonicatori Hielscher offrono:

• Controllo preciso dell’energia
• Risultati riproducibili su scala nanometrica
• Passaggio agevole dalla scala di laboratorio alla produzione industriale
• Capacità di trattamento continuo
• Funzionamento affidabile e compatibile con le GMP

Per i laboratori di ricerca che sviluppano formulazioni liposomiali avanzate e per i produttori industriali che realizzano prodotti farmaceutici o nutraceutici di alto valore, i sistemi a ultrasuoni Hielscher offrono una soluzione tecnicamente superiore ed economicamente scalabile per la preparazione di liposomi mediante idratazione del film sottile assistita da ultrasuoni.

La tabella seguente fornisce un’indicazione della capacità approssimativa di trattamento dei nostri sonicatori:

Confronto con altri metodi di preparazione dei liposomi assistiti da ultrasuoni

Sebbene l’idratazione del film sottile sia ampiamente utilizzata – soprattutto in laboratorio e nella ricerca e sviluppo –, gli ultrasuoni migliorano anche diversi altri metodi di preparazione dei liposomi:

• Evaporazione in fase inversa – Gli ultrasuoni migliorano l’emulsificazione e la formazione delle vescicole.
• Metodi di iniezione dell’etanolo – La sonicazione affina le dimensioni delle particelle e riduce l’aggregazione.
• Dispersione diretta della lecitina – Gli ultrasuoni consentono la rapida formazione di liposomi da sospensioni di fosfolipidi.
• Sonoporazione di liposomi preformati – L’energia acustica aumenta temporaneamente la permeabilità della membrana per il caricamento attivo.
• Riduzione dimensionale dopo la formazione – La sonicazione viene applicata abitualmente per ridurre le vescicole multilamellari a sistemi di dimensioni nanometriche.

Gli ultrasuoni non rappresentano quindi soltanto una fase ausiliaria, ma una tecnologia abilitante centrale nelle diverse strategie di produzione liposomiale.

Progettazione, produzione e consulenza – Sonicatori fabbricati in Germania

I sonicatori Hielscher sono ampiamente riconosciuti per l’elevata qualità, la robustezza costruttiva e gli standard di progettazione avanzati. La loro durata e la facilità d’uso consentono un’integrazione agevole negli impianti di produzione industriale. Anche in condizioni operative gravose e in ambienti impegnativi, i sonicatori Hielscher offrono prestazioni affidabili e risultati costanti.

Hielscher Ultrasonics è un’azienda certificata ISO e attribuisce grande importanza alla produzione di sistemi a ultrasuoni ad alte prestazioni che combinano tecnologie all’avanguardia e praticità d’uso. Tutti i sonicatori Hielscher sono conformi ai requisiti CE e soddisfano inoltre quelli di UL, CSA e RoHS.